酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究
一、概述
本项目2004年获得河南省科技攻关项目的立项支持，项目编号：0424240040。
酶是生物细胞原生质合成且具有高度催化活性的蛋白质。人类早在认识酶之前就知道利用酶为生产和生活服务，例如酿造、鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史。1897年Büchner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳。二十世纪初，有更多的酶被发现和分离提纯，注意到了某些酶的作用需要有低分子物质（辅酶）的参加，并陆续认识了很多酶所催化的反应。1926年Sumner第一次从刀豆中分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶。30年代，J.Northrop 又连续分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500种酶得到结晶，2000多种酶得到鉴定，200种左右商品酶已经开发，但工业上应用的酶仅有50多种。二次世界大战后抗生素工业的通风搅拌发酵技术的利用，使微生物酶制剂工业得到迅速发展。20世纪40年代末，生产α-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。20世纪50年代后期遗传工程、蛋白质工程等现代生物技术的研究成果，促使世界酶制剂工业持续地高速发展，成为生物工程四大主导产业中最早产业化的高技术产业。由于酶制剂是一种绿色高效生物催化剂，具有高效、节能、安全和环保等特点，对酶制剂应用产业开发新产品、提高质量、节能
降耗、保护环境重要意义；因此，这一产业的发展受到各国政府的高度重视，有着广阔的发展前景。
国际酶制剂市场目前保持着9％的增长速度，2010年世界酶制剂年销售额达160亿美元，目前已有一大批可用于工业发酵生产的各种胞外酶的微生物，如芽孢杆菌、大肠杆菌、放线菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品种数量主要有糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、延胡索酸酶、青霉素酰化酶、溶菌酶、链激酶、漆酶、植酸酶、复合酶等等。应用范围覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多领域，创造工业附加值数千亿多元。我国自1965年建立起第一个专业酶制剂工厂，由于不断引进技术、资金和设备，酶制剂工业得到迅猛发展，产量由1965年的10吨增长到2010年的219万吨，平均每年以20％以上的速度增长，产值达6亿多元，应用范围愈来愈广泛。我国酶制剂工业与发达国家相比，存在的差距主要有：（1）技术研究与开发滞后，基础理论研究与技术开发研究严重脱节，科研资金力度不够且分散，科研技术转化能力不强。（2）行业规模小而分散，市场调控能力弱，我国现有100多家酶制剂生产企业，企业数量占世界三分之一还多，但销售额仅占世界酶制剂销售额5％，企业规模小、产品的市场覆盖率低，导致企业对市场的调控能力普遍较弱，企业间无序的
价格竞争使整个行业经济效益下滑，使企业在技术创新、新品种开发、设备更新等方面力量不足，严重制约了酶制剂产业的可持续发展。（3）产品结构不合理，技术落后。我国酶制剂产品主要是以糖化酶、淀粉酶、蛋白酶为主，三者加起来占据全国酶制剂产量的97％，全国一半以上企业生产品种单一，抗市场风险非常弱。（4）酶制剂的应用开发力度不够，制约了酶制剂企业的市场开拓能力。
酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000—40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。
国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉（Aspergillus niger）、大孢子黑曲霉突变株（A. niger var. macrosporus）、斋藤曲霉（A. saitoi）、宇佐美曲霉（A. usamii）、泡盛酒曲霉（A. awamori）、微紫青霉（Pen. janthinellum）、常规青霉（Pen. frequentens）、杜邦青霉（Pen. dupoti）、宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）、小孢米曲霉突变株（A. oryzacvar.
