食品中的多酚氧化酶
中国食品产业网（2007年3月3日11:27）
多酚氧化酶(P01yphenol Oxidase，PP0)是自然界分布极广的一种氧化还原酶，茶叶中的多酚氧化酶通过控制不同的酶活可以加工成品质与滋味迥异的各类茶叶。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年KeilinD．和MannG研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为p01yphenol Oxidase。之后多酚氧化酶一直是研究的热点，尤其是在PP0的生化、生理学性质方面取得了较大的进展。
氧化还原酶
(1)酚酶又称多酚氧化酶、酪氨酸酶、多酚酶、儿茶酚氧化酶、甲酚酶、儿茶酚酶。最适 pH为5～7，可以催化酚类物质氧化。酚酶在植物界中存在广泛，是许多蔬菜、水果的切面在空气中迅速变黑的主要原因。
1、多酚氧化酶的分布与在植物中的作用
PP0是核编码的的铜金属酶，是在细胞质中合成的，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，PP0相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的的植物残渣上都可检测到PP0的活性。在植物(如土豆、苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、烟草等)组织中，PP0是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性，在果蔬细胞组织中，PP0存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PP0活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PP0，含量大约与蛋白质部分相同，马铃薯芽、根的多酚氧化酶的活性最高，幼叶和成熟块
茎中活性中等，成熟叶和茎叶活性最低；在茶叶中的PPo可分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PP0，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态，StePhenThanarajS.N. (1990)研究了茶树新稍中PP0活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PP0活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产。在采摘的鲜苹果中，PP0几乎存在叶绿体和线粒体中，从这两部分分别制备的PP0，其底物专一性稍有差异。刘乾刚认为，PP0在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PP0，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PP0的作用。在动物中(如鼠、免)，PP0也得到了分离。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。虽然从1895年就开始了多酚氧化酶的研究报道，但其在植物组织中的功能并未充分了解，随分子生物学的发展，象西红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等对茶树多酚氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族，多则6—7个基因。这些基因的表达具有时空差异和组织特异性(PP0在幼龄组织中表达，在成熟组织中不表达)，表明了植物中所起的作用不同。但在高等植物组织发生褐变主要是PP0活动的结果。
2、果实中多酚氧化酶的作用条件
果实在树上生长时不会发生褐变，褐变发生在果实采后贮藏过程中，而且随贮藏时间的延长褐变加重，说明褐变与果实成熟衰老有关。采收期的早晚对酶促褐变的影响可能是组织衰老和自身保护酶系。不同产地果实的褐变程度也不同，说明褐变与果树的栽培管理和果实的营养水平有一定关系。不同大小的果实在储藏过程中的褐变程度不同，一般大果实比小果实易发生褐变，原因可能与果实储藏后期果心释放出来的CO2不能及时排出有关。
统互相作用的结果。
3、果实中与褐变有关的酶及特点
国内外的研究一致认为果实中的PPO是果实发生酶促褐变的主要酶。PPO 是一种含铜酶，能催化两类不同的反应，可以使一元酚羟基化，生成相应的邻二经基化合物；也可以氧化邻苯二酚生成醌。对PPO进行分离纯化鉴定，认为PPO有几种不同的存在形式，最重要的是相对分子质量为64000的一种。PPO 与果实褐变有密切的关系，在苹果开花后的4—5个月内，蛋白质中PPO的含量保持不变，但PPO的活性降低了，在末成熟的果实中，有活性的PPO大多存在于果心部位，果心处的PPO活性最高，其次是果肉，最后是果皮，这与果实从果心向果皮的褐变过程吻合。对PPO的进一步研究发现PPO有同工酶存在，依据是在不同PH系列下PPO的活性出现两个以上的峰。对分离的PPO同工酶性质进行分析，发现同工酶间的性质差别较大。关于PPO活性最适宜的PH，研究结果存在争议，有人认为pH 3.8最适宜，也有人认为pH 6.2：或pH5.6最适宜。对PPO热稳定性的研究结果比较一致，在60℃以上仍有部分活性。根据这一特性，陈秀芳等认为桃加工后期发生的褐变，不完全是非酶褐变,也可能有酶促褐变的参与。
3、果实中PPO的底物
PPO的底物是酚类物质，果实中的酚类物质很多，酚类物质的种类和含量在果实生长和成熟过程中会发生变化，在果实贮藏过程中随贮藏时间的延长含量下降，同时随果实酚类物质含量的下降，PPO活性增加，褐变增加。一般认为果实在储藏期间酚类物质含量的下降是被PPO氧化的结果。PPO对邻经基结构作用最强，同时取代基团的取代位置也影响酶与底物的结合能力。总之，不同种类的果实PPO的底物可能
不同，同一类果实在不同的生长发育阶段，PPO底物也可能不同。研究PPO
主要底物应以该底物含量在褐变前后发生变化的程度为主要依据。
4、褐变与果实成熟衰老的关系
随着果实贮藏时间的延长，果实内部发生了一系列的生理生化变化，表现为果胶物质的分解，有机酸的下降，呼吸增加，乙烯释放增加，总的趋势是趋于衰老。果实在贮藏过程中发生酶促褐变的根本原因与果实衰老有关，吴民江等对苹果梨
贮藏过程中果皮褐变进行了研究，发现在贮藏过程中果皮酚类物质含量降低，褐变加深，他们认为，果皮失水及膜脂氧化作用导致组织膜透性增大、区域比分布破坏是褐变反应的重要原因。
一般认为，细胞内酶与底物是分区定位的，正常的生活细胞具有完整的超微结构，能保证各种生理生化反应正常进行。酚类物质主要存在于液泡中，PPO 主要存在于细胞质中，在细胞结构正常时二者不能互相接触，不会发生酶促褐变；当组织衰老时，由于膜系统的破坏导致组织结构和细胞空间区划丧失，使原来酶与底物的分区定位遭到破坏，从而酶与底物接触，诱发了酶促褐变。
