以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲
养层的比较
作者：刘永刚，李芳菲，陈地龙，王莎莉，王亚平
【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类Comparison between STO cells and hELF used as feeder layers of embryonic germ cells
【Abstract】 AIM: To compare the influence on the growth of human embryonic germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain resistant (STO) cells and human embryonic lung fibroblasts（hELF）respectively as feeder layers and the changes of the two kinds of the feeder layers themselves processed with mitomycin C. METHODS: We isolated and cultured hELF of 3-4 month embryos. The changes of the two kinds of the feeder layers themselves treated with mitomycin C were observed. STO and hELFs erved as feeder layer to cultivate human EG cells.The formation rate of embryonic germ cell colony and the expression of EG cell surface markers(SSEA1, SSEA4) expression were detected. to discuss the influence on human EG cell growth. RESULTS: HELF treated by mitomycin C survived longer than STO cells treated by mitomycin C did. There was no obvious difference between the two kinds of feeder layers in the formation rate and immunologic markers (SSEA1, SSEA4) of EG cell colony. CONCLUSION:
HELF as feeder layers is better than STO cells in culturing EG cells.
【Keywords】 STO cells; embryonic lung fibroblasts; embryonic germ cells; humans
【摘要】目的：比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化. 方法：分离、培养3~4 mo hELF，观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化，以STO细胞和hELF 作为饲养层培养人EG细胞，计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4). 结果：经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长，形态维持更好；以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞，集落形成率没有明显差异；两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异. 结论：在培养人EG细胞时，hELF饲养层较STO 细胞饲养层更有优势.
【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类
0引言
自1998年Thomason等［1］首次建立人胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)系和Shamblott等［2］建立人胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EG)系以来，胚胎性干细胞研究已成为当今生命科学领域内的热门课题. 胚胎性干细胞作为组织工程的种子细胞，将为细胞、
组织甚至器官替代治疗提供无限细胞来源，也将为临床治疗模式带来革命性变革［3］. 谢松涛等［4］也对人胚胎生殖嵴来源的人EG细胞进行了培养，但迄今为止，来源于人胚胎生殖嵴的EG细胞系仅有一例报道. 有学者认为STO细胞在建立人EG细胞系过程中具有不可替代的作用. 由于STO 细胞是来源于鼠的成纤维细胞系，用STO细胞作为饲养层将会给临床应用带来潜在的危险. 我们用STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast, hELF）作为饲养层培养人EG细胞，旨在探讨两种饲养层经丝裂酶素C处理后的变化和对EG细胞生长的影响.
1材料和方法
1.1材料高糖DMEM培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）购自GIBICO公司；无钙镁磷酸缓冲液 (Dulbeccos phosphate buffered saline, DPBS)、非必需氨基酸、二甲基亚砜、优质胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、β巯基乙醇、毛喉素（Forskolin）购自Sigma公司；丝裂霉素C 购自Kyowa Hakko Kogyo 公司；胶原酶购自上海桥源生物制药公司； DNA酶Ⅰ购自Roche公司；人重组碱性成纤维细胞生长因子(human recombinant basic fibroblast growth factor, hrbFGF) 购自Pepro Tech EC公司；人重组白血病抑制因子(human recombinant leukemia inhibitory factor, hrLIF)购自CHEMICON公司；抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)mAb和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)mAb由美国芝加哥大学Dr. Bruce Lahn提供；UltrasenstinveTM SP试剂盒购自迈新公司；
DAB显色试剂盒购自中山公司；6～11 wk人工流产胚胎（重庆医科大学第二临床学院人流室同意提供）用于分离人EG细胞；3～4 mo胚胎用于制备hELF；STO细胞由本室保存.
1.2方法
mo人工流产胚胎肺组织，按照薛庆善等的方法分离获取hELF，常规方法培养传代，经反复传代获得纯化的hELF. 取对数生长期hELF，用终浓度为12.5 μg/mL丝裂霉素C处理2.5～3 h；DPBS 洗3次； 2.5 g/L胰酶消化2 min；DPBS洗3次；以细胞浓度为2×105/mL种植在1 g/L明胶处理后的24孔培养板中，每孔1 mL；置37℃，95%湿度和50 mL/L CO2恒温细胞培养箱中培养，4 h后吸去培养液和尚未贴壁的细胞，换入等量培养液，置培养箱中备用，1 wk内均可使用.
，用终浓度为10 μg/mL丝裂霉素C按上述方法处理备用.
wk胚胎生殖嵴用DPBS冲洗3次；400 U/mL的胶原酶0.5 mL, 37℃下消化45 min；灭菌加样枪反复吹吸，将生殖嵴离散为小细胞团；
1 g/L的胰蛋白酶和0.
2 g/L EDTA溶液，37℃下消化5 min；加入等体积含100 mL/L胎牛血清的培养液终止反应；加入200 U的DnaseⅠ作用10 min；轻柔吹打使细胞分离，胚胎干细胞培养液重悬后以1×105, 1×10, 1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF细胞饲养层，胚胎干细胞培养液包含800 mL/L高糖DMEM, 200 mL/L胎牛血清,2 mmol/L L谷胺酰氨,0.1 mmol/L非必需氨基酸,0.1 mmol/L 2巯基乙醇,10 μmol/L Forskolin, 2 μg/mL hrbFGF, LIF 10×105 IU/L, 10
×104 IU/L青霉素和10×104 IU/L链霉素. 置50 mL/L CO2, 95%湿度,37℃恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基.
d，在倒置相差显微镜下观察两种饲养层细胞的形态变化. 倒置相差显微镜下观察在STO细胞饲养层和hELF饲养层上人EG细胞集落形态.
, 1×104, 1×103/mL的细胞悬液，分别种植于STO细胞和hELF饲养层上，每种细胞浓度种植4个复孔. 置于37℃, 50 mL/L CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基. 计算集落形成率，即4个复孔形成集落总数与种植细胞总数之比.
，40 g/L多聚甲醛固定15~20 min；经PBS洗3次；按免疫组化SABC法检测细胞表面抗原SSEA1和SSEA4（一抗工作浓度为1∶50）. 设不加一抗组为阴性对照组.
统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS12.0进行方差分析F检验. 显著性水平α=0.05, P<0.05为有显著性差异.
