木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1
实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 三、试剂及仪器 1．福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2． 0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。 3． 0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 4． 2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 5． pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 6．标准酪氨酸溶液： 准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7．仪器：分光光度计、试管 四、操作步骤 1．标准曲线绘制 编号012345678 012345678标准酪氨酸溶液 (mL)[100 g/mL] 水 (mL)1098765432 稀释酪氨酸溶液浓度 (g/mL)01020304050607080 在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g数，即为K值。
酶作用机理和调节 一、选择题 ⒈关于酶活性中心的描述，哪一项正确？（） A、所有的酶都有活性中心； B、所有酶的活性中心都含有辅酶； C、酶的必须基团都位于酶的活性中心内； D、所有的抑制剂都是由于作用于酶的活性中心； E、所有酶的活性中心都含有金属离子 ⒉酶分子中使底物转变为产物的基团是指：（） A、结合基团； B、催化基团； C、疏水基团； D、酸性基团； E、碱性基团
⒊酶原的激活是由于：（） A、氢键断裂，改变酶分子构象； B、酶蛋白和辅助因子结合； C、酶蛋白进行化学修饰； D、亚基解聚或亚基聚合； E、切割肽键，酶分子构象改变 ⒋同工酶是指（） A、辅酶相同的酶； B、活性中心的必需基团相同的酶； C、功能相同而分子结构不同的酶； D、功能和性质都相同的酶； E、功能不同而酶分子结构相似的酶 ⒌有关别构酶的结构特点，哪一项不正确？（） A、有多个亚基； B、有与底物结合的部位； C、有与调节物结合的部位； D、催化部位和别
构部位都位于同一亚基上；E、催化部位与别构部位既可以处于同一亚基也可以处于不同亚基上。 ⒍属于酶的可逆性共价修饰，哪项是正确的？ A、别构调节； B、竞争性抑制； C、酶原激活； D、酶蛋白和辅基结合； E、酶的丝氨酸羟基磷酸化 ⒎溶菌酶在催化反应时，下列因素中除哪个外，均与酶的高效率有关？（） A、底物形变； B、广义酸碱共同催化； C、临近效应与轨道定向； D、共价催化； E、无法确定 ⒏对具有正协同效应的酶，其反应速度为最大反应速度0.9时底物浓度（[S]0.9）与最大反应
旗开得胜速度为0.1时的底物浓度（[S]0.1）二者的比值[S]0.9/[S]0.1应该为（） A、＞81； B、=81； C、＜81； D、无法确定 ⒐以Hill系数判断，则具负协同效应的别构酶（） A、n＞1； B、n=1； C、n＜1； D、n≥1； E、n≤1
碱性蛋白酶 产品概述 奥迪尔碱性蛋白酶是经原生质体诱变方法选育的枯草杆菌通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。广泛应用于制革、丝绸、食品、医疗、酿造等行业。 产品原理 碱性蛋白酶活性成分属于一种丝氨酸内切碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，在有机溶剂中它还可催化多肽的合成。 产品特性 1.温度范围：有效温度范围20-60℃，最适温度范围在35-45℃。 2.PH值范围：有效pH范围6-11，最适pH值范围9.5-10.5 产品性状 1.产品规格：固体100000u/g，200000u/g粉末（颗粒状）；液体 100000u/ml 液体酶pH（25℃）：7.0-9.0，容重：≤1.25g/ml；固体酶细度（0.4mm标准筛通过率）：≥80%。 2.酶活力定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃±0.2℃、 pH10.5条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。
3.产品标准：执行中华人民共和国国家标准GB/T23527-2009 应用方法 1.碱性蛋白酶用于皮革加工具有简化工序、缩短周期、提高成品质 量、增加的率、降低生产成本等优点。用于浸水工序的加酶量为 0.02-0.1%（按原料质量计，酶活力以10万u/ml计，下同），20- 25℃作用12-20小时；用于皮革软化的加酶量为0.05-0.2%,35-38℃作用3-6小时；用于脱毛的加酶量为0.1-0.3%，20-35℃作用12-20小时。以上使用pH均为9-11. 2.碱性蛋白酶用于丝绸脱胶有丝素不受损伤、不起毛丝和蓬松的效 果。原料经过前处理，按0.8-2.4%加酶，pH9-11,40-50℃的条件下作用30-60min。 3.碱性蛋白酶用于软骨素生产，可有效提高收率和纯度。原料在碱 提取后，按照0.2-0.6%的添加量，pH8-10，温度40-50℃的酶解条件作用4-8小时。 4.碱性蛋白酶用于肝素钠的生产，可提高分子均一性和产品纯度。 原料盐解后按照2-4g碱性蛋白酶每根小肠的加量，在45-60℃、pH9-11的条件下保温4-6小时。 5.碱性蛋白酶用于活性肽等蛋白质原料加工中，可提高营养价值， 易于吸收。推荐用法为：料液比1:3-9，pH值8-10，温度50-
2020年测定蛋白酶活力实验 （课件） 测定蛋白酶活力实验 一、实验目的?１.加深了解酶活力的概念.?2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理?酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μｇ酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Fｏlin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比. 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力. 三、仪器和试剂?仪器：?恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。?原料?枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0２ｍoｌ/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1５分
钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.?试剂?1. Folin－酚试剂：?在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（Ｎａ2WoＯ4 . 2H2O）1０0g，钼酸钠（Na２WｏＯ４. 2H2O）25g,蒸馏水７00mL，８5％磷酸５0ｍL 以及浓盐酸100ｍL,充分混匀后,微火回流加热1０小时。再加入硫酸锂15０g,蒸馏水5０mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NａOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2moｌ/L),然后加水稀释至1mｏｌ／Ｌ，即可使用.?２.0.2mol/L 盐酸溶液3．0.04moｌ/L 氢氧化钠溶液?4．0。5５mol/L 碳 10%三氯乙酸溶液酸钠溶液?5 . 6. ０．0２mol／LpＨ7。5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2ＨPO4 ． 12H2O)7。１6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HPＯ4 .１2H2Ｏ）3.1２ｇ,用水定容至１0０mL(B 液)。取 A 液84mL，Ｂ液１6mL 混合后，得到0．2mol/LpH 7.５磷酸缓冲液，可长期 7。标准酪氨酸溶液存放。临用时稀释10倍即可。? （50μg/mL）：称取１２．5ｍg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2ｍoｌ/L 盐酸约３0mＬ溶解后，蒸馏水定容至２50mL。
YR-ACPro 酸性蛋白酶 ◇产品概述： 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。 包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。 蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。 本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌（Aspergillus）深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 ◇工作机理： 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。 ◇产品特性： 本产品能够产生最大活性的pH范围是2.5-6.0，最适pH值是3.5；温度范围是10-50℃（50-122°F），最适温度是50℃。 ◇产品规格： 产品为固体：酶活力为 10，000 U/g） 酶活力单位定义: 温度为40℃，pH3.0条件下，1分钟内释放1ug酪氨酸所需要的酶量。 ◇使用说明： 用作饲料添加剂时，本产品的添加量为5-10U/g。 在酿造业使用时，本产品的添加比例为5U/g。 ◇产品包装及储存： 本产品的包装规格为25kg/箱。也可根据客户需求提供大小不等的包装。
实验四碱性蛋白酶活力的测定 一、实验原理 以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用 仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器 三、实验步骤 1、酶液的萃取 称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。 2、酶活力的测定 样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。 空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。 将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
文章编号:1006-8481(2007)04-0001-04 蛋白酶的生产和应用(下) 胡学智 (中国科学院上海生物工程研究中心,上海 200000) 摘 要:为充分了解蛋白酶,介绍了我国在中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、低温蛋白酶和耐高温蛋白酶研究概况。 关键词:蛋白酶;研究;概况 中图分类号:TS201.2+5 文献标识码:B The producti on and appli ca ti on of protea se HU Xue -zhi (B i oengineering Research Center,Chinese Acade my of Sciences,Shanghai,200000) Abstract:I n order t o have a better understanding of p r otease,s ome general studies about different p r oteases are intr o 2duced .They are neutral p r otease,alkaline p r otease,acid p r otease,cryo -p r otease and p r otease with high -te mperature t olerance . Key W ords:p r otease;study;general intr oducti on 4 我国对蛋白酶的研制概况 4.1 中性蛋白酶 我国对蛋白酶的研究始于1957年,当年中科院微生物研究所和原轻工业部工业试验所曾收集和保存了一批酱油酿造用曲霉,肖永澜和方心芳等从117株黄绿色曲霉中筛选出了12株蛋白酶活性高的曲霉,其中以栖土曲霉3374的活性最强,将其用于试验蛋白胨。1959年,原上海市轻工业研究所与红光制革厂合作,进行制革原料皮酶脱毛的研究,将脱脂的带毛皮块直接投入众多曲霉培养物中,筛选出适用的菌株,很快就发现了3374效果最好。因此,在原上海酒精厂制曲车间 生产栖土曲霉蛋白酶夫曲作为酶源供制革厂使 用。何秉旺等用紫外线处理栖土曲霉3374得突变株3942,使蛋白酶活力提高28%。李禄先等又筛选出用于丝绸脱胶的芽孢杆菌蛋白酶生产株S 114。1964年,中科院微生物所、江苏省食品发酵 研究所合作,就北微所筛选的枯草杆菌1938蛋白酶的生产条件进行详细研究。1965年完成中试后于新建的无锡酶制剂厂投产。1965年上海市工业微生物研究所对栖土曲霉3942蛋白酶的液体和固体培养工艺条件进行了研究,发现当采用固体培养时,添加3%～5%纯碱,碱性、中性蛋白酶活性可增加30%,采用液体培养时添加洗净剂LS 0.1%,可使通风量下降50%以上,酶活性增加60%。1967年与温州味精厂合作完成中试。 为筛选制革用新菌种,轻工业部食品发酵研究所 收稿日期:2006-07-07 作者简介:胡学智(1929-),男,上海市人,教授级高级工程师。研究方向:生物技术与发酵工程。 ? 1?
碱性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明 分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2300 规格：50T/24样 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一，沸水浴中溶解。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加50mL蒸馏水溶解。 试剂五：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。 产品说明： AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。 在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、 1.5mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组
织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 2.血清或培养液：直接测定。 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三和试剂四置于40℃水浴保温30min。 3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂二，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。 4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二） 5.空白管：取一支EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。 6．标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 三、计算公式： 1.按照样本蛋白浓度计算 AKP活性单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。AKP活性（nmol/min/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白
2013/05/13 紫外分光光度法测蛋白酶酶活 1、原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 2、试剂和溶液 三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。 2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制。 2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 2.4 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
酸性蛋白酶生产工艺 1 蛋白酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3酸性蛋白酶的概述 酸性蛋白酶(acidic protease)在 1954 年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量 30000~40000，等电点（pH3~5）。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在其活动中心含有 2 个天冬氨酸残基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。 不同微生物的酸性蛋白酶其氨基酸组成虽有所差别，但性质基本相同，许多性质也与动物胃蛋白酶相似，其活动中心肽键也基本相似，它对 DFP、PCMP （对氯汞苯甲酸）EDTA不敏感，及但能为DNA（二重氮乙酰亮氨酸甲酯）EPNP及（1，
2 环-3-对硝基苯养基丙烷），SDS（十二烷基磺酸钠）等抑制。DNA，EPNP 之所以能引起酶失活是由于活性中心天冬氨酸残基被酯化。DNA 只同有活性的酸反应，而同失活的酶不能反应。P-BPB（对溴酚乙酰溴）虽然也可同酶的1个天冬氨酸残基反应，但同它反应的天冬氨酸的位置与以上两种抑制不一样，故不能引起青霉酸性蛋白酶失活。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。 1.5.2 pH对酶活及酶稳定性的影响 酸性蛋白酶稳定pH范围2.0～4.0之间，最适pH2.5，pH低于2．0、高于4．0将影响水解速度。 1.5.3 温度对酶活性及稳定性影响 酸性蛋白酶适宜温度范围30℃～50℃，最适作用温度为50℃，低于40℃酶活稳定，超过50℃，酶活性损失严重。 1.5.4 金属离子对酶活力的影响 酸性蛋白酶可被Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋离子激活，被Cu2＋、Hg2＋、Al3＋
碱性蛋白酶活力测定 【实验目的】 1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 【实验原理】 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 【实验材料】 1.实验器材 电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计 2.实验试剂 (1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na 2WO 4 ·2H 2 O)、125g 钼酸钠(Na 2MoO 4 ·2H 2 O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混 匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。 (2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。 (3)pH10缓冲溶液： 甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na 2B 4 O 7 ·10H 2 O) 19克，用蒸馏水溶解并
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE 酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品 的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋 白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液 每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。 2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液. 3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。 表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序 试剂步骤1：空白调零步骤2：样品测定 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5 mL 2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL 250C预热5min 250C预热5min 胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10 μL 蒸馏水10 μL 0 μL 充分摇匀充分摇匀 步骤1：?A253 nm/min 调0 ----------- 步骤2：?A253-nm/min -------------- 记录 在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5μL -20μL之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落在0.05～0.100之间为止。