microsporus）、根霉（Rhizopus sp.）、微小毛霉（M. pusillus）、粘红酵母（Rhdotorula glutinis）、粟疫霉（Endothia parasitica）、血红色陀螺孔菌（Trametes sanguinca）、芽枝霉（Cladosporium sp.）等。1903年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。
微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3．350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3．350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌
种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等（1994年）用60Coγ射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等（1995年）以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50℃，90℃下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等（1999年），对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等（2006年）对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等（2007）采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云（2008年）通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。
国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流（沸腾）干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、
稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。
二、酸性蛋白酶制剂的作用机理和酶学特性
1、酸性蛋白酶的作用机理
酸性蛋白酶是一种天冬氨基蛋白酶，分子质量为30~40KD, 在其活性中心有两个天冬氨基残基，其代表性特征是能够在酸性或中性环境条件下水解动植物蛋白质，将两个疏水氨基酸打断，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。微生物酸性蛋白酶对肽键两端的苯环和大的氨基酸基团有较高的专一性，酸性蛋白酶的催化机理是酸碱催化作用，由活性位点的两个天冬氨酸在酸性或碱性条件下交替发挥作用，其中一个天冬氨酸失去质子，另一个天冬氨酸则被质子化。
由于饲用酶进行催化反应在畜禽消化道内进行，故其作用条件必须与动物消化道生理条件相适应，而通常猪和家禽消化道内温度为40℃左右，而胃pH1.5—3.5，小肠pH5—7，与酸性蛋白酶作用的一些基本参数相吻合。畜禽尤其是幼龄动物的消化道内蛋白酶分泌体系发育不健全而在生长的中后期，自身虽有内源酶，但尚显不足，当采用高蛋白饲料饲养时，因其对饲料蛋白质消化能力较差而易引起腹泻等疾病。尤其是断奶仔猪，消化道发育不成熟，消化酶分泌系统不健全，特别是胃酸分泌不足，免疫功能低下，加上断奶时的生理、营养和环境应激反应，对饲料的营养成分不易消化和吸收，对病原微生物的抵抗力较弱，易造成正常肠道菌群平衡紊乱，经常出现较高的腹泻率，导致早期生长受阻。若在饲料中添加酸性蛋白酶，则能补充内源酶的不足，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽、胨及各种氨基酸，
而易被畜禽消化吸收，从而降低饲料对断奶仔猪消化道的刺激，降低应激反应，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进生长。
2、酸性蛋白酶的酶学特性
酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物，不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的性质，但在底物pH值、特异性、抑制剂、激活剂等方面均存在着一定的差异。
(1)pH对酶活及酶稳定性的影响
酸性蛋白酶在pH2.0～6.0之间较为稳定，但不同的微生物所产酶的最适作用有所不同。曲霉属酸性蛋白酶最适作用pH值为2．5～4．0，稳定pH值为1.5～6.0。斋藤曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH 值为2．0～3．0，稳定pH值为1.5～6.0。米曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为3．0～4．0，稳定pH值为3.0～6.0。宇佐美曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2.5，稳定pH值为2.0～3.5。青霉属所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2．0～3．0，稳定pH值为1.5～6.5。酸性蛋白酶对pH值的要求，与酶活性中心的羧基有关。
（2）温度对酶活性及稳定性影响
酸性蛋白酶一般在50℃以下较为稳定，但也随产酶微生物的不同而有所差异。如根霉属所产酸性蛋白酶在30℃下只能保持30分钟，而曲霉属的斋藤曲霉所产酸性蛋白酶在50℃稳定，55℃处理10分钟才会失活。黑曲霉Vs、V315 菌株所产酸性蛋白酶在80℃保温2小时后仍有90%的酶活力存在。青酶属产的门冬氨酸蛋白酶，最适pH值条件下，50℃时达到最大酶活。酵母菌所产酸性蛋白酶经60℃处理后
还剩少许酶活力，经70℃处理后酶活完全丧失。
（3）金属离子对酶活力的影响
Ag＋对酸性蛋白酶有轻度抑制作用，当其浓度为5mol/L时，酶活下降15% ;Cu2＋、Mn2＋对其有激活作用，当Cu2＋的浓度为0.02mol/L时，对酶有明显的激活作用；Cu2＋、Mn2＋和Al3＋同时添加时，对酶有协同作用，使酶活提高1倍；Ca2＋本身并不抑制酸性蛋白酶的活性，但它可作为其它物质的辅助因子而对某些酸性蛋白酶产生抑制作用。液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较多。
（4）抑制剂对酶活力的影响
通常酸性蛋白酶的活性中心肽段是基本相似的，抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌来源的酸性蛋白酶通常并不受胃蛋白酶抑制剂—对-溴苯的抑制，但却对N-溴代琥珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。此外，并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂(S-PI) 抑制,这可能与酶的活性部位含酪氨酸以及色氨酸有关。
三、酸性蛋白酶高产菌株（Aspergillus niger—Y06）的选育研究
1、材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 出发菌株
黑曲霉（Aspergillus niger）中国工业微生物菌种保藏中心提供，CICC编号：3.4309
1. 1. 2 培养基
1. 1.