2结果
2.1hELF体外生长与传代原代培养时所得细胞，细胞形状多种多样. 传代细胞至第3～5代时细胞形态基本一致，以长梭形成纤维样细胞为主，细胞排列成为放射状、漩涡状或栅栏状（图 1A）. 将其反复传至第45代，在第5～30代时生长最旺盛，平均3~4 d达到汇合；第31～45代时平均5~6 d达到汇合，形态无显著变化.
2.2丝裂霉素C处理后STO细胞和hELF形态变化用人ES生长培养液培养STO细胞和hELF饲养层，培养48 h观察，STO细胞的
培养液变黄，而人hELF的培养液颜色没有明显改变. 不更换培养液，培养72 h后，少部分STO细胞浮起，细胞内可见颗粒状物形成；培养超过6 d，大部分细胞浮起. 每3 d更换一次培养液，STO细胞培养5 d后有部分细胞浮起，细胞内出现颗粒状物（图 1B）. 而人hELF，培养7 d未见细胞浮起，细胞形态未见明显改变，并可维持14 d（图 1C）.
2.3两种饲养层细胞对胚胎生殖细胞集落形成的影响人胚胎生殖嵴细胞以1×105，1×104，1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF饲养层上，培养7 d后观察计数. 结果显示：以1×104/mL 组，集落形成最多，集落形态典型 (图2A，B);1×103/mL组，集落形成数量最少；1×105/mL组，可见较多集落分化，集落细胞质中有颗粒样物出现,饲养层细胞和胚胎生殖细胞容易卷折. 以相同浓度种植胚胎生殖嵴细胞，两种饲养层细胞对人EG细胞集落形成率没有显著性差异.
A: 丝裂霉素C处理前hELF； B: 丝裂霉素C处理STO细胞后培养7 d；C: 丝裂霉素C处理hELF后培养7 d.
图1丝裂霉素C处理前后hELF和STO细胞×400（略）
A: hELF饲养层上EG细胞集落；B: STO细胞饲养层上EG细胞集落.
图2STO细胞和hELF饲养层上的EG细胞集落×400（略）
2.4人胚胎生殖细胞集落免疫学特征经检测集落表面抗原SSEA1和SSEA4，显示两种饲养层细胞上培养的人胚胎生殖细胞集落均表达SSEA1和SSEA4（图3A，B）.
A: hELF饲养层上表达SSEA1集落；B: STO细胞饲养层上表达SSEA4集落.
图3胚胎生殖细胞集落表达SSEA1和SSEA4×400（略）
3讨论
饲养层是建立和维持人胚胎性干细胞系未分化状态的必要条件. 迄今为止，己分离得到的非人灵长类和人胚胎性干细胞系无一不是在有饲养层条件下建立和维持的，在无饲养层的情况下，人ES, EG 细胞毫无例外地分化为多种细胞类型. 目前已建立的人胚胎性干细胞系都以鼠源性胚胎成纤维细胞为饲养层［5］. 有报道称用人源性饲养层，如人胚胎皮肤和肌肉细胞、输卵管细胞和人骨髓基质细胞，也能维持人ES细胞体外增殖和保持其未分化状态，由于上述饲养层存在来源、体外增殖能力低等问题而在应用中受限［6-8］. 而在仅有的一例关于人EG细胞系的建系报道中，用MEF作为饲养层却是不成功的，因而有学者认为ST0细胞饲养层在人EG细胞建系中具有不可替代的作用. 这―结论是很难解释的，因为仅有一例报道，尚不能确定其他饲养层在人EG细胞建系中的确切作用，尤其是人胚胎成纤维细胞饲养层.
我们的研究结果显示： 1×104/mL接种的生殖嵴细胞在两种饲养层上形成的人EG集落最多，且经过对集落的表面标志物SSEA1和SSEA4的检测证实所形成的集落为人EG细胞集落. 但是以STO细胞作为饲养层和以hELF作为饲养层之间对EG集落形成率并无显著性差异. 提示两种饲养层都能较好支持人EG细胞的生长和克隆的形成. 以1×105/mL和1×103/mL接种的生殖嵴细胞形成的EG集落数量较
少，而两种饲养层之间EG集落形成率没有显著性差异，提示以1×105/mL浓度种植的胚胎生殖嵴细胞浓度大，细胞生长过快，尤其是胚胎生殖嵴中的其它细胞生长快，容易和饲养层细胞一起卷折，不利于胚胎生殖细胞集落的形成. 还由于胚胎生殖细胞集落培养体系的营养供给不足，造成部分集落分化. 而种植浓度太低，也不利于集落的形成. 因此以1×104/mL作为最佳的种植浓度，且最有利集落的形成.
以STO细胞和hELF细胞作为饲养层分离、培养人EG细胞，hELF饲养层有以下优点：① hELF与人EG细胞相同种属，不会引入异种蛋白和动物源性病原微生物，更有利今后临床应用；②经过丝裂霉素C处理后，能在体外培养达14 d依然维持较好的生长状态. ③hELF能体外连续传代50代以上，较鼠胚胎成纤维细胞、成人骨髓基质细胞等明显长，且经过多次传代后细胞均一，同质性高，有利于对其培养体系的精确分析. 不足的是，迄今为止，没有利用hELF细胞饲养层建立人EG细胞系的报道.
