转基因动物技术应用研究进展
摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。
关键字：动物转基因技术；应用；展望
Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals
And their Application
Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed.
Key words: animal gene transfer technique; application;prospect
动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。
1 转基因动物技术
1.1 显微注射法
这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。
1.2 逆转录病毒载体导入法
将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的,通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。Haskell等[3]应用该方法制作了转基因牛。
1.3 核移植法
该方法首先将外源基因导入到供体细胞中,选择其中带有外源基因的细胞进行扩增,然后将这种细胞的细胞核导入一个去了核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活将重组胚胎直接或进行体外培养发育到桑葚胚或囊胚后植入同步化的假孕动物的输卵管。1997年世界上第一头体细胞克隆羊“多莉”(DOLIY)在英国罗斯林研究所诞生,就应用了该法。安晓荣等[4]通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊。
1.4 人工酵母染色法
人工酵母染色法(Y AC)是一种新型载体。其容量巨大,有克隆百万对碱基的大片段DNA的能力。此法可保证巨大基因的完整性,保证所有顺式作用因子的完整性和完整的结构基因位置的不变性,因此保证了长片段外源基因的整合率,可消除和减弱基因整合后的位置效应。Fujiwara等建立了210 kb YAC DNA转基因小鼠,在乳腺获得高水平表达人乳白蛋白,而未表现出普通转基因鼠所出现的位置效应。
1.5 性腺转基因方法
早期的动物转基因研究中, 大量应用了利用逆转录病毒介导、显微注射、电穿孔、脂质体介导、精子载体法等方法, 这些方法需要复杂的操作仪器和胚胎体外培养等复杂的实验过程, 同时获得转基因动物的效率很低, 一般不到10%。Kim et al[5]根据精子作为外源基因载体转基因的原理, 及一般细胞都能够吸收外源DNA 的原理, 把外源基因用脂质体转染精原细胞, 再将被转染的精原细胞微注射到精原细胞被破坏的雄性动物的睾丸的曲精细管内, 结果发现小鼠在康复后可以产生携带外源基因的精子。如果利用这样的小鼠对雌鼠交配, 可以预期能够产生含有所转外源基因的转基因小鼠。沈新明等省略了对精原细胞转染外源基因并对曲精细胞移植转染细胞的步骤, 直接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达载体注射到小鼠的曲精细管内, 最后通过与雌鼠交配, 成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。Yuan et al.报道向通过向曲精细管内注射外源DNA, 然后再结合对曲精细管电击或电穿孔处理, 以使外源基因进入睾丸生精细胞。然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配, 得到的小鼠中有一组的阳性检测率达25%。Shen et al.则将处理方法更为简化, 首先直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧光表达的外源DNA 及二甲基亚枫的介质, 使DNA能够进入睾丸细胞和生精细胞。一个月后用处理的雄兔与雌兔交配, 所产生后代的56%仔兔能高效地表达所导入的外源基因。这一转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法
的结果。对应于在雄性动物的向睾丸注射外源基因,Yang et al. [6]直接对小鼠的卵巢注射绿色荧光蛋白基因, 也可以得到转基因小鼠, 并且检测后代的阳性率达54%, 并且发现获得的6 代以内的转基因小鼠都具有较好的遗传稳定性。用同样的方法制作转基因鸡的研究中, 阳性率高达67.65%。由于通过性腺转基因操作简便、技术要求较低、难度较小, 这种方法将成为一个制作转基因动物的方向, 有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。然而该方法制备转基因动物时, 仍然存在外源基因随机整合进入与宿主基因组的问题, 因此目前还无法利用此方法随意地获得理想的转基因动物。
1.6 定点制作转基因动物的方法
由于非定点转基因方法使外源基因随机整合到宿主细胞染色体上, 使得制作转基因动物带有很大的偶然性, 外源基因的表达的可控性也较差。同时由于外源基因随机整合到宿主基因组, 很可能破坏宿主基因的正常表达, 将影响到宿主的发育和存活。因此新的定点整合转基因方法就应运而生了, 一般通称为基因打靶( gene targeting) 。
1.6.1 胚胎干细胞(ES 细胞)基因打靶方法
基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的可对基因组进行定点修饰的实验技术。基因打靶通过外源DNA 与染色体DNA 之间的同源重组、精细地定点修饰和改造基因DNA 片段, 具有位点专一性强和打靶后目的片段可以与染色体DNA 共同稳定遗传的特点。Thomas and Capecch[7]首先对小鼠ES 细胞进行了基因打靶, 然后将此打靶的ES 细胞移植进入小鼠囊胚, 将此重组胚胎移植进入代孕母鼠, 最后产出嵌合体仔鼠,通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。基因打靶包括基因敲除( knock out) 和基因敲入( knock in) 技术。目前利用以上技术已经制备了大量基因敲除小鼠, 在研究基因功能和疾病模型研究方面做出了贡献。相应地, 外源基因也可以通过基因打靶转入小鼠基因组, 并获得了通过基因敲入的转基因小鼠, 实现了外源基因在宿主基因组的定点整合。
1.6.2 对体细胞进行基因打靶