2. 1 分离及斜面培养基
斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基, 分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白。PDA培养基：取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，加葡萄糖 20克，琼脂 15-20克，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，自然PH，分装试管，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。察氏培养基：硝酸钠3g 、磷酸氢二钾1g 、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g 、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g 、蒸馏水1000mL ，加热溶解，自然PH，分装后121℃灭菌20min。。
1. 1.
2. 2 固体发酵基础培养基
麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2，每1 kg 培养基中添加硫酸铵1.5%, 水750 ml, 调pH6.5。
1. 1.
2. 3 液体发酵培养基
豆饼粉3.65% , 玉米粉0.625% , 鱼粉0.625%, 硫酸铵1.0% , CaCl2 0.5% , Na2HPO4 0.2%, 豆饼水解液6%, pH5.5。
2、实验方法
2. 1 菌种的分离和纯化
采用常规稀释分离法。
2. 2 菌株的诱变处理
2. 2. 1 紫外线诱变处理
用接种环取新鲜PDA斜面上的黑曲霉孢子少许, 加入无菌水中进行稀释,用血球计数板进行计数, 使每毫升溶液中孢子量约为5000 个, 取0.1 ml涂布初筛平板, 30℃培养4 h, 让孢子萌发, 紫外灯预热30min后，将平皿放置距离紫外灯30cm处分别照射4 min、6 min、8min、1 0min、12min，随后用5mL无菌生理盐水将平皿上的菌洗脱，适当稀释后，涂布于分离平皿，以黑布包裹30℃培养3-4天，从长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种。
2. 2. 2 亚硝基胍诱变处理
用接种环取新鲜PDA 斜面上的黑曲霉孢子少许, 加入无菌水中进行稀释, 用血球计数板进行计数, 使每毫升溶液中孢子量约为5 000个, 取3ml孢子悬液, 加入等体积的亚硝基胍溶液, 充分混合, 于31℃振荡处理1h, 取出稀释涂平板, 31℃培养5d, 挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验。
2. 3 固体培养方法
挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500 ml三角瓶中, 培养温度为31℃, 培养时间5d, 测定酶活。
2. 4 液体培养方法
挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50ml 液体培养基的500ml三角瓶中, 培养温度为31℃, 培养时间3d, 测定酶活。
2. 5 固体培养方法
挑取一环生长在PDA 斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500ml三角瓶中, 培养温度为31℃, 培养时间5d, 测定酶活。
2. 6 液体培养方法
挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中,培养温度为31℃,培养时间3d,测定酶活。
2. 7 酶活测定方法
酸性蛋白酶酶活力的测定采用河南省瑞特利生物技术有限公司
产品企业标准（Q／HRS 018-2011）相关方法。
3、菌株选育结果
3.1 紫外线诱变
为了提高菌体的发酵水平或改良生产菌，过去经典的理化诱变育种技术仍然广泛的被采用，本实验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿。紫外照射孢子成活率结果如表1所示。
表1 紫外照射孢子成活结果
为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株, 经紫外线诱变处理后, 得到10O余株突变株。这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定,获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示。其中5株产酶较高, 分别为z-10株9284 U / g （干基）、z-09 株8887 U / g （干基）、z-12 株8645 U/ g （干基）、z-17 株8199U / g （干基）、z-08株8018 U / g （干基）。
表2 菌株产酸性蛋白酶活力
3.2 亚硝基胍诱变
选择经紫外线诱变产酶最高的z-10菌株用亚硝基胍进行进一步
诱变处理, 由酪蛋白平板初筛得到菌株36 株, 经摇瓶复筛得到菌株10株, 此10株再经三角瓶固体发酵复筛。酶活超过2.5万U/g （干基）的菌株有4株, 基中二株产酶最高, 分别为Y06株36134 U/ g （干基）、Y05株34324U/g（干基）。选择酶活最高的菌株Y06株进行酸性蛋白酶生产性试验。亚硝基胍诱变的结果如表3所示。
表3 亚硝基胍诱变的菌株产酶情况
四、影响酸性蛋白酶菌株（Aspergillus niger—Y06）产酶因子的研究
1 材料与方法
1.1 材料
菌种，黑曲霉Y06，本项目选育保藏于河南省瑞特利生物技术有限公司。
1．2 培养基和培养方法
(1)基础培养基、查氏培养基。
(2)培养方法．按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1 000 mL三角瓶中，在0．1 Mpa压力条件下灭菌30 min
后，冷却接种，接种量为3%，于不同条件下发酵84h，干燥后，进行酶活的测定。
2、固体培养基组分对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
(1)不同比例碳源对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
按不同比例将玉米粉添加到基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2）中，以补充碳源，于3O℃、初始pH值为6．5和含水量为38%条件下发酵，观察补充玉米粉对酸性蛋白酶活性的影响，结果见图1。由图1可以得出，酸性蛋白酶菌株产酶最大时玉米粉添加量为2.0 ，此后随着玉米淀粉添加量的增加，基质易结团而影响氧的传递，酸性蛋白酶急剧下降。
(2)不同比例氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
为了使菌株生长更好，并对菌株产酶进行诱导，在培养基中添加豆粕粉作为补充氮源，于33℃、初始pH值为6．5和含水量为38%条件下发酵，考察其对酶活产生的影响，结果见图2。从图2可以看出，在培养基中添加不同比例的豆粕粉，对酶活的产生都有促进作用，随着
豆粕粉含量的增加，产品的酶活力有上升的趋势，在9％时酶活力达最高值。
(3)水分含量对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
对于固态发酵来说，控制培养基的水分是固态发酵过程中的重要环节之一。适宜的含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖。过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使基质膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长。含水量过高过低都对黑曲霉生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活性。本研究将黑曲霉分别接种到初始pH 值为6．5，含水量分别为3O、34、38、42、46和5O的固态发酵培养基上，在33℃下进行发酵培养试验，结果如图4。结果表明含水量38%时酸性蛋白酶菌株产酶达最高值。
(4)pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
为了研究发酵培养基的pH值对酸性蛋白酶菌株产酶活性的影响，根据固体培养基难以调节pH 特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整。实验在培养基初始含水量为38%，温度为33℃条件下发酵84 h，观察发酵培养基pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5。结果见图4。
(5)温度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行．为寻求合适的发酵温度，本项研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为38% 、pH值为6．5的条件下培养84h，对27℃、30℃、33℃、37℃和40℃不同温度分别进行发酵培养，测定酶活力，证明酸性蛋白酶菌株产酶发酵最适温度为33℃，结果见图5。
（6）不同铵盐不同浓度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重
要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，发酵结果如图6。由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势。氯化铵的浓度对产酶基本没影响。
碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用。
（7）不同磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要。在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果。本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验。，通过改变无机磷的种类和含量，于33℃、初始pH值为6.5和含水量为38％条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7。添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加0．2% 的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大。
3、酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线
固体发酵采用基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2）、含水量38%、初始pH值为6.5、添加0．2%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33℃进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8。由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，0～24 h发酵产酶速度较缓；24～60 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72h后，进程曲线趋于平缓，84 h 酶活力最高，其酸性蛋白酶活力（干基）达到36500 U／g，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72h。
五、酸性蛋白酶酶活力稳定性研究
黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH 较低, 与畜禽体内消化系统基本一致, 用于饲料添加剂添加饲料中, 可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足, 提高蛋白质消化率, 降低畜禽代谢性腹泻的发生。近年来, 随着饲料工业的快速发展, 酸性蛋白酶作为一种生物饲料添加剂表现出的潜能越来越被人们所关注。但酸性蛋白酶作
为饲料添加剂, 它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响, 而且还受饲料中部分金属离子的影响,而这些过程中酶活极易受损, 从而影响其作为饲料添加剂的效果。本项研究对黑曲霉菌株（Aspergillus niger ）所产酸性蛋白酶的稳定性进行了研究。
1、pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响
酸性蛋白酶在一定pH 范围内酶活力比较稳定（如图9）。当反应环境pH为3.5, 酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%, 在pH为4.0 时, 相对酶活力最高达90%, 可以确定pH为4.0时是酸性蛋白酶最适反应pH值。pH值过高或过低明显影响酶活力,在pH 为5.0时, 相对酶活力只有65%, 在pH为2.5时, 相对酶活力也只有70%。
2、温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响
酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）。一方面是当温度升高时, 酸性蛋白酶反应速率加快, 另一方面由于随
着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性, 引起酶反应速率
下降。酸性蛋白酶适宜的反应温度为35～40℃, 在40℃相对酶活力表现出最高, 在低于30℃或者高于45℃时, 相对酶活力明显下降。因此认为40℃的反应温度是酸性蛋白酶最适宜的温度。
酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质, 一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活,随着温度的升高变性的时间越快, 酶失活也就越迅速。如图11所示，酸性蛋白酶在70℃时, 随着时间的延长酶活力开始下降。固体酶在烘箱中70℃保温至5min 保留有90%的相对酶活力,当时间延长至10min时, 剩余酶活有80%，30min时，剩余酶活仍有19.8%，这提示固体酸性蛋白酶有着较好的抗高温性能。
3、不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响
产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法 武汉轻工大学食品学院王宏勋 一、课堂报告依据的知识背景 1、遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。 PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。
1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。 2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。 3、基因和性状 1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定——基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作
赖氨酸高产菌株的选育 摘要：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。 关键词：赖氨酸，菌种选育，基因改造，高通量筛选 Breeding of high-yielding lysine producers Abstract:L-lysine as an important amino acid for livestock has been increasing in demand, all traditional lysine producers have been created over many years by multiple rounds of random mutagenesis and selection. In recent decades, the development of recombinant DNA techniques and increased understanding of the biochemistry of metabolic reactions has enabled the identification of genetic targets for improved lysine production,and the successful optimization of a wild-type strain into a high-producing cell factory may serve as foundation to combine rational design of metabolic blueprints with targeted genetic engineering and integrated omics analysis for engineering microbial metabolism. Here, we describe the development of a genetically defined process of L-lysine hyperproducing by systems metabolic engineering of the wildtype and the method combining with high throughput screening (HTS) permits the efficient and rapid cloning of rarely transcribed differentially expressed genes. The experimental strategy virtually excludes the possibility of isolating false positive clones. Keywords: Lysine, Strain optimization, Genetic modification, High throughput screening L-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。随着L-赖氨酸的需求量急剧增加，L-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
高产淀粉酶菌株的筛选 一：前言 1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。 关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。 二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台 实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液 培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉 三：实验步骤 1培养基的制备及其仪器的灭菌