【参考文献】
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专题2细胞工程 一、选择题 1.运用下列各种细胞工程技术培育生物新品种,操作过程中能形成愈伤组织的是( )。 ①植物组织培养②植物体细胞杂交③动物细胞培养 ④转基因植物的培育 A.①②③ B.①②④ C.①③④ D.①②③④ 2.生物技术的发展速度很快,已灭绝生物的“复生”将不再是神话。如果世界上最后一只野驴刚死亡,以下较易成功“复生”野驴的方法是( )。 A.将野驴的体细胞取出,利用组织培养技术,经脱分化、再分化,培育成新个体 B.将野驴的体细胞两两融合,再经组织培养培育成新个体 C.取出野驴的体细胞核移植到母家驴的去核卵细胞中,经孕育培育成新个体 D.将野驴的基因导入家驴的受精卵中,培育成新个体 3.下列关于细胞工程的叙述,错误的是( )。 A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D.某种植物甲、乙两品种的体细胞杂种与甲、乙两品种杂交后代的染色体数目相同 4.用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织,下列叙述错误的是( )。 A.该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的 B.该愈伤组织的细胞没有全能性 C.该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成的 D.该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 5.名为“我的皮肤”的生物活性绷带自从在英国诞生后,给皮肤烧伤病人带来了福音。该活性绷带的原理是先采集一些细胞样本,再让其在特殊的膜片上增殖。5~7天后,将膜片敷在患者的伤口上,膜片会将细胞逐渐“释放”到伤口,并促进新生皮肤层生长,达到加速伤口愈合的目的。下列有关叙述中,不正确的是( )。 A.“我的皮肤”的获得技术属于动物细胞工程 B.人的皮肤烧伤后会因人体第二道防线的破坏而导致免疫力下降 C.种植在膜片上的细胞样本最好选自患者本人 D.膜片能否把细胞顺利“释放”到伤口,加速患者自身皮肤愈合与细胞膜上的糖蛋白有关 6.既可用于DNA重组技术又可用于细胞融合技术的是( )。 A.病毒 B.纤维素酶 C.聚乙二醇 D.质粒 7.培育农作物新品种的过程中,常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是( )。 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 B.在植物组织培养过程中用理化因素诱导可获得大量有益突变体 C.单倍体育种中经减数分裂和组织培养两个过程能获得纯合二倍体 D.植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性 8.下列与细胞工程技术相关的表述中,不正确的是( )。 A.植物体细胞杂交技术可以克服常规的远缘杂交不亲和障碍 B.动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分基本相同 C.动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同 D.植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性 9.经植物组织培养技术培养出来的植物一般很少有植物病毒危害,其原因在于( )。 A.在组织培养过程中经过了脱分化和再分化,进行的是快速分裂和分化
名称解释 细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。 组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。有时泛指所有的体外培养。 器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。 无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。 完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。 接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。 无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。 不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。原因：培养条件变化使分化发生阻抑 细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量 细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
细胞模拟试题及答案 一、填空（每空一分，共25分） 1.实验室的物理防护是由隔离的设备、实验室的设计、实验实施等三个方面组成，根据其密 封程度的不同，分为P1、P2、P3、P4四个生物安全等级。典型的P4实验室由更衣区、过滤区、缓冲区、消毒区、核心区组成。 2.细胞系是原代培养经初步纯化获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一细胞 群体。 3.细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群。 4.干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的增殖特性为缓慢性和自稳性。 5.培养细胞的生长特点为贴附、接触抑制和密度抑制。 6.植物细胞培养的原理是基于动物细胞的全能性。 7.植物细胞悬浮培养的方法为分批培养法、连续培养法和半连续培养。 8.植物组织培养中培养材料的消毒过程中，消毒的基本原则是既要杀死附着其上的微生物又 不损伤材料。 9.细胞生长测定的一般方法为：细胞计数、测定细胞密实体积、细胞鲜重或干重。 10.体外培养的细胞根据其生长方式主要分为贴附型细胞和非贴附型细胞。 11.人工种子的组分包括胚状体、人工胚乳和人工种皮。 12.细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合几 个步骤。其中细胞桥形成是最关键的一步。 13.花粉单倍体植株的鉴定方法有形态鉴定、细胞学鉴定、杂交鉴定、分子标记鉴定。 14.胚胎工程主要是对哺乳类动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育， 获得人们所需要的成体动物。 15.人工诱导单倍体形成的方法包括：远缘杂交、延迟授粉、核置换、射线照射、花药培养等。 二、单项选择题（每题1分，共10分） 1.人参皂甙粉是人参中重要的药用成分，以前只能从人参中提取产量极低，因而价格昂贵。 目前人参皂甙粉可以通过下列哪项技术迅速大量获取（B） A．基因工程 B．植物组织培养 C．植物体细胞杂交 D．发酵工程