虽然ES 细胞具有全能性, 并且具有无限传代和增殖的能力, 但是由于目前尚未建立起一套有效的完善的适用于任何物种ES 细胞的分离和培养方法, 到目前为止很多物种尚未得到ES 细胞, 而体细胞便于采集、数量巨大, 并可以在体外增殖培养, 所以通过对体细胞进行基因打靶, 使外源性基因定点的整合到体细胞的基因组中, 再结合体细胞克隆来生产转基因动物将是一个不错的选择。McCreath etal.报道了用体细胞核移植生产出了基因打靶绵羊。Lai et al. 和Dai et al. 报道了用基因打靶及克隆的方法制作出了敲除α1,3- 糖苷转移酶的转基因猪, Kuroiwa et al.通过敲除牛朊蛋白( PRNP) 基因制作了无疯牛病的牛, 不会发生乳房炎的
奶牛和能够合成多不饱和脂肪酸的猪也被制备到。体细胞基因打靶结合克隆的方法早就定型, 问题是如何提高体细胞克隆的效率。对此, Kuroiwa etal.通过对基因印记较少和较为年轻化的胎牛成纤维细胞进行基因打靶, 细胞经过克隆后构建重组胚胎并移植到子宫内发育成 2.5 月龄的胎儿, 再将此胎儿流产并再次分离出成纤维细胞, 对此进行重复打靶获得纯合型基因敲除细胞, 然后再进行克隆胚的构建和移植, 重组胚胎移植后怀孕45 d 的受胎率达到45%。此方法大大提高了基因敲除动物的制备效率, 经过5 次移植、流产、胎儿成纤维细胞分离、基因打靶和重构胚胎制备的循环, 在22 个月内生产了按传统方法需要6 年时间才能获得的纯合敲除PRNP 和IGHM 两个基因的牛。一般在体细胞克隆研究中都是制备异体克隆即提供细胞核的供体动物都不同于提供卵母细胞的受体动物。异体克隆胚胎可能由于基因印记可能导致核质相互作用的不协调, 致使目前制备克隆动物的效率都很低。为了解决这一问题, Yang et al.[8]把体细胞核移植入源于同一母牛的去核卵子, 克隆后激活的同体重组胚中基因重排要大大优于异体重组胚; 同体重组胚的囊胚发育率达38.5%, 高于异体胚的22%; 同体重组胚胎移植后克隆动物出生率达23%, 高于异体胚的5.6%。
1.6.3 对原始生殖细胞( PGC) 进行基因打靶
PGC 类似于ES 细胞, 具有发育全能性。PGC介导的转基因技术在原理和方法上与ES 细胞技术相似, 应用PGC 技术在制作转基因家禽方面有特别明显的优势。Brinster and Avarbock尝试了在雄性哺乳动物个体之间转移精原细胞的可行性, 研究者将设计好的Z FlacZ 系供体小鼠的PGC 植入C57BL6×STL 杂交一代小鼠的曲精细管, 经移植后的PGC 能够发育成具有受精能力的精子细胞, 并产生了后代。Mueller et al.报道从转基因猪分离和培养出的PGC 能用于制作嵌合体, 从而证实PGC 具有一定的嵌合能力, 也显示了利用PGC 进行转基因猪或其它大动物的可能性。禽类至今尚未得到ES 细胞, 其卵子和胚胎结构也不允许像哺乳动物那样进行胚胎克隆以生产转基因动物。但目前已经分离培养了多种禽类的PGC, 并且可以把PGC移植入发育中的胚胎的原始生殖腺并制作嵌合体禽类。van de Lavoir et al. [9]将基因打靶的携带能表达绿色荧光蛋白基因的PGC注入孵化3 d 发育至13~15 期的鸡胚内, 获得8 只公雏, 成长后与母鸡交配产生7 只生殖腺有转入外源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。这一成功为今后进行禽类的定点转基因提供了示范。
2 转基因动物技术的应用现状
转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基因组,并能遗传给后代的动物。目前,转基因动物的研究主要包括三个方面:(1)利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造
具有生物活性的产物,包括器官移植和生物反应器。(3)利用转基因动物确定研究手段,包括建立疾病模型和发育调控。
2.1 促进动物生长
生长激素(GH)基因是转基因研究中最早运用的,至今已生产出转基因家禽、啮齿类、鱼类、昆虫等多种属性的动物。Hammer等[10](1985)利用显微注射法将人生长激素基因转移到兔、绵羊和猪中均获得成功。国内外大量的转基因家畜GH均能表达,但GH的表达水平在不同的转基因实验之间和同一转基因实验的不同动物个体之间差异很大。国外生产的转基因猪中GH产物得到表达,血浆中GH水平持续地提高,转基因猪的生长速度比较快,饲料利用率提高17%,胴体脂肪为对照组的50%。20世纪80年代中后期,新疆畜牧科学院与北京农业大学合作,用精子载体人工法获得了含有牛生长激素基因的转基因绵羊。结果表明,转基因绵羊比普通绵羊生长速度快,周岁体重较高。有不少研究发现,在提高动物生长速度的同时也带来了一些副作用,如在转GH基因动物中,死胎和畸形率较高,得关节炎、胃溃疡、肾病和繁殖力下降的转基因动物较多,这可能与转基因整合位点不当和GH表达水平失控有关。另外,对猪进行GH基因发现,较异原生长激素基因的猪生长速度快。
2.2 改善产品品质
外源基因不仅能在转基因动物中得到整合和表达,而且能获得组织特异性表达,因此,只要转入相关的基因,不仅可以提高乳、肉、蛋、皮毛等畜产品的产量,而且也可以改变畜产品质量,这是常规育种和突变方法所不能完成的。在改变产乳性状方面,主要以羊和奶牛为转基因对象。西方国家如英国、美国、法国、瑞士和荷兰都已相继开展研究,并取得了一定进展。Simious等首先用绵羊的β-乳球蛋白(BLG)基因产生了转基因小鼠并获得表达,其乳汁中所含的绵羊β-乳球蛋白的量要比正常绵羊乳汁高5倍。随后又用BLG-FIX(人凝血因子IX)和BLG-α1AT(人α1-抗胰蛋白酶)基因获得了转基因绵羊,并从其乳汁中测出了人凝血因子和人α-抗胰蛋白酶。Murray等将人乳溶菌酶基因导入小鼠获得了有活性的乳腺专一性表达,通过这一途径有可能实现对乳用家畜乳用成分的改良,乳汁成分中溶菌酶含量的提高,不仅可以减少乳畜乳房炎的发生,还能延长奶的保鲜期。在改善肉质方面,许多研究都已证实,GH具有明显抑制脂肪生成的作用,而且还有一定的催乳特性,转有GH基因的家畜,体脂减少,瘦肉率明显提高,利用GH基因抑制脂肪生成的特性,可对瘦肉型猪进行定向育种和培育。通过一定的导入途径将GH基因导入产毛家畜,可提高产毛家畜的生长速度并增大其体型,进而提高产毛量。除此之外,还可以导入一些与产毛性能有关的基因,目前研究较多的是角蛋白纤丝基因,与胱氨酸合成有关的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)和D-乙酰丝