5、多酚氧化酶的提取方法及活性测定
多酚氧化酶是一种重要的末端氧化酶，不管是对其进行性质、同工酶、活性以及影响因子的研究，还是对生理功能、基因克隆等方面的研究，都需要把多酚氧化酶从物体中分离纯化出来。1911—1912年间Bemald和Welter沿用Marn的酶提取方法(鲜叶加兽皮粉捣碎，再以酒精沉淀，最后得到的白色干燥粉，即为酶制剂)，早期分离得到的酶大多数是不溶性，活力很低。后来学者在提取介质中加人多酚吸附剂，才分离出可溶的多酚氧化酶，即首次将Polycar—AT(PVP)用于茶叶酶学研究，并指出高效多酚吸附剂，如PVP的使用对任何富含多酚的植物酶学都是有必要的。C08Ron等(1993)采用液氮低温冷冻
提取介质的PH＝7.0，加人吐温—80或葡聚糖凝胶G—50，该改良方法可获得活力较高的可溶性多酚氧化酶。在苹果研究中，发现品种不同，酶活亦不同，为了有效的控制酶促褐变，有学者利用乳化剂(Triton X100)和酚结合剂—聚乙烯毗咯烷酮(PVPP)相结合的方式提取PP0酶，从而解决了单纯用丙酮粉法预处理而导致的酶特性的改变。在一般材料中的PP0酶的研究多采用丙酮粉法和缓冲液匀浆法。如有的学者进行小麦活性检测采用的是缓冲液匀浆法，而在枣果实多酚氧化酶性质的研究中有的学者，则采用的是丙酮粉法。
综上所述，多酚氧化酶一般采用如下几种提取方法：(1)、丙酮粉法(常规法)；（2）、匀浆法；（3）、匀浆浸提法。在这些方法中，有实验者表明丙酮粉法对PP0酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其酶粉活性尚可、体积小和便于贮存，可直接应用；缓冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液本身活性较高，不利于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到应用的要求。另据报道采用匀浆法和丙酮粉法二者结合的方法，是一种很好的提酶方法。
多酚氧化酶活性的测定方法一般是：（1）、检压法就是在一定的温度、PH值和基质浓度下，多酚氧化酶氧化基质的速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比。因此用瓦氏呼吸计测定耗氧率知多酚氧化酶活性的高低。（2）、氧电极法主要是利用氧电极测定反应中的耗氧量来表示酶活力，例如可以用来测小麦的酶活。（3）、比色法主要是多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化生成有色产物，单位时间内有色产物在460nm处的光密度与酶活性强弱成正比。（4）、碘量滴定法。其中比色法操作简便，结果较准确，目前最常用。
6、多酚氧化酶贮藏过程中的酶活变化
多酚氧化酶在氧气存在的条件下，催化各种酚类(单宁、儿茶酸、黄酮、一元酚等)使之氧化成酮，再进一步氧化聚合成黑色素。近几十年来，国内外对植物组织的褐变进行研究的结果一致表明，组织的褐变现象主要是多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质所致。不少学者对果蔬加工和贮藏进行多酚氧化酶
的活性变化研究。因为果蔬在采摘后仍然进行着一系列的生化反应，果蔬中贮存的物质逐渐被水解，并以酶系的催化反应为主要特征，从而会出现色变，影响品质。有的学者研究了苹果材料在不同贮藏期后，PP0活性随贮期延长而下降，PP0在果实采收时保持有较高活性，而随着贮期延长，果实中的生化反应加强，从而活性发生了变化。关于枣果实采后贮存中PP0的活性变化，冠小红(2000)认为呈上升趋势。但关于丙酮粉提取的多酚氧化酶活性变化到目前为止末见到相关的报道。多酚氧化酶活性对茶叶的品质影响较大，并且不同类型的茶叶要求不同活性的多酚氧化酶，红茶中要求较高的酶活，使多酚氧化酶氧化生成红茶中特有的色泽和香味。而绿茶则要求较低的酶活性，减少多酚类的氧化，以保持茶叶的绿色和鲜爽的特点。一些学者对于茶叶中多酚氧化酶活性变化主要着重缓冲液浸提与否，何种提取方法(因为对于酶活的高低，受到提取方法等外在条件的影响)和萎凋轻重问题等。在1998年刘仲华研究表明，用丙酮粉提取的酶浸提与不浸提相比，酶活有很大的不同，浸提12h，酶活力几乎高一倍。但对于茶鲜叶和丙酮粉提取贮藏中活性变化未见到相关报道。
7、多酚氧化酶的同工酶
同工酶在植物体内广泛存在，植物中研究较多的同工酶有过氧化物酶(POP)，多酚氧化酶(PP0)的同工酶。茶PP0同工酶的研究最早是60年代初，1963—1966年，Bendall和Gregorg分离了5种同工酶，1971年Pruidze等人分离出6种同工酶，1974年Buz抓等人测定了这6种同工酶的分子量，近年的实验结果表明PP0的酶谱中，多的可达10条。酶是基因表达的产物，而同工酶是其有相同功能而结构和性质不同的酶分子，它的合成主要受遗传基因的控制，具有一定的稳定性。PP0同工酶的分离一般采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(垂直平板电泳)和圆盘电泳。同工酶分析已广泛应用于植物种质资源、遗传育种、生理代谢、个体发育及适应不良环境变化等研究领域。近年来，有关农作物、果树及其它木本植物POD和PP0的同工酶研究已有不少报道，POD和PP0是同工酶分析中常用的酶，它们与植物生长发育过程密切相关，因此可反映出植物体生长发育过程中基因的存在和表达情况，且POD和PP0能将植物体内某
些有害的代谢副产物转变为无害物质，从而对植物的生长、发育和提高抗性起积极作用。同工酶技术是研究物种分类以及确定物种亲缘的一种重要而有效的手段，国内外学者利用同工酶技术对茶叶加工过程中的生化成分变化，品种间亲缘关系分析等方面都做了大量工作，现在我国科研人员还通过研究同工酶，探讨茶树的起源，品种的早期鉴定，加工中同工酶的变化对品质的影响等问题。
8、影响酶活的因素
主要有pH、作用温度、底物浓度、酶液自身的浓度以及作用时间。由于食品种类的不同，各种因素的影响也有较大差异。
9、多酚氧化酶的应用
PP0与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白家族PP0通过催化木质素及酮类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成酮类物质直接发挥抗病作用。
目前，有关抗性相关酶在植物感病的过程中的变化情况已有大量报道，如利用番茄、黄瓜等植株作为试材，考察相关病后菌侵染对PP0、POD和pAL高抗性相关酶的活性都会提高，这3种酶与植物抗性的获得呈现明显的相关性。PP0催化酚类化合物形成的酮类化合物具有更大的毒性，有关多酚氧化酶及其同工酶与植物抗病虫等抗性关系的研究已有报道。PP0是黑色素生物合成过程中的主要限速酶。大多数皮肤病脱色剂都是通过抑制该酶活性来阻断皮肤黑色素生成。从植物药中分离天然的活性成分日益受到人们的关注，不但在临床用于黄褐斑、雀斑等色素增加性皮肤病的治疗，而且还作为用于美容化妆品。污水中酚的检测，由于方法，仪器昂贵等方面的原因，不便现场测试，有的学者通过研究生物传感器—PP0传感器测定酚类化合物，简单，且有一定的灵敏度和准确度。在昆虫体内，PP0参与外甲的硬化及起自身的保护作用。