人的生殖和胚胎发育教学设计 第三节 一、教学设计思路 本节的内容是生殖，主要介绍了男性生殖细胞、女性生活细胞和受精卵的形成。在教学时，教师和学生容易受到传统观念影响，而且学生对生殖的知识会有兴趣，但是获得途径很有限。因此，认真上好本节课就具有重大意义。在教学过程中，可以配合挂图的使用，消除学生的神秘感。 二、教学目标 知识目标 说出精子的产生过程。 说出卵子产生的部位。 说出男女做绝育手术的原理。 能力目标 解释男女做绝育手术后不会影响身体健康，并向周围人宣传。 情感目标 通过生殖系统的结构及功能的学习，进一步树立结构和功能相适应的辨证观点。 通过讲解有关生殖内容，初步形成科学的性知识。 生殖知识也是重要的科学知识，培养严肃认真对待科学
的积极态度。 三、重点难点 绝育手术不会影响健康的原因。 四、教学媒体 男性生殖系统挂图，女性生殖系统挂图，精子挂图，卵细胞挂图，排卵、受精、受精卵分裂、着床过程示意图挂图 五、课时建议 课时 六、教学过程 引入 大家知道我们人类是在多少年前产生的吗？ 大家说的都很对，这个问题科学界还没有统一的说法，根据不同的标准也可能有一定差异，但是有一件事是肯定的：人类出现至少有三四十万年了。 那么，我们人类是怎么生生不息繁衍下来的呢？这是因为我们人类和其他的生物一样有生殖功能。 受精→受精卵发育→胎儿分娩 教学 那么，生殖是什么呢？请一位同学说一说自己的认识。我们可以参考课本得到一下定义： 生殖是指产生生殖细胞、并繁殖新个体的过程。 男性生殖细胞
男性的生殖细胞叫做精子，我们来观察观察精子有什么特征呢？ 展示精子挂图。 请几位同学描述。 教师总结出精子的特点：体积小，形如蝌蚪，有头和颈，还有一条长尾，善于游动。 展示男性生殖系统挂图。 结合挂图讲解男性生殖系统的结构和功能。 结合挂图讲解男性绝育手术结扎的部位，说明这样只是阻止了精子的排出，不会影响腺体的功能和身体健康。 女性生殖细胞 展示“卵细胞”挂图。 讲述：女性产生的生殖细胞叫卵细胞。卵细胞是人体内最大的细胞，有针尖那么大，也是人的肉眼唯一可以看见的人体细胞。卵细胞内有很多的营养物质——卵黄。这些营养物质共给受精卵发育用。 那么，卵细胞是在哪里产生的呢？ 展示女性生殖系统挂图。 结合挂图讲解：卵细胞产生于女性的卵巢。卵巢是女性的性腺，能分泌雌性激素。卵细胞自卵巢产生并成熟后，由卵巢排出，进入输卵管。 女性做绝育手术是结扎输卵管，卵细胞也可以在体内自
阶段质量检测(二) 细胞工程 (时间:4５分钟,满分:10０分) 一、选择题(每小题3分,共45分) 1、下列生物工程技术中,不属于细胞工程得就是( ) A.通过试管动物大量繁殖优良动物 Ｂ.利用含有人胰岛素基因得大肠杆菌生产胰岛素 C.通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D、将某人得肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系 2。下列关于植物体细胞杂交技术得叙述,错误得就是( ) A.获得原生质体得过程需要用到纤维素酶与果胶酶 B.利用植物体细胞杂交可以获得某种多倍体植株 C.植物体细胞杂交过程就就是原生质体融合得过程 Ｄ。可根据细胞中染色体数目与形态得差异来鉴定杂种细胞 3.植物体细胞杂交制备原生质体与动物细胞培养配制一定浓度得细胞悬浮液,所需要得酶依次就是( ) Ａ.淀粉酶与磷脂酶 B.纤维素酶与胰蛋白酶 C.脂肪酶与二肽酶 Ｄ。过氧化氢酶与半乳糖苷酶 ４.下列有关单克隆抗体制备得叙述,正确得就是( ) A.先利用特定得抗原蛋白饲喂小鼠,再从小鼠脾脏中分离B淋巴细胞 B。为避免病毒感染,只能用聚乙二醇、电激等处理来诱导骨髓瘤细胞与已免疫得B淋巴细胞融合 Ｃ.体外培养杂交瘤细胞需要在培养液中添加动物血清与抗生素 D.经过选择培养基初次筛选得杂交瘤细胞即可进行体内或体外培养 5。(全国高考)关于动物细胞培养与植物组织培养得叙述,错误得就是( ) A.动物细胞培养与植物组织培养所用培养基不同 Ｂ.动物细胞培养与植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C、烟草叶片离体培养能产生新个体,小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖 D。动物细胞培养可用于检测有毒物质,茎尖培养可用于植物脱除病毒 ６。细胞工程中,选择合适得生物材料就是成功得关键、下列选择不合理得就是( ) A、选择高度分化得动物体细胞进行培养有利于获得大量细胞 Ｂ。选择胚胎细胞作为核供体进行核移植可提高克隆动物得成功率 Ｃ、选择一定大小得植物茎尖进行组织培养可获得脱毒苗
生技28、查找阅读有关生物技术的英文文献并翻译成中文一、名词解释 Plasmid 目的基因 单克隆抗体技术 细胞融合 基因库 问答题：
1.疾病基因治疗有哪四大策略，肿瘤的基因治疗主要有哪两种策略？ 2.从cDNA文库和基因文库中获得目的基因有什么不同？ 3.如何从一片嫩叶经组织培养培育出众多的完整植株？ 4.开展干细胞研究对人类有何积极的意义？ 5.为什么说干细胞的应用将具有广泛的前景？ 6.人类基因组计划任务是什么？将解决什么问题？它对医学的发展有什么影响？ 7.生物法处理污水或废水有哪几种常见方法？污水治理的意义何在？ 8.空气污染治理与水污染治理有什么关系，常见的方法有哪几种 9.什么事生物修复技术，方法，举例说明其应用价值 10. 生物技术对经济社会发展的影响，试举例说明。
第二部分综合练习 一、单项选择题 4. 下面哪个不是生物技术包括的基本内容？ 细胞工程基因工程遗传工程酶工程 1、现代生物技术是一项高新技术，它具有高新技术的“六高”特征，下面哪个不属于“六高”？ A、高效益 B、高风险 C、高势能 D、高效率 2、生物技术是以下面哪个为核心？ A、基因工程 B、细胞工程 C、酶工程 D、发酵工程 3、分子克隆主要是指 A、DNA的大量复制 B、DNA的大量转录 C、DNA的大量剪切 D、RNA的大量反转录 4、多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为 A、平头末端 B、3突出末端 C、5突出末端 D、粘性末端 5、设计聚合酶链反应的引物时，应考虑引物与模板的 A、5…端特定序列互补 B、5?端任章序列互补 C、3…端特定序列互补 D、3?端任意序列互补 6、用于鉴定转化于细胞是否含重组DNA的最常用方法是 A、抗药性选择 B、分于杂交选择 C、RNA反转录 D、免疫学方法 7、下列哪些是发酵技术独有的特点 A、多个反应不能在发酵设备中一次完成 B、条件温和、能耗少、设备简单 C、不容易产生高分子化合物 D、发酵过程中不需要防止杂菌污染 8、不是工业生产上常用的微生物为 A、担子菌 B、细菌 C、酵母菌 D、霉菌 9、机械搅拌发酵罐与通风搅拌发酵罐相比，下列不属于前者特点的是 A、发酵罐内没有搅拌装置，结构简单 B、发酵罐内有搅拌装置，混合速度快 C、耗能少，利于生产 D、发酵罐内没有搅拌装置，结构复杂 10、从微生物细胞制备酶的流程一般包括破碎细胞、溶剂抽提、离心、过滤、干燥这几 个步骤。