高产胞外蛋白酶菌株的选育生命科学学院生物科学0901班王亚云 2009044020119 摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；诱变；鉴定 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基： 1.1. 2.1 筛选培养基： 酪素培养基 1.1. 2.2营养培养基： 肉汤培养基 1.1. 2.3鉴别性培养基 （1）淀粉培养基 （2）明胶培养基
（3）葡萄糖发酵培养基 （4）葡萄糖蛋白胨培养基 乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。 1.2 方法 1.2.1 菌种的筛选 1.2.1.1 培养基的配置及灭菌 按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。 1.2.1.2 涂布分离 称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化 观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。 将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备 在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep 管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变
陇东大学 学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 生命科学与技术学院 08生物技术班 作者： 指导教师： 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍
(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
柠檬酸高产菌株的选育 222011********* 刘亚超 2011级生物技术 关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵 摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。 引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌种 以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。 1.1.2培养基 分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。 1.1.3 试剂及仪器 3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离纯化 用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。 1.2.2 初筛 用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。取各个不
产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定 摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。 关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定 Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing Strains Wensi Hou (Yanshan university , Liren college , Hebei 066004) Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect. Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification 1．碱性蛋白酶 1.1简介 碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 1.2碱性蛋白酶的理化性质 微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60℃以下。 碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活性基团,因此,一些金属离子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)
实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一基本原理 ?自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白 水解圈。 ?水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 ?碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 ?原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化 合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。 二实验目的 ?学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 ?学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 ?掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三实验器材 1 菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四操作步骤 1 培养基和试剂的配制 （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml 水中，二液等量混合。 （4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH 缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。 2 酶活标准曲线的制作 用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。 3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株
微生物学设计性实验报告 项目组长＿学号＿＿成员专业＿生物科学班级＿＿实验项目名称＿土壤中微生物的分离及分类＿指导教师及职称＿＿＿开课学期至学年＿＿学期上课时间 从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 一、摘要 本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的及要求 1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。 三、实验仪器设备 主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等 主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液 四、实验方案设计 （一）实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。 2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。 3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定 作者刘艳芝指导教师张玲秀 （忻州师范学院生物系1201班034000） 摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L 的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化 蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。 一、材料及方法： 1.1 实验材料与仪器 实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 1.2 实验材料： 样品：取自忻州师范学院附近的土壤。 试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、 0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基 二、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH 7.2，配制200mL 酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml 产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml （二）分离 1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min