生物化学--实验七邻甲苯胺法测定血糖实验七邻甲苯胺法测定血糖
【目的要求】
1.掌握邻甲苯胺血糖测定法的基本原理及操作方法。
2.熟悉邻甲苯胺血糖测定法的影响因素及控制方法。
3.了解邻甲苯胺血糖测定法的临床意义及应用。
【实验原理】
血清样品中的葡萄糖在酸性环境中与邻甲苯胺共热时，葡萄糖脱水转化为5-羟甲基α-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺结合为蓝绿色的醛亚胺(Schiff硷)。血清中的蛋白质则溶解在冰醋酸和硼酸中不发生混浊。将标准葡萄糖溶液与样品按相同方法处理，在680nm波长处比色，即可测得样品中葡萄糖含量。邻甲苯胺法测得正常空腹血糖值为3.9,5.6mmol / L (70,100mg %)。
CHOH——CHOH HC——CH 酸中? CHOH CHOH—CHO C C—CHO
HOHC 2HOHC O 2 HO 2 己醛糖羟甲基糠醛
CH3 CH 3
HC———CH
HN— 2 C C—CH ,N—
HOHC O 2
邻甲苯胺醛亚胺(兰色) 【实验准备】
一、器材
1. 721型分光光度计、沸水浴。
2. 5×15cm试管、刻度吸量管。
二、试剂
1.邻甲苯胺试剂称取硫脲(AR)级
2.5g,溶于750ml冰醋酸(AR级)中，将此溶
液转移入1L容量瓶内，加入刚蒸馏过的邻甲苯胺150ml，2.4, 硼酸溶液100ml及冰醋酸至1000ml刻度，置棕色瓶中至少可用两个月。
2.葡萄糖标准储存液(10 mg / ml) 用0.25,苯甲酸溶液配制。
3.葡萄糖标准应用液(1mg / ml) 取贮存液10ml放入100ml容量瓶中，用0.25,苯甲酸溶液稀释至100ml。
【实验操作】
1.采得待测血样(抗凝)后立即离心以分离血浆(3,000转离心15分钟)。
2.取干燥试管3支，分别标出号码，按下表添加试剂。
邻甲苯胺法测血糖操作表
管别测定管标准管空白管试剂(ml)
血清(浆) 0.20ml ?? ??
葡萄糖标准液 ?? 0.20ml ??
蒸馏水 ?? ?? 0.20ml
邻甲苯胺试剂 6.0ml 6.0ml 6.0ml 3.混匀各管内容物置沸水浴中加热15分钟后取出用流水冷却。 4.以空白管校正零点，读取各管680nm处吸光度值。
5.计算
测定管吸光度 100/0.2血糖mg%,× 葡萄糖标准液值× 标准管吸光度
【注意事项】
1.本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反
应。故测定值较Folin-吴宪法为低。
2.显色反应与水的含量有关，故应使标准管和测定管的含水量一致。
3.温度
对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。 4.显色后颜色不稳定，室
温每放置1分钟，颜色降低0.15,。 5.邻甲苯胺试剂中冰醋酸浓度很高，使用不当容易损坏比色仪器。 6.邻甲苯胺是致癌剂，测定过程中应小心使用。
【思考题】
1.试讨论血糖测定的临床意义及应用。
2.哪些因素影响邻甲苯胺法测定血糖的显色反应,操作过程中如何减少这些因素对测
定结果的影响,
邻甲苯胺法测定血清（浆）葡萄糖 [原理] 在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺缩合、脱水，生成希夫氏碱（Schiff base ），经分子重排生成蓝绿色化合物，其颜色深浅在一定范围内与血糖浓度成正比。 [试剂] 1．邻甲苯胺试剂 称取硫脲(AR)2.5g ，溶于冰醋酸(AR)750ml 中。将此液转入1 L 容量瓶内，加邻甲苯胺150ml ，2.4%硼酸溶液100ml ，用冰醋酸定容至刻度。此溶液应置棕色瓶内室温保存，至少可应用2个月。新配制试剂应放置24h 后待“老化”使用，否则反应产物的吸光度低。 2．100mmol/L 葡萄糖标准贮存液 称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g ，溶于12mmol/L 苯甲酸溶液约70ml 中，以12mmol/L 苯甲酸溶液定容至100ml 。2h 以后方可使用。 3．5.0mmol/L 葡萄糖标准应用液 吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 放于100ml 容量瓶中，用12mmol/L 苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。 4．0.3mol/L 三氯醋酸溶液 称取三氯醋酸5g ，溶于蒸馏水70ml 中，然后用蒸馏水定容至100ml ，混匀即可。 [主要器材] 1．试管及试管架 2．刻度吸量管 3．721型分光光度计 [操作步骤] 1． 血清、血浆、脑脊液及清亮的胸腹水按表8操作。 CHOH —CHOH CHOH —CHO HO —CH 2 葡萄糖 羟甲基糠醛 HC CH O C C CHO OH — CH 2 2 羟甲基糠醛 邻甲苯胺 醛亚胺（蓝绿色） HC CH O C C CHO OH —CH 2 HC CH O C C CH= OH —CH 2 N + H 2N
血糖含量的测定――邻甲苯胺法（O-toluidine boric，TB法） 实验原理 血液中所含的葡萄糖，称为血糖。它是糖在体内的运输形式。目前国 内医院多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。前者特异性强、价廉、方法简单,其正常值：空腹全血为3.6～5.3毫摩尔/升（65～95 毫克/分升），血浆为 3.9～6.1毫摩尔/升。后者由于血中绝大部分非 糖物质及抗凝剂中的氧化物同时被沉淀下来，因而不易出现假性过高 或过低, 结果较可靠, 其正常值：空腹全血为3.3～5.6毫摩尔/升（6 0～100毫克/分升），血浆为3.9～6.4毫摩尔/升（70～115毫克/分升）。本实验采用邻甲苯胺法测定血糖。其原理是葡萄糖在酸性介质 中加热脱水反应生成5－羟甲基－2－呋喃甲醛，分子中的醛基与邻甲 苯胺缩合成青色的薛夫氏碱，通过比色可以定量。 试剂和器材 一、试剂 邻甲苯胺试剂：:称取硫脲1.5ｇ溶于750ｍL冰醋酸中, 加邻甲苯胺150 ｍL及饱和硼酸40ｍL, 混匀后加冰醋酸至1000ｍL, 置棕色瓶中，冰箱 保存。 葡萄糖标准溶液：5.0mg/mL，临用时稀释成1.0 mg/mL。 二、材料 人血清。 三、器材 具塞试管1.5×15cm（×8）；分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线