细胞工程练习题 一．选择题 1. 在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需 要的 A．消毒灭菌B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素 2. 下列关于植物组织培养的叙述中，错误 ．．的是 A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 3．我国科学工作者曾成功地将分别属于两个科的植物----烟草和菠菜杂交成功，从而获得一种新型的烟草品种。在此过程中，下列操作不．是必需的是 A．杂交前要除去两种细胞的细胞壁 B．原生质体融合前要先脱分化 C．原生质体融合后，要选出烟草----菠菜融合细胞加以培养 D．要诱导愈伤组织进行再分化 4．下图是“白菜—甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是 A．所得到的“白菜—甘蓝”植株不能结籽 B．愈伤组织是已高度分化的细胞 C．上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂等过程 D．诱导原生质体融合时可用聚乙二醇 5．下面是将四倍体兰花的叶片通过植物组织培养形成植株的示意图，相关叙述中正确的是 A．②阶段会发生减数分裂过程B．①阶段需生长素而③阶段需细胞分裂素C．此过程体现植物细胞具有全能性D．此兰花的花药离体培养所得植株为二倍体6．下图为将胡萝卜的离体组织在一定条件下培育形成试管苗的过程示意图。有关叙述正确的是 A. 利用此过程获得的试管苗可能为杂合子 B．①②过程中都会发生细胞的增殖和分化 C. 多倍体植株的培育需经过如图所示过程 D．此过程依据的生物学原理是细胞膜具有流动性 7. 各项培育植物新品种的过程中，不经过愈伤组织阶段的是 A．通过植物体细胞杂交培育白菜——甘蓝杂种植株 B．通过多倍体育种培育无子西瓜 C．通过单倍体育种培育优质小麦 D．通过基因工程培育转基因抗虫水稻 8. 作物新品种的过程中，常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 ③ ② ① 四倍体兰花叶片愈伤组织胚状体植株
第十三章胚胎细胞命运的决定 一、选择题： （）1.在马蛔虫的卵裂中，不产生染色体消减的细胞将形成。 A.黄色新月； B.原生殖细胞； C.极叶； D.体细胞。 （）2.人桑椹胚细胞将分化成滋养层细胞还是内细胞团细胞由决定。 A.胚胎细胞的基因； B.差异的基因表达； C.细胞所在的位置； D.初级诱导。 （）3.卵质决定子指的是 A.卵生mRNA； B.卵生mRNA和蛋白质； C.卵子中蛋白质； D.未受精卵中的蛋白质。 （）4.极叶中的卵质决定子促使极叶 A.产生内胚层； B.产生外胚层； C.产生中胚层； D.形成生殖细胞。 （）5.在海鞘受精卵的黄色新月中，含有的决定子。 A.生殖细胞； B.伸进细胞； C.上皮细胞； D.肌肉细胞。 （）6.极质中含有细胞的决定子。 A.生殖细胞； B.伸进细胞； C.上皮细胞； D.肌肉细胞。. （）7.体节的分化与以下哪一类信息无关？ A.伸进管发出的信息； B.脊索发出的信息； C.侧板中胚层发出的信息； D.内胚层发出的信息。 （）8.果蝇小眼Ｒ７细胞的分化与下列哪一基因有关？ A.bride-of-sevenless； B.BMP7； C.sonic hedgehog；
D.Wnt。 （）9.昆虫体节的发育受到以下哪一基因的调节？ A.HOM基因； B.Hox基因； C.bicoid基因； D.dorsal基因。 （）10.脊椎动物脊椎骨的发育与何基因有关？ A.HOM基因； B.Hox基因； C.bicoid基因； D.dorsal基因。 二、判断题： （）1.在人的桑椹胚阶段，胚胎细胞所在的位置决定了该细胞将分化成滋养层细胞还是内细胞团的细胞。 （）2.在马蛔虫的卵裂中，凡是产生染色体消减的细胞都将形成生殖细胞。（）3.软体动物胚胎的极叶中含有中胚层器官的决定子。 （）4.脊椎动物体节的发育受到其周围组织发出的信号的影响。 （）5.同源异型基因调节昆虫体节的发育。 （）6.Hox基因调节脊椎动物肢体的发育。 三、填空题： 1.胚胎细胞的分化与卵裂过程中分配到细胞中的有关。 2.被囊动物胚胎中的黄色新月与胚胎的组织的形成有关。 3.胚胎原生殖细胞的形成与卵子中的一种卵质决定子有关。 4.Hoxa基因、Hoxb基因、Hoxc基因和Hoxd基因都与脊椎动物的发育有关。 5.HOM基因指导昆虫的发育。 6.Ｒ７细胞的分化与和这两种基因有关。 四、名词解释： 1.卵质决定子 2.黄色新月 3.极叶 4.生殖质 5.染色体消减现象 6.极质 7.P颗粒 8.同源异型基因 五、问答题： 1.试以软体动物卵裂中出现的极叶为例，说明卵质决定子在细胞分化中的作用。 2.生殖质在发育中有何作用？请举例说明。
细胞工程学名词解释及问答题 一、名词解释 1、细胞工程（cytotechnology或cell engineering）：它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 或应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 2、看护培养（nursing culture）：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。 3、细胞杂交（cell hybridization）：指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。 4、外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的植物组织、器官等材料。 5、人工种子：是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 6、花药培养（anther culture）：将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。（指离体培养花粉和花药，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株，使之二倍化的细胞工程技术。 7、条件培养基(conditioned medium)：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。 8、植物脱毒：由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。 9、原代细胞系：指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。 10、体细胞杂交：指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 11、胚胎培养：是指胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 12、互补选择：是指利用两个亲本具有不同的遗传和生理特征，在特定培养条件下，具有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 13、悬浮培养(suspension culture):是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 14、植板率:植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。 15、玻璃化冻存：是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。 16、接触抑制(contact inhibition)：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。 17、非对称融合（aymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。 18、对称融合（symmetric fusion）：两个完整的细胞原生质体融合。 19、胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 20、体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。 21、永久细胞系：大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，在体外永久存活下来发育成永久细胞系或称连续细胞系。
第八章生殖系统 一、单选题( 每题仅有一个最佳答案) 1、下列哪一项临床表现与子宫发育畸形无关？( ) A、原发性闭经 B、不孕 C、习惯性流产 D、难产 E、子宫内膜息肉 2、关于卵巢无性细胞瘤,下列哪一项就是错误的？( ) A、卵巢恶性生殖细胞实性肿瘤 B、常见于儿童及青年妇女 C、肿瘤彩色多普勒血流显像可显示丰富血流 D、卵巢实性良性肿瘤 E、卵巢少见肿瘤 3、子宫体与子宫颈的比例在生育期为( ) A、1:1 B、1:2 C、1:3 D、2:1 E、3:1 4、MRI矢状面显示子宫前壁向外局限性隆起的就是( ) A、子宫体癌 B、子宫腺肌症 C、子宫浆膜下肌瘤 D、子宫粘膜下肌瘤 E、子宫先天性畸形 5、下列多正常妊娠期说法错误的就是( ) A、妊娠期从末次月经第一天算起,共40周 B、临床将妊娠过程分为三个期 C、早期妊娠为12周以前 D、中期妊娠为27周以前 E、晚期妊娠为28-42周 6、关于卵巢囊腺瘤的说法,不正确的就是( ) A、多见于育龄妇女 B、CT扫描不能区分浆液性或粘液性 C、CT扫描一般可区分浆液性或粘液性 D、分为浆液性与粘液性 E、CT表现为多房性薄壁外缘光滑的低密度影 7、宫内胎儿生长停滞的第一个超声指征就是( ) A、胎儿腹围小于胸围 B、胎儿头、体比例失调 C、股骨长径减小 D、宫内总容积小 E、肱骨长径减小 8、早期妊娠在USG表现的叙述,那一项错误( ) A、可见胎心 B、可见子宫增大 C、可见妊娠囊 D、可见肝脏 E、可见胎盘 9、下述葡萄胎病理特点,哪项不对？( ) A、绒毛膜促性腺激素分泌增加 B、半数患者,子宫比同月妊娠大 C、1/4患者,子宫比同月妊娠小 D、多为恶性,易转移 E、半数患者,双侧黄素囊肿
第I卷（选择题） 1．利用植物组织培养技术将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，培育的过程中不需要 A. 导入外源基因 B.离体状态 C. 具有完整细胞核的细胞 D.一定的营养物质和激素 2．通过植物体细胞杂交可以获得“烟草—菠菜”——一种新型的烟草品种。下图为培育杂种植株过程的示意图,下列操作不是必需的是( ) A.在融合之前除去两种细胞的细胞壁 B.原生质体先进行脱分化处理再融合 C.原生质体融合后筛选杂种细胞继续培养 D.诱导杂种细胞形成愈伤组织再分化成植株 3．能克服远缘杂交不亲和技术的是( ) A．组织培养 B．细胞融合 C．动物胚胎移植 D．单倍体育种 4．下列有关现代生物科技的叙述中，错误的是（） A．植物体细胞杂交技术克服了不同生物远缘杂交不亲和的障碍 B．动物细胞融合技术开辟了制备单克隆抗体的新途径 C．利用基因工程技术可以使哺乳动物生产人类所需的药品 D．胚胎移植技术的优势是可以充分发挥雄性优良个体的繁殖潜力 5．关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，错误的是 A.动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同 B.动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C.给予适宜的条件，有的植物可在愈伤组织的基础上直接发育出花器官 D.细胞培养产生出变异的新植株，为选择有益性状的新作物创造了条件 6．利用生物工程技术能够实现对良种种畜的快速大量繁殖，以下哪项技术不具备此优点？ A．基因工程技术 B．细胞核移植技术 C．胚胎分割技术 D．试管动物技术 7．在细胞工程——植物体细胞杂交中，需要将营养细胞的细胞壁除去，通常是采用纤维素酶和果胶酶的酶解破壁法处理。如将去掉了细胞壁的成熟植物细胞置于清水中，细胞将（） A．皱缩 B．胀破 C．呈球形 D．保持原状 8．在生物体内，细胞没有表现出全能性而是分化为不同的器官，其原因是 A. 细胞丧失了全能性 B. 不同细胞中遗传信息的执行情况不同 C. 不同的细胞中遗传信息不完全相同 D. 在个体发育的不同时期，细胞内的遗传物质发生了变化 9．下列有关植物组织培养的叙述，正确的是（） A．植物组织培养没有体现植物细胞的全能性 B．二倍体植株的花药经植物组织培养后得到稳定遗传的植株 C．用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子 D．植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl的培养基培养筛选而获得
第八章第二节人的生殖与发育（第一课时） 教学目标：知道男性和女性生殖系统的组成；睾丸的功能；卵巢的功能；受精的概念；胚胎在母体内发育的过程。 认知目标：1.说出人体生殖系统的结构和功能； 2.知道受精的过程，并明白受精的实质，懂得受精卵的形成是新生命诞生的开 端。 3.初步了解胚胎发育、分娩和哺乳的基本过程； 4.了解人的胚胎在发育过程中与母体进行物质交换的途径。 技能目标：1.学会读图，从中获取相关的知识信息； 2.能利用所学知识解决日常生活中所遇到的问题； 3.培养科学解释和评价人生殖过程的能力。 情感目标：1.通过介绍生男生女的奥秘、胎儿形成的原因等知识，培养学生学习科学的兴趣； 2.受精卵的形成是新生命诞生的开端，使学生明白严肃对待两性行为应该是终 身遵循的道德规范，建立正确健康的性道德观念； 3.通过介绍母亲十月怀胎并分娩诞生新生命的过程，使学生体验生命的珍贵、 母亲的伟大。 教学过程： 引入：在大家小的时候，我们可能都会问妈妈：“我是从哪里来的呢？”当时妈妈会告诉你：“你是从妈妈的肚子里来的。”你可能还不明白：“那我怎么跑进妈妈的肚子里的呢？” 妈妈会说：“等你长大了，你就会明白了。”现在就是你应该明白的时候了。 正式：我们人和动物一样，生长发育到一定的时候，能够产生与自己相似的子女，这个过程我们称之为生殖。人类生殖是通过男性和女性的生殖器官活动来实现的。这些器官组成了生殖系统。它们的活动包括生殖细胞的形成、交配和受精过程，以及胚胎发育、分娩等重要阶段。 那么首先我们来了解一下人类的生殖系统，它和我们之前学过的动物有那些相同点和不同点。 一、人的生殖系统 教师：人作为高等动物，他的生殖器官组成的生殖系统是雌雄异体还是雌雄同体的？ 学生回答：（雌雄异体） 教师：那么大家知道我们人类男性和女性的生殖器官吗？（展现图片，小组讨论，让学生分析图片中男性与女性的生殖器官，了解他们熟知的程度）最后老师总结归纳： 1.男性生殖器官及功能： 外生殖器：阴茎和阴囊； 内生殖器：睾丸：产生精子和分泌雄性激素； 附睾：储存精子的场所； 输精管：输送精子的管道； 精囊腺和前列腺：分泌粘性液体，以便精子运动。 2.女性生殖器官和功能 外生殖器：大阴唇、小阴唇和阴蒂 内生殖器：卵巢：左右各一个，产生卵子和分泌雌性激素，每月排卵一次，每次一个； 输卵管：与卵巢相连，可以把卵细胞推进到子宫内； 子宫：像倒放的梨，是孕育胎儿的场所；
第八章生殖系统 一、单选题 ( 每题仅有一个最佳答案) 1、下列哪一项临床表现与子宫发育畸形无关 ( ) A、原发性闭经 B、不孕 C、习惯性流产 D、难产 E、子宫内膜息肉 2、关于卵巢无性细胞瘤，下列哪一项是错误的 ( ) A、卵巢恶性生殖细胞实性肿瘤 B、常见于儿童及青年妇女 C、肿瘤彩色多普勒血流显像可显示丰富血流 D、卵巢实性良性肿瘤 E、卵巢少见肿瘤 3、子宫体与子宫颈的比例在生育期为（） A、1：1 B、1：2 C、1：3 D、2：1 E、3：1 4、MRI矢状面显示子宫前壁向外局限性隆起的是（） A、子宫体癌 B、子宫腺肌症 C、子宫浆膜下肌瘤 D、子宫粘膜下肌瘤 E、子宫先天性畸形 5、下列多正常妊娠期说法错误的是 ( ) A、妊娠期从末次月经第一天算起，共40周 B、临床将妊娠过程分为三个期 C、早期妊娠为12周以前 D、中期妊娠为27周以前 E、晚期妊娠为28-42周
6、关于卵巢囊腺瘤的说法，不正确的是 ( ) A、多见于育龄妇女 B、CT扫描不能区分浆液性或粘液性 C、CT扫描一般可区分浆液性或粘液性 D、分为浆液性和粘液性 E、CT表现为多房性薄壁外缘光滑的低密度影 7、宫内胎儿生长停滞的第一个超声指征是 ( ) A、胎儿腹围小于胸围 B、胎儿头、体比例失调 C、股骨长径减小 D、宫内总容积小 E、肱骨长径减小 8、早期妊娠在USG表现的叙述，那一项错误 ( ) A、可见胎心 B、可见子宫增大 C、可见妊娠囊 D、可见肝脏 E、可见胎盘 9、下述葡萄胎病理特点，哪项不对 ( ) A、绒毛膜促性腺激素分泌增加 B、半数患者，子宫比同月妊娠大 C、1/4患者，子宫比同月妊娠小 D、多为恶性，易转移 E、半数患者，双侧黄素囊肿 10. 早孕最常并发的盆腔肿块是 ( ) A、子宫肌瘤 B、黄体囊肿 C、皮样囊肿 D、内膜囊肿 E、滤泡囊肿
第十章细胞培养技术和培养箱 首页习题习题参考答案 习题名词解释选择题简答题 一、名词解释 1. 细胞培养 2. 细胞培养传代 3. 原代细胞培养 4. 无限细胞系 5. 细胞融合 6. 细胞治疗 7. 培养箱 8. 缓冲室 9．手套操作箱 二、选择题 【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1.体外培养细胞的分类（贴附型或悬浮型）是根据（） A．细胞为上皮样或成纤维细胞样 B．能否贴附在支持物上生长 C．呈密度抑止特性 D．肿瘤细胞 E．细胞可多次传代 2. 下述细胞传代的概念中，正确的是（） A．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器的过程 B．从体内取出细胞接种到培养容器，细胞继续增殖的过程 C．培养细胞期间更新培养液的过程
D．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器并及时更新培养液使细胞增殖继续的过程 E．细胞倍增的过程 3. 细胞生长维持液，需添加的血清量的百分比为（） A．1％～2％ B．2％～5％ C．5％～10％ D．10％～20％ E．20％～25％ 4．培养细胞传代时，通常是（） A．根据不同细胞采取不同的方法 B．常用二乙烯四乙酸二钠（EDTA） C．EDTA与胰蛋白酶按不同比例混合使用 D．悬浮生长的细胞直接添加胰蛋白酶” E．贴壁生长的细胞添加新鲜培养液 5. 二氧化碳培养箱结构的核心部分，主要是 A．湿度调节装置 B．湿润的含水托盘 C．温度调节器 D．CO2调节器、温度调节器和湿度调节装置 E．气体保护器装置 6. 二氧化碳培养箱调节CO2浓度范围为（） A．0％～20％ B．20％～40％ C．10％～20％ D．20％～30％ E．30％～40％ 7. 厌氧培养箱通过自动连续循环换气系统保持箱内的厌氧状态，其换气过程是（） A．①气体排空→②净化→③气体排空→④N2净化→⑤气压平衡 B．①气体排空→②N2净化→③气压平衡
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
第三节人的生殖和胚胎发育 典型例题一 人体发育的整个过程的起点是（） A.受精卵 B.胎儿 C.婴儿 D.卵细胞 【答案】A 【解析】睾丸能产生精子，卵巢能产生卵细胞，但他们并不是个体发育的起点，因为他们单独存在时无法发育为新个体。精子与卵细胞结合形成受精卵，由受精卵进一步发育为个体，所以个体发育的起点是从受精卵开始的。故答案为A。 典型例题二 一正常妇女摘除子宫后（） A.没有生殖能力，第二性征消退 B.没有生殖能力，第二性征不消退 C.有正常的月经，第二性征不消退 D.有生殖能力，第二性征消退 【答案】B 【解析】卵巢是女性的生殖腺和主要性器官，位于盆腔内子宫的两侧，它的作用是产生生殖细胞并分泌雌性激素；月经，又称作月经周期，是生理上的循环周期，育龄妇女每隔一个月左右，女性月经周期的形成主要是由于调控卵巢功能的上级机构（下丘脑和垂体）与卵巢之间相互作用的结果；子宫是胎儿发育的场所和形成月经的地方。此人子宫摘除，但卵巢是完好的，因此能正常排卵，但不会形成月经，也无妊娠能力，即怀孕能力。故选B。 典型例题三 正确排列下面各生理过程的顺序： A.精子上行到输卵管
B.精子经过阴道 C.发育成熟，分娩 D.进行细胞分裂，产生两个、四个…细胞 E.形成一个小胚泡 F.细胞分裂和分化形成胚胎 G.植入子宫内膜 H.精子通过子宫 I.形成受精卵 J.初具人形，成为胎儿 【答案】BHAIDEFGJC 【解析】人体生殖发育的过程是：首先是精子进入阴道，缓缓通过子宫，在输卵管内与卵细胞相遇，精子与卵细胞结合形成受精卵。受精卵不断进行分裂，逐渐发育成胚泡。胚泡缓慢地移动到子宫中，最终植入子宫内膜，这是怀孕。胚泡发育，其中的细胞开始分化成各种组织，由组织再形成各种器官、系统，逐渐发育成胚胎。胚胎进一步发育成胎儿，胎儿在母体的子宫内发育成熟，最后分娩产出新生儿。 典型例题四 “试管婴儿”和“克隆羊”都属于生物工程技术的杰出成果。下列有关这两项技术的叙述中，正确的是（） A.都属无性生殖，能保持母本性状 B.都是细胞水平的操作，属细胞工程技术范围 C.都应用了转基因技术 D.都不会产生变异 【答案】B 【解析】“试管婴儿”是由受精卵发育成的，经过了两性生殖细胞的结合过程，是有性生殖，“克隆羊”是直接由动物的体细胞繁殖的，是无性生殖，都没有利用转基因技术，有性生殖的生殖过程中会产生变异。故选B。