氨酸硫化脱氢酶(DAS)基因等。澳大利亚已有两个实验室正在进行这方面的研究,他们分别从大肠杆菌和沙门氏菌中分离到SAT和DAS基因并且经基因转移获得了转基因小鼠和转基因绵羊。最近已有报道,带有提高羊毛产量特征的转基因羊已产生。目前,人们开始用转基因手段培育超细型细毛羊,并准备将彩色毛基因导入绵羊以生产彩色羊毛,这无疑对羊毛生产及纺织业带来巨大影响。
2.3 提高抗病性
提高家畜生产性能和改善畜产品质量一样,利用转基因技术提高动物的抗病性具有十分乐观的应用前景。在对各种动物的抗病基因转移研究中,以对鸡的抗病效果较显著[11,12]。1989年美国农业部以禽白血病病毒(ALV)为载体,获得了抗ALV的新品系鸡。王敏华等报道,用OMT与抗猪瘟病毒的核酶基因相融合,经基因转移后用以指导抗猪瘟病毒的核酶基因在转基因兔中的表达,检测表明,转基因兔获得了一定表达。
2.4 动物生物反应器
一般把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物叫动物生物反应器,转基因最为诱人的前景是利用他生产人类所需的生物活性物质或药用珍稀蛋白,这已引起了国内外学者和开发商的高度重视。Sharma等(1994)用同源性猪β猪蛋白基因作启动子连接人的β猪蛋白基因做组编码区在转基因猪中高效表达人的血红蛋白,这表明通过转基因猪大规模生产人血红蛋白是可能的。目前已成功在山羊、猪和绵羊乳中生产出组织血纤维蛋白溶酶原激活因子和抗凝血因子(t-PA),血凝集因子Ⅷ和Ⅸ以及蛋白C。在转基因家畜血液中得到了人免疫球蛋白α1球蛋白、β球蛋白、干扰素、胰蛋白酶和生长激素等,而且这些蛋白都具有正常的生物活性。
2.5 器官移植
器官移植按供体与受体遗体距离的远近可分为两种类型:相近种系和远离种系间异种器官移植。异种器官移植排异反应甚为迅速和剧烈,例如:异种移植的心脏在几分钟至几小时内即可被排斥而丧失功能。为了防止补体介导的异种移植后超级排异反应,近年来,国外学者提出了两条途径:一条途径是通过对受体动物循环血中的补体清除,使供体心脏不受补体的攻击。首先采用此法进行猪-猴心脏移植达到了延长心脏存活的目的。另一条途径是通过转基因技术,即通过克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中,使之在供体心血管内上皮表达,采用这种转基因动物心脏进行异种移植后,就可避免超级排异反应的发生,其效果类似于同种心脏移植。
2.6 建立人类遗传疾病模型进行基因治疗
基因治疗主要是将正常的外源基因植入人体靶细胞以取代有缺陷的基因,恢复该基因的功能或提供一种新的治疗功能,以改善相关症状,达到治疗基因病的目的。最早的基因治疗可追溯到20世纪80年代初。80年代后期,从小鼠到灵长类等一系列动物基因转移研究模型获得成功。我国基因治疗研究始于80年代末,1987年成立了第一个进行基因治疗研究的实验室,短短几年内,已取得显著的成绩,首例基因治疗血友病患者获得成功(1991)。
3 存在问题及展望
未来转基因技术在猪、牛、羊、兔等家畜中获得成功,并已得到初步应用,但目前还存在一系列问题制约着转基因动物的生产规模,限制着转基因动物产品的研究与开发。存在的问题有:成本高,效率低;转基因的表达不理想;目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出;社会对转基因动物的可接受性还有待于进一步论证等。虽然转基因技术还存在一定的局限性,但经过几十年的发展,转基因动物的研究取得了长足的进步,研究方法也日新月异,在各个领域展现出美好的前景。许多生物学家预言“21世纪将是人类向生物技术要粮食、要奶、肉、蛋的世纪”,利用转基因动物造福人类的前景无疑是光明而诱人的。
参考文献:
[1]Palmiter RD.,Brinster RL.,et al.Dramatic growth of mice that de-velop from eggs microinjected
with metallothione in growth hormonefusiongenes〔J〕.Nature,1982,300:611~615
[2]Gordon JW.,Scangos GA.,Plotrin DJ.,et al.Genetic transformationof mouse embryo by
microinjection of purified DNA〔J〕.Proc Natl A-cad Sci USA,1980,77:7380~7384
[3]Haskell RE.,et al.Efficient production of transgenic cattal by retrovi-ral infertion of eearlyembryos〔J〕.Molreprod Dev,1995,40:386~390
[4]安晓荣,等.体细胞核移植法生产绵羊转基因囊胚〔J〕.科学通报,2001,46:810~813
[5]Kim J H, Jung-Ha H S, Lee H T and Chung K S. Developmentof a positive method for male stem cell-mediated gene transferin mouse and pig (J). Molecular Reproduction and Development,1997, 46: 515~526
[6]Yang X Y, Li H, Ma Q W, Yan J B, Zhao J G, Li H W, Shen HQ, Liu H F, Huang Y, Huang S Z,
Zeng Y T and Zeng F. Improvedefficiency of bovine cloning by autologous somaticcell nuclear transfer (J). Reproduction, 2006, 132 (5):733~739
[7]Thomas K R and Capecchi M R. Site-directed mutagenesis bygene targeting in mouse embryo-
derived stem cells (J). Cell.1987, 6;51(3): 503~512
[8]Yang X Y, Li H, Ma Q W, Yan J B, Zhao J G, Li H W, Shen HQ, Liu H F, Huang Y, Huang S Z,
Zeng Y T and Zeng F. Improvedefficiency of bovine cloning by autologous somaticcell nuclear transfer (J). Reproduction, 2006, 132 (5):733~739