取6支试管编号后，按下表顺序加入试剂： 管号0 1 2 3 4 5 标准葡萄糖液(mL) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸馏水(mL) 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 邻甲苯胺试剂(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A630 加毕，温和混匀，于沸水浴中煮沸4min取下，冷却，放置30min，用1c m比色杯，试剂空白为参比，测定 630nm 处吸光值，绘制标准曲线。 二、样品测定 取3支试管编号后，分别加入试剂，与标准曲线同时作比色测定： 管号对照样品①样品② 稀释的未知血清样品(mL) 0 0.10 0.10 蒸馏水(mL) 0.10 0.00 0.00 邻甲苯胺试剂(mL) 5.0 5.0 5.0 A630 加毕，温和混匀，于沸水浴中煮沸4min取下，冷却，放置30min，用 1 cm比色杯，试剂空白为参比，测定630nm 处吸光值，从标准曲线中可查出样品中血糖含量。 注意事项
生物化学实验 实验名称：激素对血糖浓度影响及血糖浓度的测定 时间：2014年6月9日星期一 姓名： 学号：201312201202003 指导老师：毛水龙老师 一，实验目的 掌握血糖的测定原理和方法；掌握血糖的正常范围及意义；熟悉调节血糖的激素对血糖浓度的影响。 二，实验原理 家兔动物实验。获取家兔注射激素前后的血液样本并对其；进行血糖测定。邻苯甲胺方法测定血糖浓度。 实验采取前后对照的方法，对家兔注射肾上腺素和胰岛素，并通过耳缘静脉采血，获取激素注射前后的血液样本，采用邻甲苯胺法处理样本，最终与标品比色得出结论。 1.调节血糖的激素有：胰岛素、肾上腺素、胰高血糖素、肾上腺皮质激素、生长素和甲状腺素等。胰岛素是体内唯一能使血糖降低的激素，其他激素均使血糖升高。 2.肾上腺素升高血糖的机制主要作用于肝细胞膜受体，通过cAMP-蛋白激酶系统激活肝磷酸化酶，同时抑制糖原合成酶，导致肝糖原分解加速。胰岛素降低血糖的机制是：降低肝细胞cAMP水平，从而抑制
肝磷酸化酶，激活糖原合成酶，促进肝糖原的合成；胰岛素诱导糖酵解关键酶类的合成，阻遏糖异生关键酶的合成；胰岛素促进葡萄糖进入红细胞、肌肉等组织的异化扩散，促进糖的利用。
3.血液中的葡萄糖，在热的冰醋酸溶液中可脱水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛）。后者在与邻甲苯胺缩合，生成蓝绿色的西夫式碱（Schiffbase）。其色泽的深浅与葡萄糖浓度成正比。与同样处理的标准葡萄糖溶液比色，即可求得待测血液中葡萄糖的含量。三，实验材料 1.材料：家兔两只,刀片，草酸钠，小烧杯。 2.试剂：①肾上腺素(1mg／lml)②胰岛素(20单位／ml)③碘酒、消毒酒精④饱和硼酸溶液⑤邻甲苯胺-硼酸⑥5％三氯醋酸溶液⑦饱和苯甲酸溶液⑧标准葡萄糖贮存液⑨标准葡萄糖应用液 四，实验方法 1.取健康正常家兔一只，实验前饥饿14~16h左右，称体重。 2.耳缘静脉采血。小刀刮去耳缘的毛，用酒精棉球擦拭使其充血，再用干棉球擦干。刀片划开耳缘静脉，使血液滴入成有足够草酸钠的小烧杯中，注意收集期间要不断地晃动烧杯防止血液凝固。采集完毕后干棉球压迫血管止血。 3.给家兔注射肾上腺素（0.5mg/只），半小时后同样方法采得血液。 4.缓缓放入洁净试管内，加5%三氯醋酸3.6ml，同时摇动使之充分混匀。3000rpm离心5min，制得无蛋白血滤液（上清液）。
实验教学大纲 一、前言 生物化学实验是一门重要的实验性基础医学课程。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，与理论教学既有联系又相对独立的组成部分，有自身的规律和系统。本教材注重学生的基本知识，基本技能的培养，促进学生综合能力的提高，培养学生初步的科研能力。 本大纲根据《医用生物化学实验》（第2版，教研室自编，2003年）教材编写，不同专业的生物化学实验总学时不同，临床医学、护理学医学影像、预防医学和药学系为21学时、医学检验系24学时。 二、实验教学内容和课时分配 章节内容实验学时 实验一. 生化实验基本操作 3 实验二. 氨基酸的薄层层析 3 实验三. 肝组织中核酸的提取 3 实验四. 核酸组分的鉴定 3 实验五. 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制 1.5 实验六. 酪氨酸酶的催化作用 1.5 实验七. 邻甲苯胺法测定血糖 3 实验八. 改良Lowry氏法测定蛋白质含量 3 实验九. 血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳 3 实验十. 双缩脲法测定蛋白质含量 3 实验十一. 氨基移换作用 3 30（选做） 实验一. 生化实验基本操作 目的：进行正规的实验基本操作训练,使学生熟悉各种吸量管, 并能熟练、正确地使用之。了解分光光度计及离心机的各个部件的作用，掌握比色、离心原理。准确使用比色计和离心机。培养学生仔细观查实验变化,如实做好实验记录,认真书写实验报告的习惯。
要求：1. 使用吸量管前,先根据需要选择适当的吸量管, 其总容量最好等于或稍大于取液量,临用前须看清刻度。 2. 使用比色计前须熟悉其型号及性能,严格按规程进行操作, 准确记录比色读数。 3. 启用离心机前,离心管须对称和配平,正确调节转速及离心时间, 以防损坏离心机。 4. 掌握Cu2+比色测定的原理、操作过程及结果计算。 实验二. 氨基酸的薄层层析 目的：了解氨基酸的薄层层析是根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同而进行分离或提纯的一种方法。观察被分离(提纯)的氨基酸因结构不同,在吸附剂上的吸附亲和力不同, 使氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次进行吸附和解析,从而使不同的氨基酸达到分离的现象。 要求：1. 铺板须均匀,并置于水平位置,以免厚薄不匀。 2. 点样斑点直径控制在2-3mm,待第一次点样干后, 再将样品在原点样处重复一次。 3. 层析时层析板与层析缸底平面须呈30°角。 4. 显色剂须均匀喷洒在板上,以防冲破硅胶,影响观察结果。 实验三. 肝组织中核酸的提取 目的：核酸可分为DNA和RNA,与蛋白质结合成核蛋白形式存在于细胞内。了解动物肝中的核蛋白可用水提取,再用酚破坏核酸与蛋白质之间的结合键,并用乙醚抽提除去蛋白质极其杂质,最后用乙醇沉淀核酸。 要求：1.了解动物肝中核酸的提取过程。 2.掌握核酸的沉淀方法。 实验四. 核酸组分的鉴定 目的：核酸可分为DNA和RNA,证实DNA和RNA是由磷酸,戊糖(核糖或脱氧核糖)及嘌呤或嘧啶组成,借以了解由这些成分组成单核苷酸,它们再以3',5'-磷酸二酯键连接成多核苷酸(核酸)。 要求：1. 了解核酸的基本组成成份。 2. 知道如何鉴定腺嘌呤和鸟嘌呤(嘌呤碱)、磷酸、核糖与脱氧核糖(嘧啶碱本实验没有鉴定)。 实验五. 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制