多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化形成茶黄素、茶红素和其它的氧化聚合物，同时伴随儿茶素的氧化，氨基酸、胡萝F素等香气前体发生偶联氧化，产生各种各样的香气化合物，并形成红茶的基本风味(滋味、香气)。而茶色素是一类茶多酚氧化的产物，具有生理活性。目前茶色素在临床上已经用于防治心脏病、高血脂、高血压等心血管疾病，另外还用于抗癌、抗突变、抗菌、抗病毒等功效。
10、问题与展望
关于果实酶促褐变方面的研究很多，褐变机理也比较复杂，目前尚未完全弄清。关键问题集中在对PPO及其底物的研究以及采后贮藏环境对酶促褐变的影响。有关果实贮藏前的营养状况(主要决定于果树栽培的外界气候及土壤条件)与酶促褐变的关系研究较少。酶促褐变与果实衰老有密切关系，衰老过程中酶与底物的分区定位遭
到破坏是导致酶促褐变的主要原因。PPO合成基因的表达可能与衰老有关。对PPO的深入研究有望从分子水平上搞清酶促褐变的机理，为控制酶促褐变提供新方法。
同时，改变PPO基因的表达，减少面制食品的酶促褐变，也是小麦品质育种的目标之一。若用常规育种方法降低PPO活性，很难成功。小麦PPO保守区cDNA的成功克隆，可以用来构建反义基因表达载体，利用反义RNA技术反向表达PPO基因，修饰转基因植株中多酚氧化酶基因的表达，从而控制酶促褐变。目前已成功利用该技术得到了无褐变的马铃薯品系。除了对苹果、梨、茶叶、小麦等作物的报道外，而且对于其它食品中的多酚氧化酶的研究也日渐丰富起来，例如：对于烟草、枣果实、蕨菜、茄子、莲藕、香蕉、蕃茄。
茶多酚的提取、精制工艺及产品中茶多酚的定量分析 【实验目的】 1、了解茶多酚的性质及用途； 2、了解植物天然产物常规提取和精制的方法； 3、掌握茶多酚提取与精制的原理和方法； 4、掌握茶多酚的分析检测方法。 【实验材料和仪器】 1、仪器 电动搅拌器离心机酸度计真空干燥箱抽滤瓶真空蒸发浓缩装置水环式真空泵电子天平水浴锅紫外分光光度计电热恒温干燥箱 分液漏斗微量吸管器 2、试剂 氯化钠碳酸氢钠柠檬酸硫酸铝盐酸亚硫酸氢钠乙酸乙酯 维生素C 磷酸氢二钠磷酸二氢钾硫酸亚铁酒石酸钾钠硫酸 没食子酸丙酯 Ⅰ、工艺过程及操作方法 【实验原理】 茶多酚是茶叶中30 多种多酚类物质的总称，是一类富含于茶叶中、主要由 表儿茶素、表没食子儿茶素及没食子酸酯类等组成的多羟基化合物，含量约占茶叶干物质总量的20％～30％。茶多酚分子中带有多个活性羟基(-OH)，可终止人体中自由基链式反应，清除超氧离子，类似SOD 之功效。茶多酚对超氧阴离子与过氧化氢自由基的清除率达98％以上，呈显著的量效关系，其效果优于维生素E和维生素C。茶多酚还有抑菌、杀菌作用，能有效降低大肠对胆固醇的吸收，防治动脉粥样硬化，是艾滋病毒(人类免疫缺陷病毒，HIV)逆转录酶的强抑制物，有增强机体免疫能力，并具抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、防衰老机理。茶多酚安全、无毒，是食品、饮料、药品及化妆品的天然添加成分。目前茶多酚已在医药、饮料、食品、保健等行业中广泛应用。 由于茶多酚易溶于热水，因此本实验首先用热水在一定温度下将茶多酚从茶叶中提取出来；然后对茶叶浸提液盐析处理除去部分杂质；再利用某些金属离子与茶多酚形成的络合物在一定pH值下溶解度最低的特性，将茶多酚从浸提液中沉淀出来并高效地与咖啡碱等杂质分离；经过稀酸转溶将茶多酚游离出来后，用对茶多酚具有很好选择性的有机溶剂再次对其进行萃取分离；最后将茶多酚萃取液通过真空浓缩、真空干燥得到茶多酚精品。 【实验步骤】 1、浸提：称取一定重量过20目的茶叶末，加入其重量20倍的70℃～95℃的热水，搅拌下恒温浸提60min，过滤得茶叶浸提液。取样分析浸提液中茶多酚的含量，计算浸提液中茶多酚的总量、茶多酚的浸提率。 2、盐析：加氯化钠于茶叶浸提液中，使其质量分数为6％，静置盐析1.5h后过滤。
华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒 （Quick RNA isolation Kit) 由于一些植物组织中富含多糖、多酚类物质,细胞破碎后多酚类物质极易被氧化成红褐色物质,然后和核酸不可逆地结合;多糖与RNA共沉淀,对RNA提取造成很大的干扰。另外,RNA 极不稳定,易降解,因此,从富含多糖、多酚植物组织中获得高质量的RNA比较困难。针对多糖、多酚植物组织RNA的提取,华越洋自主研发生产，博取众家之长，根据多年来市场反馈不断进行技术升级和改良得来。具有操作步骤少，实验快捷，RNA产量纯度高，充分满足后续实验要求的需要，适用提取样品广泛等特点。 产量：每100mg样品提取的RNA平均值在20-50ug不等。 纯度：OD值一般在1.9以上。得到的RNA无DNA污染，可直接用于反转录，实时荧光定量PCR（尤其对RNA溶液中DNA非常敏感）等所有后续实验。 1、快速：本试剂盒提取RNA的整个实验操作步骤简化快捷从时间因素考量上最大限度的防止RNA在提取中的降解（一般样品十多分钟就能完一个样RNA的提取，大大缩短了一般试剂盒提取所需要的半小时甚至更长的时间，）。 2、高产量：试剂盒拥有超强细胞裂解液，保证后续RNA提取的得率。（能完全通过化学方法彻底裂解细胞让RNA释放完整，并且有效成分能抑制内源RNA酶的降解作用）。 3、高纯度：进口吸附柱具有的专一吸附特性和强吸附力。三管齐下保证所提取RNA的产量和纯度，前期得到的高质量RNA才能保证后续实验成功，尤其是对荧光定量PCR实验等。
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多酚氧化酶 1 多酚氧化酶的概念 植物多酚氧化酶是一类多基因家族表达的产物，是含Cu元素的膜结合蛋白，具有基团专一性，主要与植物色素的生成及其产品的色变有关。多酚氧化酶最早发现于1895年，1937年KubOwitz在实验室中第1次分离出多酚氧化酶。1907年Bertrand等从小麦麸皮中发现多酚氧化酶(酪氨酸酶，TyrOsinase)的存在。多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等;蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。 2 多酚氧化酶的分布 多酚氧化酶是一种由核基因编码的质体酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，即主要存在于叶绿体、黄色体和白色体等的内膜上。植物多酚氧化酶广泛存在于植物体的各种器官和组织中。各种器官和组织中PPO分布是不均匀的，具有时间和空间特异性，幼嫩部位的PPO活性较高，成熟或衰老部位活性较低。另外，环境胁迫、化学药品也能诱导PPO的表达，植株组织受到机械损伤或病虫害的侵染，该部位的PPO活性也将上升。