[9] Van de Lavoir M C, Diamond J H, Leighton P A, Mather-LoveC, Heyer B S, Bradshaw R,
Kerchner A, Hooi L T, Gessaro TM, Swanberg S E, Delany M E and Etches R J.
Germlinetransmission of genetically modified primodial germ cells (J).Nature, 2006, 441: 766~769
[10]Hammer RE.,Prused VG.,Rexord GE.,et al.Production of trans-genicrabbits,sheep and pigs by
microinjection〔J〕.Nature,1985,315:680~683
[11]庞有志,赵淑娟.转基因技术与鸡的抗病育种〔J〕.中国兽医科技,1999,(3):43~44
[12]孙含笑,陆大祥,等.转基因技术理论与应用(第一版)〔M〕.郑州:河南医科大学出版
社,2002,444~446
基因技术的发展历程 2011级初等教育理科代林宏 [摘要]基因技术作为２１世纪生物科技的核心技术之一，通过操纵、改变DNA上基因的容易来改变生物属性和特点，包括胰岛素生物工程、干细胞技术、克隆技术等。基因科技术的每一次突破和发展对人类的生产生活都有着重要的影响。 [关键词] 基因技术；成就；发展历程； 基因技术是指通过操纵、改变（增加或减少)DNA上基因的容易来改变生物属性和特点，以达到有利于人类目的的生物科学技术。如把胰岛素基因置入大肠杆菌产生人类稀缺的胰岛素生物工程；干细胞技术，克隆技术等。这一系列的技术由基因到伟大的人类基因组计划以及后来的一系列生物高科技的发展有一个漫长的历程。 19世纪60-80年代间确定了细胞中的两种核算，脱氧核糖核算及核糖核酸；染色质，染色体等物质，对细胞结构有了基本的认识。 1909年，丹麦的约翰逊把遗传因子命名为“基因”。随后美国人摩尔根和他的学生发表了《遗传的物质基础》和《基因论》。证明了基因是染色体上的遗传单位。 1944年美国的艾弗里证明了遗传基因就在DNA上。剑桥大学的卡文迪许实验室里，沃森和克里克研究发现了DNA分子双螺旋结构，并在科学期刊《自然》上面发表了论文，这位之后的基因技术发展奠定了基础。 1956年，美国的肯恩伯格从大肠杆菌里分离出了一种催化核苷酸形成DNA 的酶－DNA聚合酶，作为DNA体外复制技术的起始。随后提出了中心法则、操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，使生物学的发展进入了另一个阶段。 所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA中被插入了人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的豆和四分之一的玉米都是转基因的。 运用胚胎遗传病筛查技术可使患儿的父母生一个和患儿骨髓匹配的孩子，然后再通过骨髓移植来治愈患儿。[1] 基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，二是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新性状，如抗虫西红柿，生长迅速的鲫鱼，转基因烟草等。1997
基因工程的现状及发展 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
基因工程的现状及发展 研究背景： 迄今为止，基因工程还没有用于人体，但已在从细菌到家畜的几乎所有非人生命物体上做了实验，并取得了成功。事实上，所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA中被插入人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的大豆和四分之一的玉米都是转基因的。目前，是否该在农业中采用转基因动植物已成为人们争论的焦点：支持者认为，转基因的农产品更容易生长，也含有更多的营养（甚至药物），有助于减缓世界范围内的饥荒和疾病；而反对者则认为，在农产品中引入新的基因会产生副作用，尤其是会破坏环境。 目的意义： 如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA 链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型。 内容摘要： 如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA 链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，一是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新的性状，这引起了一场农业革命。如今，转基因技术已经开始广泛应用，如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞生。这只叫“多利”母绵羊是第一只通过无性繁殖产生的哺乳动物，它完全秉承了给予它细胞核的那只母羊的遗传基因。“克隆”一时间成为人们注目的焦点。尽管有着伦理和社会方面的忧虑，但生物技术的巨大进步使人类对未来的想象有了更广阔的空间。 成果展示：
转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）又称跳跃因子，其实质是基因组上不必借助于同源序列就可移动的ＤＮＡ片段，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。自１９５１年美国Ｍｃ－Ｃｌｉｎｔｏｃｋ在玉米中首先发现了ＤＮＡ转座子（ＤＮＡｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）以来，转座子已成为各种生物的基因分析的有效工具之一。不仅利用转座子诱变已找到原核生物的单性生殖基因［３］；而且在真核生物中，Ｐ－转座子的发现和运用极大地促进了果蝇遗传学的发展。近来，一些其他的转座子元件，如ｈｅｒｍｅｓ，ｈｏｂｏ，ｍａｒｉｎｅｒ，ｍｉｎｏｓ和ｐｉｇｇｙＢａｃ已成功在Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ、Ａｎａｓｔｒｅｐｈａｓｕｓｐｅｎｓｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｖｉｒｉｌｉｓ、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）以及包括鱼类、禽类在内的多种生物转基因中获得应用，２００５年７月复旦大学的丁昇在《ｃｅｌｌ》杂志上发表关于运用ｐｉｇ－ｇｙＢａｃ转座子作载体成功制作转基因脊椎动物—— —小鼠，更加显示了转座子作为转基因载体的优势与潜力。 １转座子的类型和基本结构 １．１ＤＮＡ转座子ＤＮＡ转座子是以ＤＮＡ－ＤＮＡ方式转座的转座子，可通过ＤＮＡ复制或直接切出两种方式获得可移动片段，重新插入基因组ＤＮＡ中，导致基因的突变或重排。但一般不改变基因组的大小。根据转座的自主性，ＤＮＡ转座子又分为自主转座子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ）和非自主转座子（ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ），前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则要在自主转座子存在时才能够实现转座。玉米的Ａｃ／Ｄｓ体系就是典型的一例。活化子Ａｃ（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）属于自主转座子，解离子Ｄｓ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）属于非自主转座子，只有在Ａｃ存在时，Ｄｓ才能转座。 １．２反转录转座子反转录转座子不同于转座子，是以ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡ的途径来实现转座的，在整合酶的作用下新生成的以ＤＮＡ状态存在的反转录转座子整合到宿主基因组中。这样，反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累，从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件，所以会影响宿主基因的表达，在生物进化过程中反转录转座子起着不可忽视的作用［４］。 根据是否具有编码反转录酶的能力，反转录转座子可以分为两个家族：自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子O按照序列结构中有无长末端重复序列（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅ－ｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＴＲ）又可分为有ＬＴＲ反转录转座子和无ＬＴＲ反转录转座子。自主性反转录转座子包括内源性反转录病毒（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＥＲＶ）、ＬＴＲ反转录转座子及长散在元件（ｌｏｎｇｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＬＩＮＥｓ）O非自主性反转录转座子包括短散在元件（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＳＩＮＥｓ）及修饰性反转录假基因（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄｒｅｔｒｏｐｓｅｕ－ｄｏｇｅｎｅ）。 ２转座子的转座机制 转座子都具有编码与转座作用有关的酶—— —转座酶的基因，而末端大多数都是反向重复序列。转座酶既识别转座子的两末端，也能与靶位点序列结合。转座作用的机制是转座子插到新的位点上产生交错切口，所形成的突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，然后由ＤＮＡ聚合酶填补缺口，ＤＮＡ连接酶封闭切口，交错末端的产生与填补说明了靶ＤＮＡ在插入位点存在正向重复，两条链上切口之间的交错取决于正向重复的长度，因此，每个转座子所特有的靶重复序列，反映了切割靶ＤＮＡ的酶的几何形状。 ３主要运用于动物的几种转座子 ３．１Ｐ－转座子Ｐ－转座子最初于果蝇中发现，并研究了其结构与功能，建立了Ｐ－转座子和转座酶辅助系统。该转座子能只在果蝇中作用。但该系统为以后的转基因动物提供了理论和实验基础。Ｐ－转座子长度为２．９ｋｂ，具有３１ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。中间有编码转座酶的可转录单位，以此产生转座子的精确切出和准确插入另一染色体位点（切出—粘贴反应）。Ｐ—转座子的功能还受其他核因子的影响，这些因子可能是不同昆虫中转座子发挥功能与否的条件。３．２Ｍｉｎｏｓ转座子Ｍｉｎｏｓ转座子是从海德尔果蝇Ｄ．ｈｙｄｅｉ中分离得到的，并首先应用与果蝇以外的昆虫转基因。Ｍｉｎｏｓ转座子长度位１．４ｂｐ，具有较长的１００ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。可转录单位为１个内含子。以地中海果蝇白眼基因为报告基因的研究表明，Ｍｉｎｏｓ转座子的转座效率在ＧＯ带１～３％，并能在双翅目核鳞翅目昆虫细胞及按蚊Ａｎｃｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ和大果蝇Ｄ。Ｖｉｒｉｌｉｓ昆虫个体中实现转座。３．３Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子是从马里塔尼亚果蝇Ｄ。Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ中发现的。长度２８ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）和特意性的ＴＡ目标结合位点。Ｍｉｎｏｓ转座子是至尽为止研究最深入的转座子之一。 ３．４ｈｏｂｏ转座子因为Ｐ转座子只能在果蝇中实现转座，因此寻找其他转座子系统十分必要。Ｈｏｂｏ转座子就是其中 转座子在转基因动物中的应用 刘冬 （山西农业大学研究生学院，太谷０３０８０１） 摘要：转座子是发现新基因和基因功能分析的有效工具之一，作为插入突变原和分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆，一些转座子已作为转化载体用于制备转基因动植物。转座子对多种生物尤其是对脊椎动物的成功转化让人们看到了他们作为转基因载体的巨大潜能。 关键词：转座子；转基因动物；昆虫；鱼类；哺乳动物 专论与综述 畜牧兽医科技信息２００７．０７ １８