一、血清谷丙转氨酶（SGPT）赖氏改良法 器材:试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清试剂: （1）0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液： ①0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4℃保存。 ②0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4℃保存。 ③将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。 （2）标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）： 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。 （3）SGPT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) : 取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH 7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 （4）GOT底物液(DL–天冬氨酸200mmol/L ,α-酮戊二酸 2mmol/L):称取α- 酮戊二酸29.2mg 和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH 至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。 （5）2.4-二硝基苯肼溶液: 取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。（6）0.4mol/L NaOH溶液:
血糖测定方法（邻甲苯胺法） 一、原理：葡萄糖为一含醛基的己糖，在酸性与加热情况下脱水反应生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，再与邻甲苯胺缩合成芳香族第一级胺青色的席弗氏碱。 二、试剂： 1、邻甲苯胺试剂：取冰醋酸920ml，加入硫脲（Thiourea）1.5g，待其溶解，加邻甲苯胺（o-Toluidine）80ml，充分混合后，取此液960ml加入饱和硼酸溶液40ml，混匀，放置于棕色瓶中。 2、饱和硼酸溶液：称取硼酸6g，以蒸馏水溶解并稀释至100ml，放置一夜，过滤即可应用。 3、葡萄糖贮存标准液（1ml=5mg）：将少量无水葡萄糖，CP置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖500mg，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml 容量瓶内，以饱和苯甲酸溶液加至刻度。此液可长期保存。 4、葡萄糖应用标准液（1ml=0.05mg）：取葡萄糖贮存标准液1ml置于100ml 容量瓶内，加入饱和苯甲酸溶液至刻度。 5、饱和苯甲酸溶液：称取苯甲酸（Benzoicacid）2.5g，于800ml蒸馏水中，加热溶解，冷却后加蒸馏水至1000ml。 三、操作： 放沸水煮沸8min，冷水冷却，用640nm或红色滤光板光电比色，用蒸馏水作空白，记录各读数。 计算：（测定-空白）/（标准-空白）*0.1*100/0.1=葡萄糖毫克%
血清白蛋白测定（酚试剂法） 一、原理：用硫酸钠将血清中球蛋白沉淀，所分离的白蛋白加酚试剂而呈蓝色， 与含酪氨酸的标准管比色，求得白蛋白量。血清总蛋白减去白蛋白即为球蛋白量。 白蛋白与球蛋白分离：球蛋白与白蛋白不同，具有易溶于稀盐溶液而不溶于浓盐溶液的特点。故以23%硫酸钠或21%亚硫酸钠溶液沉淀球蛋白。再利用乙醚将白蛋白与球蛋白分离。 二、试剂： 1、酪氨酸标准液（1ml=0.2mg）：精确称取酪氨酸（Tyrosine）0.2g，置于1000ml 容量瓶中，用0.1当量盐酸溶液稀释至刻度。 2、0.1当量盐酸溶液：取浓度为36.5%，浓度为11.9M的市售浓HCl加水配制 成1L: 取XL的上述浓盐酸,因为盐酸是1-1价的离子组成的酸,当量浓度等于MOL浓度,据配制前后溶质的MOL数相等,则有如下计算: (X*11.9)/0.1=1,X=0.0084L.将浓盐酸加入到1000ML的容量瓶中,再加水到1L 刻度为止即得0.1个当量的盐酸. 3、23%硫酸钠溶液：称取无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1000ml。加热溶解， 冷却后补足蒸馏水量。 4、酚试剂：钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g 钼酸钠（NaMO4·2H2O）25g 蒸馏水700ml 置于2000ml烧瓶内，再加入85%磷酸（H3PO4）50ml，浓盐酸（HCl）100ml。 应用回流冷凝器煮沸10小时（烧瓶内可加入小玻璃珠10数颗，以防煮沸时溶液冲入冷凝管而溢出）。除去冷凝管后，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml，溴液（或30%过氧化氢）数滴，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴（或过氧化氢）。因溴刺激性大，应在排气柜内进行。制成的酚试剂为鲜明黄色，保存于棕色瓶内备用。 5、10%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠100g，加100ml蒸馏水至1000ml。