对于小麦，从植株幼苗到成熟籽粒都含有PPO，但是其活性和种类有差异，籽粒中的PPO主要存在于麸皮中。不同生物体、同一生物体的不同部位和不同发育时期PPO的含量和种类均有所不同。20世纪60年代以来，研究者们曾从不同的植物中分离出PPO，其中以茶叶、葡萄、荔枝及番茄等中的PPO含量较为丰富，而小麦等禾谷类作物中PPO不是太丰富。虽然几乎所有的质体中都包含PPO，但在某些组织中很难检测到PPO的活性，如C4植物的维管束鞘细胞和保卫细胞的质体。 3 多酚氧化酶的生理生化特性及功能 高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为O﹣二酚，二羟酚氧化为O﹣醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，产生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物外观和风味变差，营养价值下降，造成经济损失。但关于PPO 的生理功能问题，至今尚未有一个比较明确的认识。目前研究比较多的都集中在它与植物抗病性的关系上。多酚氧化酶位于质体的类囊体膜上，作为氧化还原酶，被认为与呼吸链末端的电子传递有关，能消除氧自由基的伤害，从而达到抗病的目的。随着研究的深入，人们还逐步发现了多酚氧化酶的其他生理功能。PPO参与植物色素的生成；还与植物抗逆、生长发育有关，可能促进已烯代谢；在光合作用中，可能在叶绿体内起着能量转换作用，传递光还原产生的分子氧；与植物的抗病虫等方面相关，大多数研究表明，PPO与植物的免疫抗性有关，如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病、水稻对白叶枯病以
实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O 2 ——————→ 邻醌＋ H 2 O 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：马铃薯块茎等 2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L －1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚； 20％三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备 称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min 内测定吸光度变化（A）值。 五、酶活性的计算 值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力以每min内A 525 和比活性。 A 酶提取液总量（ml） 酶活力（0.01A·min－1）＝———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml） 酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)=————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml） 公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
茶多酚性质、功效及应用是中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、、黄酮醇类和类等。主要为（儿茶素）类，儿茶素占60~80%。类物质又称茶鞣或茶，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和作用，能有 茶多酚，又名抗氧灵、维多酚、防哈灵，是茶叶中所含的一类多羟基类化合物，简称TP，主要化学成分为儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮及黄酮醇类、花青素类、酚酸及缩酚酸类、聚合酚类等化合物的复合体。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的65%~80%。儿茶素类化合物主要包括儿茶素（EC）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（ECG）和没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）4种物质[1]?。 3成分 是一种稠环，可分为类、-[4]-黄烷醇类、类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素最为重要，约占总量的60%-80%；类主要由EGC、DLC、EC、EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。茶多酚在茶叶中的含量一般在20—35%。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70%左右。 4性状
茶多酚为淡黄至茶褐色略带茶香的水溶液、粉状固体或结晶，具涩味，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯，微溶于油脂。耐热性及耐酸性好，在pH2~7范围内均十分稳定。略有吸潮性，水溶液pH3~4。在碱性条件下易氧化褐变。遇铁离子生成绿黑色化合物[1]?。 5性能 茶多酚具有较强的抗氧化作用，尤其酯型儿茶素EGCG，其还原性甚至可达L-异坏血酸的100倍。4种主要儿茶素化合物当中，抗氧化能力为EGCG>EGC>ECG>EC>BHA，且抗氧化性能随温度的升高而增强。茶多酚除具有抗氧化作用外，还具有抑菌作用，如对葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等有抑制作用。茶多酚可吸附食品中的异味，因此具有一定的除臭作用。对食品中的色素具有保护作用，它既可起到天然色素的作用，又可防止食品退色，茶多酚还具有抑制亚硝酸盐的形成和积累作用。 6理化性质 物理性质 茶多酚在常温下呈浅黄或浅绿色粉末，易溶于温水(40℃一80℃)和含水中；稳定性极强，在4—8、250℃左右的中，1.5个小时内均能保持，在三价铁离子下易分解。1989年被中国协会列入GB2760-89使用标准，1997年列为中成药原料。 化学性质 茶多酚是从茶叶中提取的全天然食品，具有抗氧化能力强，无毒副作用，无异味等特点。 茶多酚是指茶叶中一大类组成复杂、量及其结构差异很大的多酚类及其衍生物，主要由、黄酮醇、花色素、酚酸及其缩酚酸等组成的，以为主的黄烷醇类化合物占茶多酚总量的60%一80%，其中含量最高的几种组分为L—EGCG(50%-60%)、L—EGC(15%-20%)、L—ECG(10%-15%)和L—EC(5%-10%)。 