转基因动物的应用前景 冯彦东，马小军，李越，马志辉，肖海元，马永刚，马聪 甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州 (730070) 摘要：本文较为全面的综述了各种转基因动物技术的方法，以及提高转基因效率的方法；指出了目前研究中存在的问题，并对其发展前景进行了展望。 关键词：转基因动物、基因、方法、应用、前景 科学家预言，21世纪是生命科学的世纪，生物技术产业已成为科学家和企业家开发的热点。转基因动物技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，是建立在细胞遗传学、分子遗传学、胚胎发育学和DNA重组技术基础之上的生物工程技术。转基因技术就是利用工程技术的实验手段将特定外源基因导入受体细胞中，由此整合到受体细胞的染色体上，并使外源基因得到表达和遗传的生物技术。携带外源基因并能表达和遗传的支物称为转基因动物。转基因技术是新兴的生物技术，具有广阔的应用前景。目前利用转基因技术获得的主要是粮食作物，其中转基因植物及产品已进入商品化生产阶段。转基因动物的研究尚处于实验室研究阶段，获得转基因动物技术难度较大。但它是一种通过对基因的操作，在RNA、蛋白质、形态学或生理学等水平直接观察基因在活体内的活动情况，并观察其表达产物所引起的表型效应的四维实验体系，其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中，既具有深远的理论价值，又有重大的应用价值。据统计，全球已有以转基因动物技术为核心的公司43家，并将成为21世纪生物技术领域的支柱产业。1998年全球动物生物技术产品总销售额估计为6.2亿美元，预计到2010年仅在农业领域总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元来自转基因动物品种。而利用转基因动物制作生物反应器生产药品物和功能蛋白的销售市场预计可达500亿美元。毫无疑问，转基因动物正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学研究与发展面貌。利用转基因动物技术，既可加快家畜品种的改良速度，提高肉、奶、蛋的产量和品质，又可生产珍贵的药物蛋白，为大量患者造福。可以说转基因动物技术对于人们千百年来追求的丰衣足食，延年益寿两大目标都会做出具大的贡献。[1，2，3，4，5，6，7] 1 转基因动物的制作方法 1.1 显微注射法 是由美国人Gordon于1980年首次发明。显微注射法的制作过程是将SV40的TK基因整合的质粒以显微注射法注入到小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出转基因小鼠。其基本原理是通过显微镜注射将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。其优点是直接对基因进行操作,整合率较高.缺点是技术难度高,成功率低。[3，8，15，18] 1.2 逆转录病毒传染法 此法的研究是1974年Janenissh等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，获得转基因小鼠。其原理是利用逆转录病毒的LTRs区域具有的转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTRs的下部进行重组后，再使之包装成为高滴度的病毒颗粒，直接感染受精卵或注入囊胚中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。逆转录病毒法的优点是操作简单，外源基因的整合率高，动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导入的外源基因的表达，缺点是逆转录病毒载体容量有限，并且外源基因
学号 1234567 基因工程课程论文 （ 2013 届本科） 题目：基因工程技术发展历史、现状及前景 学院：农业与生物技术学院 班级：生物科学 091 班 作者姓名： X X X 指导教师： XXX 职称：教授 完成日期： 2013 年 3 月 16 日 二○一三年三月
基因工程技术发展历史、现状及前景 摘要：生物学已是现代最重要学科之一，而从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的发展与进步，已成为生物技术的核心。基因工程技术现应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等诸多领域。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程技术及相关领域将成为21世纪的主导产业之一。 关键词：基因工程技术、发展历史、现状、前景 引言 基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中"安家落户"，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品"拷贝"出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。科学家将改变人类生殖细胞-DNA 的技术称为“基因系治疗”，通常所说的“基因工程”则是针对改变动植物生殖细胞的。无论称谓如何，改变个体生殖细胞的DNA都将可能使其后代发生同样的改变。 一、基因工程技术的发展历史 （一）基因工程发展简述 人类与动物的许多病害都是由单细胞原核生物——细菌引起的。在一段时间，细菌成为人类的第一大杀手，成千上万的生命被其感染吞噬。虽然青霉素以及磺胺类等搞菌药物的出现拯救了无数的生命，但是，好景不长，青霉素使用不到期10年，即在世界上20世纪50年代中期，就发现了严重的细菌抗药性，并且这种抗药性还具有“传染性”，也就是说，一种细菌的抗药性可以传给另一种细菌。
基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。?在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。?随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。? 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。?目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
生命科学院 分子生物学 期末综述 题目：基因工程在转基因动物领域的应用现状及展望班级： 09动物科学 姓名：曾雪婷 学号： 2009084548