葡萄糖氧化酶法与邻甲苯胺法作血糖测定方法对比试验.txt台湾一日不收复，我一日不过4级！如果太阳不出来了，我就不去上班了；如果出来了，我就继续睡觉！ 葡萄糖氧化酶法与邻甲苯胺法作血糖测定方法对比试验 更新日期：2010-10-15 点击： 农嵩 摘要以生物化学方法—葡萄糖氧化酶法(GOD法)为对比方法，有机化学方法—邻甲苯胺法(O-T法)为候选方法作血糖浓度测定对比试验，考察分析两法的相关性及其优缺点，为将来改进教学实验及临床应用提供参考。实验结果表明，回归方程表达出系统误差不明显，相关系数r=0.985，两法相关性比较密切。 关键词血糖；GOD法；O-T法；相关分析 Contrast test on determination of blood sugar with methods of glucose-oxidase (GOD) and o-toluidine(O-T) Nong Song Dept. of Biochemistry, Youjiang Medical college for National Minorities (Bose 533000) Abstract Contrast test was made with GOD(contrast method) and O-T(candidate solution method) for determining blood sugar contents. The correlation and advantages and disadvantages of the two methods were observed and analyzed for the reference of improving teaching experiments and clinical application. Results showed that the systematic error expressed by regression equation was not obvious, correlation coefficient r=0.985. Correlation of the two methods was comparatively closed. Key words blood sugar; GOD method; O-T method; correlation analysis 血糖测定法大体分为四种：无机化学方法、有机化学方法、生物化学方法及近代科学技术，各存在不同的优缺点。GOD法测定血糖浓度的准确性、精密度已被公认是较好的［1］，而O-T法则定血糖是特异性最高的非酶法，本试验以GOD法为对比方法，以O-T法作候选方法，测定40例包括各种疾病的样品血糖浓度，所得结果用相关回归分析，考察两法的相关性，可反映出O-T法的系统误差。测定结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 试剂GOD法用标佳有限公司提供的试剂盒。O-T试剂配制［1］：称取硫脲1.5g溶于750ml冰醋酸中，加邻甲苯胺150ml及饱和硼酸40ml，混匀后加冰醋酸至1000ml。 1.2 标本来源附属医院检验科提供的各种疾病血清样品40例。 1.3 仪器日立220A型紫外分光光度计。 1.4 操作方法 1.4.1 GOD法按表1操作。 表1 GOD法测定血糖操作程序
激素对血糖浓度的影响及血糖浓度的测定 刘峡汛1 1. 武汉科技大学医学院临床1105班湖北武汉430065 [摘要] 目的：观察家兔注射肾上腺素或胰岛素前后血糖水平的变化 方法：采用邻甲苯胺法测血糖浓度。 结果：注射胰岛素的家兔空腹血糖含量为182mg/dL，药后血糖含量为129mg/dL；注射肾上腺素的家兔空腹血糖含量为81mg/dL，药后血糖含量为119mg/dL。 结论：胰岛素会使血糖浓度降低，肾上腺素会使血糖浓度升高。[关键词]血糖浓度胰岛素肾上腺素 引言：正常情况下，血糖浓度在各种因素调解下，维持相对恒定，但现如今糖尿病可谓是医学界的一大顽症，目前并无良药可医，对于此种病当以预防为主。因此身为医学生，掌握激素对血糖浓度的影响及如何测量血糖浓度显得有为重要。 原理：1.血糖浓度即指血液中的葡萄糖浓度。血糖水平相当恒定，维持在80—120mg/dL之间。空腹血糖水平的相对恒定是在神经激素调节下血糖的来路和去路达到动态平衡的结果，其中激素调节站主导地位。调节血糖的激素有：胰岛素，肾上腺素，胰高血糖素，肾上腺皮质激素，生长素和甲状腺激素。胰岛素是体内唯一能使血糖降低的激素，其他激素均使血糖升高。2.葡萄糖在热的冰醋酸溶液中可脱水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺缩合，生成蓝绿色的西夫
氏碱，其色泽的深浅与葡萄糖浓度成正比。 1.材料与方法 1.1材料 仪器：722型分光光度计 试剂： 1.正常家兔(实验前预先使其饥饿14—16小时)两只。称体重，一只为 2.55kg，另一只为1.8kg。 2.肾上腺素（1mg/1ml） 3.胰岛素（5单位/ml） 4.碘酒,消毒酒精 5.饱和硼酸溶液：取硼酸6g,溶于100ml蒸馏水中，摇匀，放置过夜后过滤，即可应用。 6.邻甲苯胺试剂：取冰醋酸（AR）940ml,加入硫脲（AR）1.5g，溶解后加入邻甲苯胺60 ml混匀，置棕色瓶中，室温保存。新配试剂应放置24小时后（待老化）使用。此试剂腐蚀性极强，应避免与皮肤接触而造成灼伤。 7.12mmol/L苯甲酸溶液 称取苯甲酸1.4g，加入蒸馏水900ml,加热助溶，冷却后加蒸馏水至1000ml。 8.葡萄糖标准贮存液（100mmol/L） 准确称取无水葡萄糖（预先置80℃烤箱中干燥至恒重，移置干燥器中保存）1.802g,用12mmol/L苯甲酸溶液溶解，移至100ml容
18生物化学实验--吴宪-Folin法测定 血糖含量 标题：18生物化学实验——吴宪-Folin法测定血糖含量 一、实验目的 1.掌握吴宪-Folin法测定血糖含量的原理和方法。 2.学习使用分光光度计测量样品吸光度。 3.了解血糖的生理意义及其调节机制。 二、实验原理 吴宪-Folin法是一种利用邻甲苯胺和硫酸铜反应生成紫红色络合物的原理，通过测量该络合物在特定波长下的吸光度来测定血糖含量的方法。由于葡萄糖分子中含有醛基，因此可以利用这一特性进行测定。本实验采用吴宪-Folin法进行血糖含量的测定。 三、实验步骤 1.样品准备：收集受试者在禁食12小时后的静脉血，分离血清备用。 2.试剂准备：将邻甲苯胺、硫酸铜、碳酸钠等试剂按照配方准确称量，溶解定 容，现配现用。 3.测定步骤：将试剂和样品按照规定比例混合，在规定温度下静置一段时间， 用分光光度计在特定波长下测量吸光度，记录数据。 4.数据处理：根据吸光度和标准曲线计算血糖浓度。 四、实验结果与数据分析 1.数据记录：记录受试者血糖吸光度数据（表1）。 表1：血糖吸光度数据记录表