7药理作用 抗癌： 茶多酚能极强的清除有害，阻断脂质过氧化过程，提高人体内的活性，从而起到抗突变、抗的绿茶。功效据相关资料显示，茶叶中的茶多酚(主要是儿茶素类化合物)，对胃癌、肠癌等多种癌症的预防和辅助治疗均有益处。 防治降、预防及茶多酚对人体有着重要作用。人体的、甘油三酯等含量高，内壁脂肪沉积，血管平滑肌细胞增生后形成动脉粥样化斑块等心血管疾病。茶多酚，尤其是茶多酚中的儿茶素ECG和EGC及其氧化产物茶黄素等，有助于抑制这种斑状增生，使形成血凝黏度增强的纤维蛋白原降低，凝血变清，从而抑制动脉粥样硬化。降血压茶多酚具有较强的抑制转换活性的作用，因而可以起到降低或保持血压稳定的作用。降血糖茶多酚对人体的糖代谢障碍具有调节作用，能降低血糖水平，从而有效的预防和治疗糖尿病。 防治脑中风： 茶多酚有遏制过氧化脂质产生的作用，能消除血管痉挛，保持血管壁的弹性，增加血管的有效直径，通过血管舒张使血压下降，从而有效地防止脑中风。 抗血栓： 血浆的增高可引起红细胞的聚集，血液粘稠度增高，从而促进血栓的形成。另外，细胞膜脂质中磷脂与胆固醇的增多会降低红细胞的变形能力，严重影响微循环的灌注，增加血液粘度，使毛细血管内血流淤滞，加剧红细胞聚集及。 茶多酚对红细胞变形能力具有保护和修复作用，且易与凝血酶形成复合物，阻止纤维蛋白原变成纤维蛋白。另外，茶多酚能有效的抑制血浆及肝脏中胆固醇含量的上升，促进脂类及胆汁酸排出体外，从而有效的防止血栓的形成。现有的降脂抗栓药物多有一定的毒副作用而不易长期服用。茶多酚是茶叶中具有降脂抗栓作用的天然成分，加上其自身所具有的抗氧化特性，使其成为一种新型的功能性保健品。 ①提高免疫能力 通过调节免疫球蛋白的活性，间接实现提高人体综合免疫能力、抗风湿因子、抗菌抗病毒的功效，茶多酚通过提高人体免疫球蛋白总量并使其维持在高水平，刺激抗体活性的变化，从而提高人的总体免疫能力。间接实现抑制或杀灭各种病原体、病菌和病毒的功效。 ②抗变态反应和皮肤过敏反应 茶多酚能强烈的抑制组胺的释放作用，实验证明茶多酚抗变态反应和抗皮肤过敏反应比当前常用的抗过敏药的抑制效果强2~10倍。茶多酚能抑制活性因子如抗体、肾上腺素、酶等引起的过敏反映，对哮喘等过敏性病症有显着疗效。
茶多酚 学名:Camellia sinensis 简称:GTP 别名:茶鞣质、茶单宁 英文名：tea Polyphenol，简称TP 定义:是茶叶中儿茶素类、丙酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称。 成分:可分为黄烷醇类、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素最为重要，约占多酚类总量的60%-80%；儿茶素类主要由EGC、DLC、EC、EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。茶多酚在茶叶中的含量一般在15％－－20％。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70％左右。茶多酚的理化性质 物理性状： 1 外观：棕黄、淡黄或淡黄绿色粉末。 2 性状：易溶于水及乙醇，味苦涩。 稳定性：在PH4-8 稳定。遇强碱、强酸、光照、高热及过渡金属易变质。最高耐热温度在1个半小时内，可达250℃左右，在三价铁离子下易分解。 安全性评价：无毒 茶多酚具有很强的抗氧化作用，其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂BHT、BHA 的4-6倍，是VE的6-7倍，VC的5-10倍，且用量少：0.01-0.03％即可起作用，而无合成物的潜在毒副作用；儿茶素对食品中的色素和维生素类有保护作用，使食品在较长时间内保持原有色泽与营养水平，能有效防止食品、食用油类的腐败，并能消除异味 【药理作用】 1．具有很强的消除有害自由基的作用。 2．抗衰老作用。 3．抗辐射作用。 4．对癌细胞的抑制作用。 5．抗菌、杀菌作用。 6．对艾滋病病毒的抑制作用。 【主要用途】 实际上茶叶的许多作用都是因为茶叶中的茶多酚在起作用。茶多酚可用于食品保鲜防腐，无毒副作用，食用安全。茶叶能够保存较长的时间而不变质，这是其他的树叶、菜叶、花草所达不到的。茶多酚参入其他有机物（主要是食品）中，能够延长贮存期，防止食品退色，提高纤维素稳定性，有效保护食品各种营养成份。其主要用途如下:
植物总多酚常用的含量测定方法有Folin- Ciocalteu 法, 酒石酸亚铁法, 普鲁士蓝法和高锰酸钾法等。 1.福林试液的配制： 取钨酸钠10g与钼酸钠2.5g，加水70ml、85％磷酸5ml与盐酸10ml,置200ml 烧瓶中,缓缓加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂15g、水5ml与溴滴定液1滴煮沸约15分钟，至溴除尽，放冷至室温，加水使成100ml。滤过,滤液作为贮备液。置棕色瓶中,于冰箱中保存。临用前，取贮备液 2.5ml，加水稀释至10ml，摇匀，即得。 用10mL乙醇溶液溶解0.5000g没食子酸，定容至100mL，分别移取3.0mL 到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。加入福林－薛卡多（Folin-Ciocalteu）试剂显色，在765nm波长下测定吸光度。每个浓度做三个平行试验，取平均值，根据标准曲线。 取样品溶液1mL，按照上述的制作方法，测定其吸光度，每个样品做三个平行试验，取平均值，计算样品中的多酚含量。 反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关，在波长760 nm左右有最大吸收。 2. 酒石酸亚铁比色法。 其测定原理是茶多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物。用分光光度法测定其含量。 茶多酚标准溶液的配制称取提取纯品0.2500g,加水溶解定容至250mL,混匀,即为每毫升含1mg提取纯品的标准溶液(mg/mL) 。 茶多酚的含量。茶多酚标准曲线的绘制。分别吸取茶多酚标准溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL 于4 个50mL 容量瓶中,各加水至10mL,再加酒石酸亚铁溶液10mL,加入pH为7. 5的磷酸缓冲液至刻度,混匀后用1㎝比色皿,以空白试剂作参比,于波长540nm处测定吸光度(A) ,绘制出标准曲线。