【摘要】本文阐述了基因工程和转基因技术研究的原理、基本路线，介绍了转基因技术和生产转基因动物的方法，总结转基因技术在哺乳动物领域的应用，提出了转基因动物面临的问题，并对转基因技术及转基因动物的前景进行了展望。 【关键词】基因工程；原理；转基因动物；应用；展望 基因工程是改变生物的遗传组成，增加生物的遗传多样性，赋予转基因生物新的表型特征，使其能够更好地服务于人类社会的一项工程技术。基因工程在转基因动物领域的应用具有巨大的发展潜力，促进了转基因方法的不断发展和转基因动物应用领域的迅速扩大。 1.基因工程与动物基因工程的原理 基因工程又名遗传工程(genetic engineering)、一主要包括DNA 重组技术、分子克隆或基因克隆等技术，它是指在分子水平上提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA(基因)在受体细胞质中进行了复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定遗传给后代[1]。基因工程的核心内容包括基因克隆和表达。 动物基因工程就是利用基因工程技术来人为地改造动物遗传特性的技术体系。它的具体应用就是生产转基因动物(transgenic animal)，即用基因工程的方法获得目的基因并导入到动物的受精卵中，使外源基因与动物本身的基因组DNA整合到一起，并随细胞的分裂而增殖，从而在动物体内得到表达，产生具有特定性状的个体。这种在基因组中稳定有效地整合有人工导入外源基因的动物称转基因动物。应用实验胚胎学和分子生物学原理，将来自一种生物的特定基
转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望 （1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。 （2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 （3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 （4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。 （5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。 当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通
动物转基因技术的研究现状与应用 课程：基因工程姓名：迪丽努尔·尼扎木墩学号：2013081605 摘要转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导人动物染色体基 因组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。转基因技术的一般方法有原核期胚胎的显微注射法（Microjection）、逆转录病毒载体法、精子载体法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞介导的基因转移，这几种方法各有其公优缺点，在动物转基因上均有不同的应用，目前在动物抗病育种、建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、利用转基因动物生产药用蛋白质等方面应用越来越广泛。 关键词转基因技术方法研究现状 转基因动物（transgenicanimal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因（transgene），而整个技术则称为转基因技术（transgenictechnology或transgenesis）[1]。现代转基因动物（tx-ansgenicanimal）研究始于20世纪80年代以后,1980年，Gordon等首次获得转基因小鼠目前除转基因小鼠外，转基因兔、绵羊、猪、牛及转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成[2，3]。本文将从转基因动物的原理、主要方法和应用等方面作一综述。 1转基因技术的一般方法
能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递，主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。迄今为止，能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几种[4]： 1.1原核期胚胎的显微注射法（Mi-crojection） 该法由美国人Gordon发明，其主要步骤包括：（1）分离、克隆和重组外源基因，构建载体；（2）将融合基因注入受精卵的原核（一般是雄原核）；（3）将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。Palmiter等（1982）将带有小鼠金属硫蛋白I基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵，获得“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单，整合率高，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机，整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。 1.2逆转录病毒载体法 1.2.1逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎：该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列（longtermi-nalrepeats，LTRs）区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点，将外源基因连接到LTRs下部，构建重组载体，直接感染受精卵或微注入囊胚腔中。达到外源基因在宿主染色体上的整合、表达。Salter和Haskell等分别用此方法作出了转基因鸡和牛[5]。 1.2.2逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞：Anthony等[6]（1998）对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短。细胞分裂完成后，核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期（MⅡ）的卵母
课程论文规范 一、论文组成及顺序 封面、中英文摘要、正文、参考文献、致谢、有关附件等(可选)。 论文电子版上交。 二、规范要求 1．正文中论文题目使用黑体三号字，正文使用宋体小四号字，1.25倍行距；表格为单倍行距；一级标题段前段后为0.5行，正文段前段后为0，字符间距为标准。 2．页边距：上2.5㎝,下2.5㎝,左3㎝,右2.5㎝。方向：纵向。 页脚：1.5㎝.页码：页面底端（页脚），居中，格式如·X·，封面不编页码，从正文开始。 3．论文字数不少于5000字。 4．论文中的表格采用三线表，必要时可以加辅助线，表头放在表格的上方，5号黑体，中；表格内为5号宋体，左对齐。 5．论文中的图，图题放在图的下方，不要外框。 6．表序、图序均以阿拉伯数字连续编号。 7．参考文献不少于10篇，采用顺序编码制，文中参考文献[数字]上标。 8．中英文摘单独成页。 9．为保证打印效果，全文字体的颜色统一设置成黑色。均用A4纸单面打印。
青岛农业大学 动物基因工程课程论文 题目：转基因动物的应用前景 姓名：宋增财 学院：动物科技学院 专业：兽医 班级：2010-02 学号：20106576 任课教师：闵令江 二Ｏ一一年十月二十日
转基因动物的应用前景 兽医宋增财 指导老师闵令江 摘要：转基因动物不仅可以用来研究基因功能，还可以按照人的意愿改良动物的遗传品质，为人类探讨疾病发病机理，寻求有效治疗途径，提供筛选和鉴定药物的理想模型；改良家畜生长特性，提高饲料利用率和产量，为人体提供异体移植器官和生产珍贵药物蛋白。转基因生物研究蕴含着巨大的经济价值，具有非常广阔的应用前景，在国际上成为生物工程的投资热点之一。本文较为全面的综述了各种转基因动物技术方法和动物转基因技术的应用，并对其发展前景作了展望。 关键词：转基因动物基因方法应用前景
基因工程的现状及发展 研究背景： 迄今为止，基因工程还没有用于人体，但已在从细菌到家畜的几乎所有非人生命物体上做了实验，并取得了成功。事实上，所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA 中被插入人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的大豆和四分之一的玉米都是转基因的。目前，是否该在农业中采用转基因动植物已成为人们争论的焦点：支持者认为，转基因的农产品更容易生长，也含有更多的营养（甚至药物），有助于减缓世界范围内的饥荒和疾病；而反对者则认为，在农产品中引入新的基因会产生副作用，尤其是会破坏环境。 目的意义： 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型。 内容摘要： 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，一是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新的性状，这引起了一场农业革命。如今，转基因技术已经开始广泛应用，如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞生。这只叫“多利”母绵羊是第一只通过无性繁殖产生的哺乳动物，它完全秉承了给予它细胞核的那只母羊的遗传基因。“克隆”一时间成为人们注目的焦点。尽管有着伦理和社会方面的忧虑，但生物技术的巨大进步使人类对未来的想象有了更广阔的空间。 根据时势，我们总结科学家在基因工程的最新尝试 成果展示： 基因工程在工业方面的发展与应用： 1、环保工业 随着化学工业的迅速发展,产生了为数众多的化合物。其中不少都是能持久存在的有毒物质，这些物质的存在对人们所处的环境造成了极大的威胁。基因工程技术则有望解决这一难题。科学家通过DNA重组技术得到分解性能较高的工程菌种和具有特殊降解功能的菌株，从而
转基因动物及其在医学中的应用 转基因动物是指通过加减特定的DNA片段而改变了基因构成和性状 的动物，也可以认为是指体内基因组中稳定地整合有外源基因的动物。该项技术始于80年代初，很快便成为研究动物基因表达特性及其功能的重要手段，在基因表达的调控机制等方面的基础理论研究、家畜家禽的遗传性状改造、培育能为人类提供器官移植材料的家畜、培育人类疾病的模型动物、作为生物反应器主产工业和医学所需要的珍贵生物活性蛋白等方面被广泛应用。本文主要对其在人类医学方面的应用现状及前景作以论述。 1转基因动物的制备技术 用以培育转基因动物的技术叫做转基因技术或基因转移。其总体过程是：首先从某种动物分离目的基因或人工构建该目的基因，把该目的基因在体外进行重组和扩增，然后再把加工好的目的基因设法导入另一个同种或异种动物受精卵的原核内（或细胞质内），使其稳定地整合到受体细胞的基因组中，最后使该受精卵发育成携带外源目的基因的个体，即产生了转基因动物。目前常用的转基因技术主要有： 1）原核内显微注射法是将在体外构建的目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵的原核中，让这种外源基因通过某种方式整合到受体细胞的基因组中去，以实现转基因的目的。 2）转染技术主要以RNA病毒或DNA病毒为载体，在体外将目的基因或连同启动子等序列一同重组到病毒的核酸载体上。再让该病毒感染受精卵或胚胎于细胞，利用载体病毒具有主动整合到受体细胞基因组中去的特性，让其连同所携带的目的基因等也一同整合到受体细胞的基因组上去。 90年代后又出现了两种较新的方法，即基因剔除和基因楔入技术。 3）细胞载体技术主要使用胚胎干细胞（ES）作为操作对象。胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离得到的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，一旦回复到适当的环境条件下即可形成胚系集落。可以用转基因技术将外源目的基因转移到胚胎干细胞中，通过同源重组或转换的方法使外源基因整合到胚胎干细胞的基因组中。而且，还可以根据由于外源基因的插入所产生的基因表达方面的改变，来对胚胎干细胞进行预筛选，从而大大提高转基因的成功率。被转基因后的胚胎干细胞经鉴定后可被移植到正常发育的囊胚中，再将囊胚导入假孕的代理母亲子宫内发育而产生出嵌合体动物，然后与正常的雄性动物交配即可获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。 目前还有用快速分裂的哺乳动物乳腺肌上皮细胞或小鼠精子作为细胞载体。 2转基因动物在医学中的应用