表2：血糖浓度计算表 3.数据统计：对所有受试者的血糖浓度进行平均值和标准差统计（表3）。 表3：血糖浓度统计表 平均值：x̄= ΣC/n (mg/dl) 标准差：s= [Σ(C-x̄)²/n]½ 五、结论总结与讨论 根据实验数据，我们得出以下结论： 1.所有受试者的血糖浓度均处于正常范围内。这表明受试者在禁食12小时后 的血糖水平处于生理正常范围。这一结果与我们所知的人体在禁食状态下的血糖调节机制相符。当人体处于禁食状态时，胰高血糖素分泌增加，促进肝糖原分解，使血糖水平维持在正常范围。 2.实验结果存在一定差异。这可能与个体差异、采血时间、实验操作等因素有 关。为了获得更为准确的数据，需要进一步改进实验方法，提高操作精度和标准化程度。此外，对于不同个体之间的比较，应考虑个体差异对实验结果的影响。
生物化学--实验七邻甲苯胺法测定血糖实验七邻甲苯胺法测定血糖 【目的要求】 1.掌握邻甲苯胺血糖测定法的基本原理及操作方法。 2.熟悉邻甲苯胺血糖测定法的影响因素及控制方法。 3.了解邻甲苯胺血糖测定法的临床意义及应用。 【实验原理】 血清样品中的葡萄糖在酸性环境中与邻甲苯胺共热时，葡萄糖脱水转化为5-羟甲基α-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺结合为蓝绿色的醛亚胺(Schiff硷)。血清中的蛋白质则溶解在冰醋酸和硼酸中不发生混浊。将标准葡萄糖溶液与样品按相同方法处理，在680nm波长处比色，即可测得样品中葡萄糖含量。邻甲苯胺法测得正常空腹血糖值为3.9,5.6mmol / L (70,100mg %)。 CHOH——CHOH HC——CH 酸中? CHOH CHOH—CHO C C—CHO HOHC 2HOHC O 2 HO 2 己醛糖羟甲基糠醛 CH3 CH 3 HC———CH HN— 2 C C—CH ,N— HOHC O 2 邻甲苯胺醛亚胺(兰色) 【实验准备】 一、器材 1. 721型分光光度计、沸水浴。 2. 5×15cm试管、刻度吸量管。 二、试剂
1.邻甲苯胺试剂称取硫脲(AR)级 2.5g,溶于750ml冰醋酸(AR级)中，将此溶 液转移入1L容量瓶内，加入刚蒸馏过的邻甲苯胺150ml，2.4, 硼酸溶液100ml及冰醋酸至1000ml刻度，置棕色瓶中至少可用两个月。 2.葡萄糖标准储存液(10 mg / ml) 用0.25,苯甲酸溶液配制。 3.葡萄糖标准应用液(1mg / ml) 取贮存液10ml放入100ml容量瓶中，用0.25,苯甲酸溶液稀释至100ml。 【实验操作】 1.采得待测血样(抗凝)后立即离心以分离血浆(3,000转离心15分钟)。 2.取干燥试管3支，分别标出号码，按下表添加试剂。 邻甲苯胺法测血糖操作表 管别测定管标准管空白管试剂(ml) 血清(浆) 0.20ml ?? ?? 葡萄糖标准液 ?? 0.20ml ?? 蒸馏水 ?? ?? 0.20ml 邻甲苯胺试剂 6.0ml 6.0ml 6.0ml 3.混匀各管内容物置沸水浴中加热15分钟后取出用流水冷却。 4.以空白管校正零点，读取各管680nm处吸光度值。 5.计算 测定管吸光度 100/0.2血糖mg%,× 葡萄糖标准液值× 标准管吸光度 【注意事项】 1.本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反 应。故测定值较Folin-吴宪法为低。 2.显色反应与水的含量有关，故应使标准管和测定管的含水量一致。 3.温度 对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。 4.显色后颜色不稳定，室
胰岛素对血糖浓度的影响实验报告 胰岛素对血糖浓度的影响实验报告 实验五胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 实验六胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响实验五葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 课程名称:生物化学与分子生物学实验课年级:2004专业、层次:临床医学本科授课教师:汪宗桂职称:助教学时:3学时基本教材:自编《生物化学与分子生物学实验指导》 教学目的与要求: 1、观察胰岛素和肾上腺素对家兔血糖浓度的影响。 2、掌握血糖浓度的测定方法。 3、掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理和方法。 4、掌握血糖浓度的正常参考值，了解血糖测定的临床意义。 大体内容与时间安排: 1、胰岛素和肾上腺素对血糖浓度影响的原理 5min 2、胰岛素和肾上腺素对血糖浓度影响的注意事项5min 3、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理 5min 4、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的操作改动及注意事项5min 5、学生做实验 100min 教学方法:讲授式+启发式 教学重点、难点: 重点:1、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理 2、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的注意事项 难点:葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的注意事项 一、实验原理 (一)胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 激素是调节机体血糖浓度的重要因素。胰岛素能降低血糖，肾上腺素等激素能升高血糖。 本实验给两只家兔分别注射胰岛素或肾上腺素，取注射前、后兔的静脉血，测定血糖含量，观察注射前后血糖浓度变化，从而了解胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响。