茶多酚的功能和作用 摘要 茶多酚（TP）是从茶叶中分离提纯出来的多酚类化合物的复合体，大约占茶叶干重的15-30％左右，具有优越的抗氧化能力，并具有降血脂、抑制肿瘤、抑菌抗毒、解酒及保护肝脏、解毒、防止皮肤紫外损伤、抗脂质过氧化等保健功能。茶多酚作为抗氧化剂在肉制品、油炸食品、水产品、食用动植物油脂、焙烤食品、糖果、饮料等多类食品中均有广泛的应用。现代科学研究证明,茶多酚具有抗氧化、清除自由基、增强免疫力、降血糖、降血脂等诸多功效。茶多酚是一种新型的天然抗氧化剂,在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用。本文就茶多酚的保健功能及应用作一概述。 关键词：茶多酚性质及提取营养价值功能成分应用 茶多酚是茶叶中的主要水溶性物质，是茶叶主要功能成分之一，是茶叶中多酚类物质的总称。其多酚分子结构中具有活泼的羟基氢，能终止自由基的连锁反应，清除体内超氧阴离子自由基、防治心血管疾病、抑制肿瘤等优异功能，研究表明：茶多酚卓越的抗氧化性，能阻止和延缓不饱和脂肪酸的自动氧化分解。茶多酚的抗氧化能力是二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)的4—6倍， 是V E 的6—7倍，V C 的5—10倍，而无合成物的潜在毒副作用［1］。我国对茶多酚 的研究始于上世纪五六十年代，到七十年代初己开始专项研究，现在此方面也已处于世界领先水平，确认了茶多酚天然抗氧化剂为我国食品添加剂之一。现今茶多酚的功能引起了各国的广泛重视，成为各工业化国家的技术竞争目标和研究开发热点。 1 茶多酚的性质及提取 1.1 组成 茶多酚可分为黄烷醇类、4-羟基黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。茶多酚在茶叶中的含量一般在15％—20％。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70％左右。 1.2 理化性质 外观：棕黄、淡黄或淡黄绿色粉末。 性质：易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，味苦涩。
朴东日：多酚氧化酶活性的测定。一、试验目的 本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原 理及操作技术。 二、试验原理 酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色 的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生 变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 三、试验材料、试剂及试验用品 材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发 育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯 处理。 药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ １ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚 ４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４） 四、实验方法：
1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。 2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。 3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。 4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
茶多酚的抗氧化作用及其在食品中的应用 摘要:茶多酚是一种天然的食品添加剂,本文介绍了茶多酚的成分和儿茶素的 结构,全面地综述了茶多酚的抗氧化性能茶多酚在油脂、肉制品加工和果蔬保鲜、糕点和糖果以及饮料生产等方面的发展和应用。 关键词:茶多酚;抗氧化作用;食品 Abstract: Tea polyphenols is a natural food additives, ingredients of tea polyphenols and catechin structure, a comprehensive overview of the antioxidant properties of tea polyphenols in tea polyphenols grease, meat processing, and aquatic preservation,the development and application of pastries and candy and beverage production. Key word: tea polyphenols;antioxidation;food 茶多酚是从茶叶中提取的纯天然多酚类物质,又叫茶单宁,茶鞣质,是茶叶中多酚类物质的总称。茶多酚主体成分是儿茶素,占茶叶干物量的20 %一30 % [1]。茶多酚分子结构中具有活泼的羟基氢能终止自由基的连锁反应,捕获过量的自由基,因此是一类理想的天然抗氧化剂。 1 茶多酚的性质和结构 茶多酚在碱性介质中极不稳定,在酸性中则稳定、耐热、与柠檬酸、苹果酸、酒石酸都有较好的协同作用。在潮湿的空气中能被氧化成棕色物,遇铁变成绿黑色络合物,与重金属盐溶液作用生成灰黄色沉淀,也能被高锰酸钾、硫酸铈等氧化剂氧化,与酒石酸铁生成红紫色络合物[2]。 茶多酚的主要成分按其化学结构可分为: 黄烷酮类、花色素类、黄酮醇类、 花白素类、酚酸及缩酚酸类等6类化合物。其中以黄烷酮类(主要是儿茶素类化合物)最为重要,占茶多酚总量的60% ~80% 。其次是黄酮类,其他酚类物质含量比较
设计性实验 茶叶中茶多酚的提取与含量测定 实验方案 新疆农业大学食品科学与药学学院 班级：葡工162班 姓名：王勇峰 学号：220162712 指导老师：阿不都热依木
茶叶中茶多酚的提取与含量测定 一.实验目的及要求 1.用无害溶剂从茶叶中提取茶多酚。 2.分离、纯化茶多酚粗品，掌握溶剂提取法提取茶多酚的原理及方法。 3.定量分析茶多酚产品含量。 二.实验原理 有机溶剂萃取法：有机溶剂萃取法是传统的提取工艺。是利用茶叶中不同化合物在不同溶剂中的溶解度不同进行提取分离。在粗茶叶萃取溶液中，除含有茶多酚以外，还含有咖啡碱、酯质、色素、植物多糖、有机酸、以及悬浮物，且茶多酚含量仅为25%～40% ，所以大多数工艺用乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂反复萃取的方法进一步除杂、纯化、精制。 茶水用氯仿萃取可得到水层和有机层，咖啡碱存在于有机层，而茶多酚则存在于水层中，根据萃取及过滤原理，将有机层和水层分别进行浓缩、萃取，即可得到相应粗产物。 三.实验仪器及药品 仪器：天平；分析天平；铁架台；抽滤装置；超级恒温水浴槽；长颈漏斗一个；滤纸若干张；分液漏斗一个；100毫升的烧杯（三个）；玻璃棒一个；药品： 1.乙醇水溶液（50％）； 2.干茶叶原料； 3.氯仿（分析纯）； 4.Na2SO4溶液馏水
四.实验步骤 1、温度设定:打开超级恒温水浴电源开关，使温度达到90℃ 2、称量：称取30克干茶叶，放在100毫升小烧杯中。 3、溶解：用量筒量取40毫升50％乙醇水溶液，倒入小烧杯中，用玻璃棒轻轻搅拌，使干茶叶完全浸润在乙醇溶液中。 4、加热：将干茶叶和乙醇水溶液的混合液置于超级恒温水浴槽中，加热20分钟。 5、过滤：将加热完毕的混合液取出，冷却到室温； 用长颈漏斗对混合液进行过滤，滤除茶叶残渣。再对残渣进行乙醇萃取. 6、分离萃取： 1)对分液漏斗进行试漏，调整好铁架台高度； 2)用量筒量取20毫升氯仿①，置于100毫升小烧杯中；将茶叶滤液倒入分液漏斗中，再将氯仿倒入其中，再倒入少量Na2So4溶液②，轻轻摇匀，使之混合充分，静置，分层，上层应为茶多酚水溶液，呈茶色，下层为氯仿乙醇混合液，为无色。 3)将下层溶液小心放至小烧杯中，上层溶液从分液漏斗上口倒至100毫升小烧杯中； 7、抽滤浓缩： （1）安装好减压抽滤装置； （2）将布氏漏斗里的滤纸用少量茶多酚水溶液润湿，开启抽气阀，一边缓慢倒入液体，一边抽滤。
1.1溶剂提取法 多酚就是多羟基化合物,它的结构特点决定多酚易溶或可溶于水、醇类、醚类、酮类、酯类等,所以,溶剂提取法主要有水溶剂提取与有机溶剂提取两种。水溶剂提取植物多酚类物质早90年代就有报道,该法由于工艺简便、成本低、纯度高而被广泛使用,但此法提取率低。有机溶剂提取就是利用多酚在不同溶剂中的溶解度不同进行回流提取,常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,此法可提高提取率、缩短反应时间。姚永志[2]等人在比较水溶剂及乙醇溶剂提取花生红衣多酚物质的研究中报道,当以水作溶剂提取花生红衣多酚物质时,最佳工艺:水浴温度40℃、液料比75、提取时间lh、提取率为6.41％,而乙醇作溶剂时最佳工艺:乙醇浓度55％、水浴温度60℃、提取时间0.5 h、料液比1:37.5,提取率达到7.858％。但有机溶剂成本高、回收困难,有毒易燃,不利于安全生产。 1.2微波辅助提取 微波辅助提取技术就是利用微波能来提高提取率的一种技术。在微波提取过程中,微波辐射能 够导致植物细胞内的极性物质吸收微波能,产生大量热量,使细胞内温度迅速上升,液态水汽化,从而使产生的压力在细胞膜与细胞壁上形成微小孔洞,使胞外溶剂可以进入细胞内溶解并释放出胞内物质,因此可以有效的提高产率,降低反应时间,减少溶剂的使用量。由于目前微波的设备比较普遍,因此,微波提取植物多酚的方法为更多的人所接受与使用。宋薇薇等[3]人用微波辅助法提取石榴皮多酚类化合物,确定了石榴皮多酚提取的最优工艺条件:40％(体积分数)乙醇作溶剂,料液比(g:m1)l:35,微波功率为242 W,提取时间60 s,提取三次,以该优化条件提取时,多酚粗提物得率26.52％,这个结果较贾冬英[43以20％(体积分数)乙醇作溶剂,料液比(g:mL)1:20,温度50℃,提取时间1 h,以该优化条件提取所得石榴多酚得率22.86％高,与醇提法相比,微波辅助提取能强化浸取过程,体系受热均匀,提取物中多酚含量高,提取时间较短等优点。 1.3超声波辅助提取 超声波辅助提取法就是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,可加速有效成分进入溶剂,从而提高提取率,缩短提取时间,并可避免高温对提出成分的影响。超声波提取的操作具有简便快捷、提取温度低、时间短、提取率高、提取物结构不易被破坏的特点.该法的缺点就是获得产品纯度不高。陶令霞c5]等人对苹果渣中多酚的超声辅助提取工艺条件进行了优化研究,确定最佳工艺条件为:70％乙醇,提取时间50 min,提取功率200 W,料液比1:15,提取温度35℃,提取2次,苹果多酚得率为4.29g／kg。同时,超声波辅助提取方法在荷叶多酚大麦多酚、以及诃子多酚中也有相应的报道。 1.4生物酶解提取 生物酶解提取技术就是根据酶反应具有高度专一性的特点,选择相应的酶,水解或降解细胞壁组成成分纤维素、半纤维素与果胶,从而破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或交溶于溶剂中,达到提取目的。酶法提取最大的优势就是反应条件温与。由于酶法提取就是在非有机溶剂下进行,所得产物纯度、稳定性、活性都较高,无污染,解决了有机溶剂提取法有机溶剂回收困难、用量大等缺点。此外,酶法提取在缩短提取时闻、降低能耗、降低提取成本等方面也具有一定优势[6]。刘军海等人[7]以低档绿茶为原料,采用复合酶法在较低温度下提取茶多酚。以单因素试验考察了酶用量、提取温度、提取时间及pH对茶多酚提取率的影响。通过正交试验优化并确定最佳提取工艺条件:酶用量为0.20％、提取温度为60℃、提取时间80 min、pH为4.6,在此工艺下茶多酚提取率为13.6％,其中儿茶素占茶叶干重的含量比沸水提取法高出 2.31％。1.5离子沉淀法离子沉淀法就是利用多酚能与金属离子络合生成沉淀,使其在浸提液中与其它物质分离而出,从而得到纯度较高多酚。目前常用金属离子有A13+、Zn2+、Fe2+、M92+、Ba2+、Ca2+等,其中A13+、Zn2+较为理想。离子沉淀法优点就是不使
多酚氧化酶特性研究 摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。 关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。1材料与方法 1.1材料 板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。 1.2试剂与仪器 主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。 主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。 1.3试验方法 1.3.1粗酶液的制备 酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。 1.3.2褐变度( BD) 的检测 称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。沉淀溶于15mL 甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。 将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。 1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测 称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。 1.3.4酶活性的测定 取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。空白用