细胞培养特性：分为贴壁性（上皮细胞型、成纤维细胞型）和悬浮型（白细胞、癌肿细胞）体外培养细胞生长特点：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。 原代培养（原代细胞）：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前称为原代培养或原代细胞。 传代培养：细胞持续生长繁殖一段时间，到达一定浓度之后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿，并补充更新培养液。 细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。 有限细胞系：一般正常细胞系的寿命只能维持一段时间期限。 无限细胞系：传代中极少的后代发生转化，通过“危机期”，获得不死性而具有持久或无限增值能力，这种永生化细胞即为无限细胞系。 细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株。 克隆：在动物细胞培养中从细胞群体中分离出一个细胞开始，其在体外无性繁殖成新的基因型相同的细胞群体，这种纯化的细胞群称为细胞株，他们中的每个细胞的遗传特征及生物特性极为相似，常用的细胞克隆技术有有限稀释法和平皿克隆分离法。 杂交瘤技术：主要由免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，核心是细胞融合。 杂交瘤：由产生抗体的肿瘤细胞与抗原-刺激的正常浆细胞融合而形成的细胞，这种细胞产生的抗体称为单克隆抗体。基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。 细胞杂交：通过人工培养和诱导将不同种生物或同种生物不同类型的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。 杂交技术过程:①免疫动物及细胞培养:用特定抗原免疫纯系动物获得预定抗体B淋巴细胞,利用细胞融合技术可使短寿命抗体形成细胞与能永久生长的同种骨髓瘤细胞系融合,获得既有分泌抗体能力,又有无限繁殖能力的细胞②筛选杂交瘤细胞(在具有筛选作用的培养基上培养)③克隆化培养④单克隆抗体的大量制备与鉴定(动物体内诱生法和体外培养法)⑤进一步分离和纯化单克隆抗体,鉴定单克隆抗体类型及亚类,测定抗体亲和力以及相应抗原的分子量等. 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，其计算公式是σ=λ/NA 式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ值，提高分辨率可采取以下措施: （1）降低波长λ值，使用短波长光源。（2）增大介质n值以提高NA值（NA=nsin(u)/2）。（3）增大孔径角u值以提高NA值。（4）增加明暗反差。 体外培养过程：原代培养或初代培养、传代期、衰老期。 每代细胞生长过程：滞留期（潜伏期）、指数生长期、平台期 培养细胞生长条件：①营养需要：基本营养物质（氨基酸、维生素、碳水化合物及无机离子）和促生长因子等物质。②生存环境：温度（35—37）、气相（CO2和O2）、pH值（）及渗透压③无污染及无毒：防止交叉污染、有害物质污染。 细胞冻存及复苏： 基本原则：慢冻快融，以最大限度的保存细胞活力。 原理：细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，
大学细胞工程试题及答 案 TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】
细胞模拟试题及答案 一、填空（每空一分，共25分） 1.实验室的物理防护是由隔离的设备、实验室的设计、实验实施等三个方面组成， 根据其密封程度的不同，分为P1、P2、P3、P4四个生物安全等级。典型的P4实验室由更衣区、过滤区、缓冲区、消毒区、核心区组成。 2.细胞系是原代培养经初步纯化获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不 均一细胞群体。 3.细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方 法，由单细胞增殖形成的细胞群。 4.干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的增殖特性为缓慢性和自 稳性。 5.培养细胞的生长特点为贴附、接触抑制和密度抑制。 6.植物细胞培养的原理是基于动物细胞的全能性。 7.植物细胞悬浮培养的方法为分批培养法、连续培养法和半连续培养。 8.植物组织培养中培养材料的消毒过程中，消毒的基本原则是既要杀死附着其上的 微生物又不损伤材料。 9.细胞生长测定的一般方法为：细胞计数、测定细胞密实体积、细胞鲜重或干重。 10.体外培养的细胞根据其生长方式主要分为贴附型细胞和非贴附型细胞。 11.人工种子的组分包括胚状体、人工胚乳和人工种皮。 12.细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核 融合几个步骤。其中细胞桥形成是最关键的一步。
13.花粉单倍体植株的鉴定方法有形态鉴定、细胞学鉴定、杂交鉴定、分子标记鉴定。 14.胚胎工程主要是对哺乳类动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续 发育，获得人们所需要的成体动物。 15.人工诱导单倍体形成的方法包括：远缘杂交、延迟授粉、核置换、射线照射、花药 培养等。 二、单项选择题（每题1分，共10分） 1.人参皂甙粉是人参中重要的药用成分，以前只能从人参中提取产量极低，因而价 格昂贵。目前人参皂甙粉可以通过下列哪项技术迅速大量获取（B） A．基因工程 B．植物组织培养 C．植物体细胞杂交 D．发酵工程 2.下列有关动物细胞培养的叙述不正确的是（C） A．通过动物细胞培养可获得大量的细胞分泌蛋白 B．动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理，以使细胞分散 C．细胞癌变都发生于原代培养过程中 D．目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的，以保持其正常核型3. 尽管各种合成培养基给动物细胞培养带来极大方便，但许多实验表明，单纯使用 合成培养基细胞的贴壁增殖效果常常不理想。因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的(C) A．平衡盐溶液B. 琼脂糖 C. 动物血清 D. 甘露醇 4.制备人工种子的关键是控制(A) A.胚状体的同步发育 B.人工种皮的同步发育 C.胚状体的单独发育 D.人工种皮的单独发育