(二)葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 本实验是葡萄糖氧化酶 (GOD)和过氧化物酶 (POD) 相偶联发生的偶联反应。 第一步:葡萄糖氧化酶利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。第二步:过氧化物酶在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原 性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物(苯醌亚胺非那腙)。 二、操作步骤 (一)胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 1、动物准备:取正常家兔两只，实验前预先饥饿16小时，称体重(—般为2-3kg)。 2、注射激素前取血:—般多从耳缘静脉取血:剪去耳毛，用二甲苯擦拭兔耳，使其血管充血，再用干棉球擦干，于放血部位涂 一薄层凡士林，再用粗针头或刀片刺破静脉放血。采用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法时，则将静脉血收集于干净试管中,静置至血清析出。取血完毕，用干棉球压迫血管止血. 3、注射激素:—只兔子注射胰岛素;皮下注射，剂量为kg体重。另一只兔子注射肾上腺素:皮下注射，剂量为kg体重。分别记录注射时间。 4、注射激素后取血:方法同上;取血时间:肾上腺素注射后30分钟;胰岛素注射后1小时。从注射胰岛素的兔子取血后，应立即用10ml 250g/L葡萄糖做腹腔内或皮下注射，以防家兔发生胰岛素休克(低血糖休克)。 5、测定血糖:分别测定各血样的糖含量，方法请见实验四“血糖测定”。 6、计算:计算注射胰岛素后血糖降低和注射肾上腺素后血糖增高的百分率: 血糖改变百分率(%)BS100% 注射前BS BS=注射后BS—注射前BS;“+”值表示BS升高;“—”值表示BS降低(BS—血糖)。 (二)葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 1、取试管3支，按下表操作。 葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤 加入物(ml) 血清 葡萄糖标准应用液
葡萄糖检测试剂盒(邻甲苯胺微板法) 简介： 葡萄糖(Glucose, Dextrose ，Glu)又称玉米葡糖，简称葡糖，化学式C 6H 12O 6，分子量为180.16，是自然界分布最广、最重要的一种单糖，属于多羟基醛。用酶学方法测定葡萄糖是生化检测中的常用方法。 Leagene 葡萄糖检测试剂盒(邻甲苯胺微板法)检测原理是葡萄糖在加热的有机酸中脱水后能与邻甲苯胺缩合呈雪夫氏碱，后者呈蓝绿色，其最高吸收峰为420nm 颜色深浅与葡萄糖含量成正比，经酶标仪与标准品进行对比求得葡萄糖量。本试剂盒专门用于人或动物的血清、血浆、脑脊液、细胞、组织等样本中的葡萄糖含量定量测定。本试剂盒的特点：1、特异性高，其测定结果为真糖值；2、不受还原物质干扰；3、无需去除血浆或血清中的蛋白质。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 样本处理： ①血清、血浆、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围(25mmol/L)，用蒸馏水稀释后检测。 ②细胞样本： a 、取适量的细胞(一般推荐>106以上)，弃上清，留取沉淀。 b 、用PBS 或生理盐水清洗1~2次，，弃上清，留取沉淀。 c 、加入PBS 或生理盐水匀浆，冰浴条件下超声破碎细胞，功率300W ，每次3~5s ，间隔30s ，重复3~5次。亦可手动匀浆，制备好的匀浆液不可离心，待用。亦可用1~2% Triton X-100冰浴，制备好的裂解液不可离心，待用。 ③组织样本：准确称取适量组织样本，按质量(g)：生理盐水或PBS(ml)=1：9的比例，加入生理盐水或PBS ，冰浴条件下手动或机械匀浆。2500~3000g 离心10min ，取上清待用。 2、 制作葡萄糖标准曲线：取离心管5支，依次加入Glu 标准(10mg/ml)0.125ml 、0.25ml 、 0.5ml 、0.75ml 、1.0ml ，再以蒸馏水稀释至2.5ml 。具体见下表： Glu 标准(10mg/ml)(μl) 12.5 25 50 75 100 蒸馏水(μl) 237.5 225 200 175 150 编号 名称 TC0715 100T Storage 试剂(A): Glu 标准(10mg/ml) 1.5ml 4℃ 避光 试剂(B): O-Toluidine 显色液 50ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 【实验目的】 观察胰岛素和肾上腺素对家兔血糖浓度的影响。 掌握血糖浓度的测定方法。 掌握血糖浓度的正常参考值、了解血糖测定的临床意义。 【实验原理】 血清中的糖称为血糖，绝大多数情况下都是葡萄糖。体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，所以血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在清晨空腹血糖浓度为80～120毫克/100ml。 使血糖浓度降低的激素：胰岛素 胰岛素对血糖的调节机制，首先是使肌肉和脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性增加，利于血糖进入这些组织进行代谢。胰岛素还能诱导葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的合成，医学教|育网搜集整理加速细胞内葡萄糖的分解利用。胰岛素通过使细胞内cAMP含量减少，激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶系，抑制磷酸化酶和糖异生关键酶等，使糖原合成增加，糖的氧化利用、糖转变为脂肪的反应增加，血糖去路增快；使糖原分解和糖异生减少或受抑制，使血糖来源减少，最终使血糖浓度降低。 使血糖浓度升高的激素：肾上腺素 肾上腺素的作用机制是通过肝和肌肉的细胞膜受体、cAMP、蛋白激酶级联激活磷酸化酶,加速糖原分解,使血糖升高.在肝脏,糖原分解为葡萄糖,在肌肉,则经糖酵解途径生成乳酸,并通过乳酸循环间接升高血糖水平.主要在应急情况下发挥调节作用.是强有力升高血糖的激素。 邻苯甲胺法：本实验采用邻甲苯胺法测定血糖，其原理是葡萄糖在酸性介质中加热脱水反应生成5－羟甲基－2－呋喃甲醛，分子中的醛基与邻甲苯胺缩合成青色的薛夫氏碱，通过比色可以定量 【实验试剂】 肝素抗凝剂、凡士林、二甲苯、抗凝剂、胰岛素、0.1%肾上腺素液、邻苯甲胺试剂、蒸馏水、葡萄糖标准液 【实验操作】 1.动物准备及采血 取空试管4支，编号1,2,3,4，分别加入肝素抗凝剂0.01ml。取空腹16小时以上的家兔两只，分别编号1,2，称体重并记录。 用耳静脉采血法:先剪去兔儿静脉的毛，再用二甲苯擦拭兔耳部静脉，使其充血，在其周围抹上凡士林防止血液污染，用刀片轻轻挑破边缘耳静脉，放血入含抗凝剂的试管1和2，约需2ml至3ml，边滴边摇，以防凝固，取血完毕，用干棉球压迫血管止血。 2.注射激素并采血 1号兔臀部皮下注射胰岛素，一小时后于心脏取血到抗凝管3，测定血糖，将2号兔臀部皮下注射0.1%肾上腺素液，剂量为每公斤体重0.4ml，观察兔子情况。30mins后，心脏取血入抗凝管4中。心脏采血法：将注射器肝素化后，置家兔于仰卧位，固定四肢，在左侧胸壁3至4肋间，摸到心搏最明显处，垂直进针，深度约3cm，当有落空感时，可感觉针尖随心搏而动，固定针头，采血8ml左右，放入抗凝管中。 3.测定注射前后的血糖 将收集的4管血液离心10mins，取上层血浆，分别制成胰岛素前1，胰岛素后2，肾上腺素前1，肾上腺后2。取干燥的试管6支，编号并按表操作，混匀，放入沸水浴15mins，冷却，