货号：QS1404 规格：50管/24样 多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。 测定原理： PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体，60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体，40mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体，10mL×1瓶，4℃避光保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）或果汁样本的处理： 按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。 5min 第1页，共2页
1．1溶剂提取法 多酚是多羟基化合物，它的结构特点决定多酚易溶或可溶于水、醇类、醚类、酮类、酯类等，所以，溶剂提取法主要有水溶剂提取和有机溶剂提取两种。水溶剂提取植物多酚类物质早90年代就有报道，该法由于工艺简便、成本低、纯度高而被广泛使用，但此法提取率低。有机溶剂提取是利用多酚在不同溶剂中的溶解度不同进行回流提取，常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，此法可提高提取率、缩短反应时间。姚永志[2]等人在比较水溶剂及乙醇溶剂提取花生红衣多酚物质的研究中报道，当以水作溶剂提取花生红衣多酚物质时，最佳工艺：水浴温度40℃、液料比75、提取时间lh、提取率为6．41％，而乙醇作溶剂时最佳工艺：乙醇浓度55％、水浴温度60℃、提取时间0．5 h、料液比1：37．5，提取率达到7．858％。但有机溶剂成本高、回收困难，有毒易燃，不利于安全生产。 1．2微波辅助提取 微波辅助提取技术是利用微波能来提高提取率的一种技术。在微波提取过程中，微波辐射能够导致植物细胞内的极性物质吸收微波能，产生大量热量，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化，从而使产生的压力在细胞膜和细胞壁上形成微小孔洞，使胞外溶剂可以进入细胞内溶解并释放出胞内物质，因此可以有效的提高产率，降低反应时间，减少溶剂的使用量。由于目前微波的设备比较普遍，因此，微波提取植物多酚的方法为更多的人所接受和使用。宋薇薇等[3]人用微波辅助法提取石榴皮多酚类化合物，确定了石榴皮多酚提取的最优工艺条件：40％(体积分数)乙醇作溶剂，料液比(g：m1)l：35，微波功率为242 W，提取时间60 s，提取三次，以该优化条件提取时，多酚粗提物得率26．52％，这个结果较贾冬英[43以20％(体积分数)乙醇作溶剂，料液比(g：mL)1：20，温度50℃，提取时间1 h，以该优化条件提取所得石榴多酚得率22．86％高，与醇提法相比，微波辅助提取能强化浸取过程，体系受热均匀，提取物中多酚含量高，提取时间较短等优点。 1．3超声波辅助提取 超声波辅助提取法是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速有效成分进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间，并可避免高温对提出成分的影响。超声波提取的操作具有简便快捷、提取温度低、时间短、提取率高、提取物结构不易被破坏的特点．该法的缺点是获得产品纯度不高。陶令霞c5]等人对苹果渣中多酚的超声辅助提取工艺条件进行了优化研究，确定最佳工艺条件为：70％乙醇，提取时间50 min，提取功率200 W，料液比1：15，提取温度35℃，提取2次，苹果多酚得率为4．29g／kg。同时，超声波辅助提取方法在荷叶多酚大麦多酚、以及诃子多酚中也有相应的报道。 1．4生物酶解提取 生物酶解提取技术是根据酶反应具有高度专一性的特点，选择相应的酶，水解或降解细胞壁组成成分纤维素、半纤维素和果胶，从而破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或交溶于溶剂中，达到提取目的。酶法提取最大的优势是反应条件温和。由于酶法提取是在非有机溶剂下进行，所得产物纯度、稳定性、活性都较高，无污染，解决了有机溶剂提取法有机溶剂回收困难、用量大等缺点。此外，酶法提取在缩短提取时闻、降低能耗、降低提取成本等方面也具有一定优势[6]。刘军海等人[7]以低档绿茶为原料，采用复合酶法在较低温度下提取茶多酚。以单因素试验考察了酶用量、提取温度、提取时间及pH对茶多酚提取率的影响。通过正交试验优化并确定最佳提取工艺条件：酶用量为0．20％、提取温度为60℃、提取时间80 min、pH为4．6，在此工艺下茶多酚提取率为13．6％，其中儿茶素占茶叶干重的含量比沸水提取法高出2．31％。1．5离子沉淀法离子沉淀法是利用多酚能与金属离子络合生成沉淀，使其在浸提液中与其它物质分离而出，从而得到纯度较高多酚。目前常用金属离子有A13+、Zn2+、Fe2+、M92+、Ba2+、Ca2+等，其中A13+、Zn2+较为理想。离子沉淀法优点是不使用大量有机溶剂，工艺较简单，生产安全性好，在一定程度上可降低能耗，部分
多酚氧化酶在食品中的研究进展 摘要：多酚氧化酶（PPO）存在于许多种类的食品中，是引起食物褐变的主要因素，酶促褐变严重影响了食品的感官品质，使得食品的保质期缩短和价值显著降低，不少新鲜食品的销售市场因此受到限制[1]。本文介绍了多酚氧化酶的酶学性质以及相应的抑制方法，并对其应用做出论述。 关键词：多酚氧化酶；性质；抑制方法；应用 多酚氧化酶（PPO）是自然界中分布十分广泛的一类末端氧化酶，属于铜金属酶类，其化学性质稳定，是植物叶子、果实等发生褐变的主要作用酶类[2]。此外，还会引起食品的褐变，损害食品的感官风味质量[3-4]。PPO普遍存在于植物、昆虫和真菌之中，甚至在腐烂的植物残渣上都还可以检测到它的存在。因此该酶与果蔬的加工品质密切相关，科学家们很早就开始对它进行深入彻底的研究[5-6]。 农产品的酶促褐变与多酚氧化酶活性和含量密切相关。这方面研究很多，酶促褐变不仅影响产品外观、风味、营养和加工性能，而且大大降低耐贮性，尤其对肉色较浅且容易碰伤的水果和蔬菜影响更为严重，产生的经济损失更大[7-9]。通常PPO 与底物被区域化分开，PPO 在质体中以潜伏状态存在，而PPO 的底物存在于液泡中。只有当植物体内发生生理紊乱或组织受损时，PPO 与底物的亚细胞区域化才被打破，PPO 底物被激活产生黑色或褐色的沉积物，这是果蔬等农产品酶促褐变的主要原因[10]。 1、多酚氧化酶的酶学性质 与多酚氧化酶酶学性质的主要研究内容有：酶的分离和纯化、测定酶促反应的速度、了解影响酶促反应的因素等等[11]。 在分离和纯化时，一般是进行纯化，再将纯度高的PPO酶液进行酶学的性质研究[12-13]。PPO活性检测则一般通过测定产物生长速度（初速度）来测定，通过采用分光光度法，即在一定波长下测定从醌生成的色素的吸光度，再根据吸光度来定义酶的活性大小[14]。目前，已知的影响PPO酶促反应速度的因素主要有：温度、同一底物不同浓度、不同的底物、pH值、激活剂、抑制剂等[15]。