血糖测定方法研究进展 关键词血糖测定方法研究进展 据世界卫生组织估计，全世界目前有超过1.5亿糖尿病病人，我国糖尿病病人人数已超过5000万，是世界上糖尿病人数最多的国家之一。并且以每年150万-200万的新增病人数迅猛上升，糖尿病已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，因此，积极防治糖尿病显得十分重要。 从19世纪后期人们了解到血糖的浓度与糖尿病的关系以后，建立了血糖测定的方法。并不断的改进与发展。正是血糖测定方法的建立、改进和发展，使得人们对糖尿病的诊断有了明确的指标。血糖测定的方法的应用也越来越广泛、越来越便捷。随着人们对血糖水平与并发症之间的联系的深刻认识，从而产生了控制血糖的强化治疗方案，正是血糖测定的方法的建立、改进和发展才使得血糖监测成为现实，为控制血糖的强化治疗方案提供保证。正是血糖测定的方法的建立、改进和发展才使得糖尿病的诊治更精确、前景更美好。下面就其发展作一概述： 1 实验室静脉血浆或血清葡萄糖测定 1.1 斑氏法1908年斑氏(Benidict)首先建立了血糖测定方法，即斑氏法。 1.2 福林-吴氏法Folin-Wu) 通过不断的改进及发展1920年出现了最有代表性的福林-吴氏法Folin-Wu)这是血糖测定的经典方法，连续沿用了近五十年，但该方法最大的缺点是测出的结果比血液葡萄糖的真实值偏高10%-15%。 1.3 邻甲苯胺法1959年由Dultman提出该方法比福林-吴氏法Folin-Wu)的特异性还高，测定结果更准确。但该方法中使用的试剂邻甲苯胺有毒，冰醋酸有较强的刺激气味，对人和仪器都有影响并不能在自动生化仪上使用。 1.4 葡萄糖氧化酶血糖测定方法该方法20世纪70年代由国外开始使用。80年代初国内开始使用，随后在全国广泛推广。该方法具有专一性强，特异性高，操作方便，结果准确，能在自动生化仪上使用的优点。被作为国际公认的诊断糖尿病的唯一的测定方法。该方法采取从体内抽取静脉血，属于有创测定，成为该法的缺点，不仅给病人带来一定的痛苦还会增加伤口局部感染甚至传染上其它疾病的机会，给病人增加了额外的心理负担。
实验（一）十 血糖的测定 血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定，维持在3．9mmol ／L ～6．1mmol ／L 之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一，有着双重实际意义：其一，维持稳定的能源供给，满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二，保证机体不因进食致血糖浓度过高，导致糖的丢失。 因此，血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理的不同，大致分三类：氧化还原法 ，缩合法（主要有邻甲苯胺法），酶法（主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法）。下边介绍两种方法供选择。 一、葡萄糖氧化酶法 【目的】 1. 了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，能进行血糖测定的操作。 2. 掌握血糖测定的临床意义。 【原理】 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase ，GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶 (peroxidase ，POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，即 Trinder 反应。其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在505nm 波长处测定吸光度，与管比较可计算出血糖的浓度。反应式如下： 2H 2O 2+4-氨基安替比林+酚 红色醌类化合物 POD 2H 2O 2H 2O 2 O 2葡萄糖+葡萄糖酸+ GOD + 【器材】 试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】 1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 称取无水磷酸氢二钠8.67g 及无水磷酸二氢钾5.3g 溶于800ml 蒸馏水中，用1mol/L 氢氧化钠（或1mol/L 盐酸）调节pH 至7.0，然后用蒸馏水稀释至1L 。 2. 酶试剂
生化实验试题参考 生物化学实验 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有(双缩脲法)， (紫外吸收法)，( Folin-酚试剂法（或Lowry法） )和（考马斯亮 蓝G-250染色法）。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以（以一定时间内分解的H2O2量）来表示，当CAT 与H2O2反应结束，再用（碘量法）测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以（聚丙烯酰胺凝胶）作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由（Acr）和交联剂（Bis）在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备（分离）胶，其自由基的引发剂是（Ap），催化剂是（TEMED）；光聚合法适于制备大孔径的（浓缩）胶，催化剂是（核黄素）。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：（吸附层析），（分配层析），（离子交换层析），（凝胶层析）和（亲和层析）。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管（等重）且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S 的亲合力愈（大），Km愈大，表示E对S 的亲合力愈（小）。
7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必 须__（打开）____（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植 物的（抗逆性）密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流 动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而 成的，在具有自 由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：（化学法）和（光聚合法）。 11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：（柱层析），（纸层析），（薄层层析）和（薄 膜层析）。 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极 方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结 构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的 分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
题目激素对血糖浓度的影响及血糖浓度的测定 系部医学院 专业临床 班级临床1004 学号200909155140 姓名刘兴志 指导教师赵雪花 完成日期2011 年9 月16日
【摘要】 目的: （1）掌握血糖测定的原理和方法。 （2）掌握血糖正常的范围和意义。 （3）熟记胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响，并解释其作用机制。 方法： 取正常家兔两只，饥饿14-16小时，各空腹取血10ml，在相同的实验条件下，其中一只注射胰岛素（5单位/公斤），另一只注射肾上腺素（0.5mg/只），半个小时后再次取血。测量血糖浓度。 结果：注射胰岛素的家兔，血糖浓度降低，注射肾上腺素的家兔，血糖浓度升高。 结论：胰岛素可以降低血糖，肾上腺素可以升高血糖。 【关键词】 胰岛素，肾上腺素，血糖浓度。 材料与方法 1.实验材料与试剂 正常家兔两只。肾上腺素（1mg/ml）,胰岛素（5单位/ml）,碘酒，消毒酒精，棉 球，饱和硼酸溶液（6g溶于100ml蒸馏水中摇匀后放置过夜后过滤即可），邻甲苯 胺-硼酸，5%三氯醋酸溶液，饱和苯甲酸溶液， 标准葡萄糖贮存液，标准葡萄糖应用液。 2.实验对象 正常家兔 3.实验方法步骤 3.1取正常家兔两只。实验前预先饥饿14-16h，称其体重并记录（2-3公斤为宜）。 3.2药前取血。先用剪刀剪去家兔耳缘的兔毛，然后用酒精擦拭，使其耳缘静脉充 血，再用干棉球擦干。碘酒，酒精消毒后用7号针头穿刺耳缘静脉，然后用盛 有抗凝剂（草酸钠，2mg/ml血）的小烧杯收集10ml左右的血液。收集时注意 摇匀以防血液凝固。取血完毕，用干棉球压迫止血。 3.3 注射胰岛素和肾上腺素。取血完毕后，给其中一只家兔注射胰岛素（5单位/ 公斤为宜），另一只注射肾上腺素（0.5mg/只为宜）。注射完毕后，稳定家兔情 绪，放回兔笼。 3.4药后取血。药后半小时，再次从耳缘静脉取血。方法同3.2。 3.5制备无蛋白学滤液。用微量加样器取抗凝血0.4ml，滤纸擦净粘附于吸管尖端 外表的血液，缓慢注入洁净小试管。然后加入5%三氯醋酸3.6ml，边加边摇匀。 最后置于离心机中，3000rpm离心五分钟，取得上清液即为无蛋白学滤液。按 此法，可制得药前药后血滤液。 3.6制备待测液。取4支试管，编号，按下表操作。
一、血清谷丙转氨酶（SGPT)赖氏改良法 器材:试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清试剂： （1)0.1mol/L pH7。4磷酸盐缓冲液： ①0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414。22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4℃保存。 ②0。1mol/L磷酸二氢钾溶液:称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4℃保存。 ③将0。1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0。1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴,4℃保存。 （2）标准丙酮酸（含丙酮酸2。0μmol/mL）： 取标准丙酮酸钠10mg,用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。 (3)SGPT底物液(含α—酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml）： 取α—酮戊二酸29。2mg，DL—丙氨酸7g ，用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH 7。4（因为转氨酶在pH7。3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 （4）GOT底物液(DL–天冬氨酸200mmol/L ，α-酮戊二酸 2mmol/L）：称取α—酮戊二酸29。 2mg和DL—门冬氨酸2。66g置于一小烧杯中，加入1mol/L氢氧化钠20。5ml使溶解，并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内，用0。1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。 （5）2。4—二硝基苯肼溶液: 取分析纯2,4—二硝基苯肼19。8mg，用1mol/LHCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。（6）0.4mol/L NaOH溶液: