天津理工大学
硕士学位论文
酶催化机理及蛋白质折叠的研究
姓名：邢达杰
申请学位级别：硕士
专业：应用化学
指导教师：黄积涛
20090501
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性
酶 山东省青岛市城阳第一高级中学高二（二）班 作者姓名：孙一丹王辉韩德琛 指导教师：杨永丰 摘要：大千世界，无奇不有，最奇莫过于生命：而生命，则是一大群化学反应的有机结合体。在这不计其数的反应中，酶，作为其中极重要的一员，无时无刻不控 制影响着生命体的新陈代谢。下面我们将探索神奇的酶世界。本文中将介绍一 种我们自主设想的模型——“带孔的橡皮球”，浅释酶的催化原理。 注：本文中图片均为借助画图板工具手工绘制。 关键词：酶催化原理酶工程 酶的神奇 氧分子是很挑食的，如果不同时给它四个电子，它就不吃。似乎这么慷慨大方的只有碱金属，要不然，谁愿意在常温下给那么多电子啊。但在生物体内却大不相同。是什么能让有机物在体内安静的与氧分子化合？是酶。纤维素是由D-葡萄糖以β1，4-糖苷键连接而成的，如果靠氢离子来分解，需要稀酸加压或浓酸才能催化，而一些以纤维素为碳源的细菌真菌，则可以通过纤维素酶在温和的条件下来分解它们，从而得到养分。 一且生物的几乎所有的生命活动都离不开酶，正是因为有酶协调有序参与才使生命新陈代谢有条不紊地进行着。 酶为什么有这么强大的功能？ 下面我们来探讨这个问题。 关于酶 酶是一种高效的生物催化剂，其化学本质是蛋白质。当然也有少数酶是RNA，叫做核酶。所以要认清酶的真面目，首先要搞明白蛋白质的化学情况。 一、蛋白质档案 蛋白质的基本组成单位是氨基酸。在500余种天然氨基酸中，只有20种参与构成了绝大多数的蛋白质。由于除了甘氨酸之外的氨基酸都含有手性碳原子，所以氨基酸有L和D之分。构成生物体的氨基酸基本是L型。 根据其侧链集团的性质，这20种氨基酸可分为酸性氨基酸、碱性氨基酸和非极性氨基酸。 由氨基酸互相脱水缩合而形成的聚酰胺肽长链，叫做肽链。肽链的羧基端称为C-端，氨基端称为N-端。蛋白质是有一条或多条肽链构成的，有的还携有辅酶或辅基、金属离子。 蛋白质是有其构成层次的。1951年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang第一次提出蛋白质的一、二、三级结构概念，1958年美国晶体学家Bernal提出蛋白质的四级结构概念。后经国际生物化学与分子生物学协会（IUBMB）的生化命名委员会采纳并作出定义。 一级结构是指蛋白质肽链中氨基酸的种类和排列顺序。如：
酶作用机理和调节 一、选择题 ⒈关于酶活性中心的描述，哪一项正确？（） A、所有的酶都有活性中心； B、所有酶的活性中心都含有辅酶； C、酶的必须基团都位于酶的活性中心内； D、所有的抑制剂都是由于作用于酶的活性中心； E、所有酶的活性中心都含有金属离子 ⒉酶分子中使底物转变为产物的基团是指：（） A、结合基团； B、催化基团； C、疏水基团； D、酸性基团； E、碱性基团
⒊酶原的激活是由于：（） A、氢键断裂，改变酶分子构象； B、酶蛋白和辅助因子结合； C、酶蛋白进行化学修饰； D、亚基解聚或亚基聚合； E、切割肽键，酶分子构象改变 ⒋同工酶是指（） A、辅酶相同的酶； B、活性中心的必需基团相同的酶； C、功能相同而分子结构不同的酶； D、功能和性质都相同的酶； E、功能不同而酶分子结构相似的酶 ⒌有关别构酶的结构特点，哪一项不正确？（） A、有多个亚基； B、有与底物结合的部位； C、有与调节物结合的部位； D、催化部位和别
构部位都位于同一亚基上；E、催化部位与别构部位既可以处于同一亚基也可以处于不同亚基上。 ⒍属于酶的可逆性共价修饰，哪项是正确的？ A、别构调节； B、竞争性抑制； C、酶原激活； D、酶蛋白和辅基结合； E、酶的丝氨酸羟基磷酸化 ⒎溶菌酶在催化反应时，下列因素中除哪个外，均与酶的高效率有关？（） A、底物形变； B、广义酸碱共同催化； C、临近效应与轨道定向； D、共价催化； E、无法确定 ⒏对具有正协同效应的酶，其反应速度为最大反应速度0.9时底物浓度（[S]0.9）与最大反应
旗开得胜速度为0.1时的底物浓度（[S]0.1）二者的比值[S]0.9/[S]0.1应该为（） A、＞81； B、=81； C、＜81； D、无法确定 ⒐以Hill系数判断，则具负协同效应的别构酶（） A、n＞1； B、n=1； C、n＜1； D、n≥1； E、n≤1
YR-ACPro 酸性蛋白酶 ◇产品概述： 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。 包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。 蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。 本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌（Aspergillus）深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 ◇工作机理： 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。 ◇产品特性： 本产品能够产生最大活性的pH范围是2.5-6.0，最适pH值是3.5；温度范围是10-50℃（50-122°F），最适温度是50℃。 ◇产品规格： 产品为固体：酶活力为 10，000 U/g） 酶活力单位定义: 温度为40℃，pH3.0条件下，1分钟内释放1ug酪氨酸所需要的酶量。 ◇使用说明： 用作饲料添加剂时，本产品的添加量为5-10U/g。 在酿造业使用时，本产品的添加比例为5U/g。 ◇产品包装及储存： 本产品的包装规格为25kg/箱。也可根据客户需求提供大小不等的包装。
20 ～ 20 学年度第学期 教师课时授课教案 学科系：医学院授课教师： 专业：科目：生物化学 教研室主任签字：学科系系办主任签字：年月日年月日
第二节酶促反应的特点与作用机制 一、酶促反应的特点 酶是一类催化剂，具有一般催化剂的特征:在化学反应前后没有质和量的改变;只能催化热力学上允许进行的反应;只加速可逆反应的进程，不改变平衡点;对可逆反应的正反应和逆反应都具有催化作用。但酶的化学本质是蛋白质，又具有一般催化剂所没有的特征。 (一）高度的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107-1013倍。例如蔗糖酶催化蔗糖水解的速率是H+催化作用的2.5×1012倍，脲酶催化尿素的水解速率是H+催化作用的7×1012倍，且不需要较高的反应温度。研究表明，酶能更有效地降低反应的活化能，使参与反应的活化分子数量显著增加，从而大大提高酶的催化效率。 (二)高度的专一性 一种酶只能催化一种或一类化合物，或一种化学键，发生一定的化学反应，生成一定的产物，这种特性称为酶的专一性或特异性。根据酶对底物选择的严格程度不同，酶的专一性可分为三种类型。 1.绝对专一性酶只作用于某一特定的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定的产物，称为绝对专一性。例如，尿酶只催化尿素水解成NH3和CO2，而对尿素的衍生物如甲基尿素没有催化作用。 2.相对专一性有些酶能作用于一类化合物或一种化学键，这种不太严格的选择性称为相对专一性。如磷酸酶对一般的磷酸键都能水解，不论是甘油磷酸酯，还是葡萄糖磷酸酯;蔗糖酶不仅水解蔗糖，
也能水解棉子糖，使之生成蜜二糖和果糖。 3.立体异构专一性有些酶对底物的立体构型有要求，仅作用于底物的一种立体异构体，这种特性称为酶的立体异构专一性。如L-氨基酸氧化酶只作用于L-氨基酸，对D-氨基酸则没有催化作用;淀粉酶只能水解淀粉中的α-1，4-糖苷键，而不能水解纤维素中的β-1，4-糖苷键。 (三)酶具有不稳定性 酶所催化的反应都是在比较温和的条件下进行的，如常温、常压、接近中性的环境等。由于酶的化学本质是蛋白质，任何能引起蛋白质变性的理化因素，如强酸、强碱、重金属盐、高温、紫外线、X射线等均能影响酶的催化活性，甚至使酶完全失活。 (四)酶促反应具有可调节性 酶促反应受多种因素的调控，以适应内外环境变化和生命活动的需要。例如在细胞内酶的分布具有区域化;酶原的激活使酶在合适的环境被激活和发挥作用;代谢物对关键酶、变构酶的抑制与激活和酶的共价修饰等调节;酶的含量受到酶蛋白合成的诱导、阻遏与酶降解速率的调节。 二、酶的作用机制 (一)酶能更有效地降低反应活化能 在任何一种热力学允许的反应体系中，底物分子所含能量各不相同，只有那些能量达到或超过一定水平的过渡态分子(即活化分子)オ有可能发生化学反应，底物分子达到活化分子所需要的最小能量称为
酸性蛋白酶生产工艺 1 蛋白酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3酸性蛋白酶的概述 酸性蛋白酶(acidic protease)在 1954 年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量 30000~40000，等电点（pH3~5）。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在其活动中心含有 2 个天冬氨酸残基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。 不同微生物的酸性蛋白酶其氨基酸组成虽有所差别，但性质基本相同，许多性质也与动物胃蛋白酶相似，其活动中心肽键也基本相似，它对 DFP、PCMP （对氯汞苯甲酸）EDTA不敏感，及但能为DNA（二重氮乙酰亮氨酸甲酯）EPNP及（1，
2 环-3-对硝基苯养基丙烷），SDS（十二烷基磺酸钠）等抑制。DNA，EPNP 之所以能引起酶失活是由于活性中心天冬氨酸残基被酯化。DNA 只同有活性的酸反应，而同失活的酶不能反应。P-BPB（对溴酚乙酰溴）虽然也可同酶的1个天冬氨酸残基反应，但同它反应的天冬氨酸的位置与以上两种抑制不一样，故不能引起青霉酸性蛋白酶失活。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。 1.5.2 pH对酶活及酶稳定性的影响 酸性蛋白酶稳定pH范围2.0～4.0之间，最适pH2.5，pH低于2．0、高于4．0将影响水解速度。 1.5.3 温度对酶活性及稳定性影响 酸性蛋白酶适宜温度范围30℃～50℃，最适作用温度为50℃，低于40℃酶活稳定，超过50℃，酶活性损失严重。 1.5.4 金属离子对酶活力的影响 酸性蛋白酶可被Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋离子激活，被Cu2＋、Hg2＋、Al3＋
酶的作用机制和酶的调节 重点综述 1. 酶作用机制：有专一性机理(锁与钥匙学说和诱导契和假说)和高效性的机理，以后者出现偏多，而且考查的题型上也是多样化(填写、选择、判断、问答等)。 （1)酶作用机理的两种学说，可以只作一般性的了解。 (2)酶作用高效性的机理要重点掌握。体现在以下5个方面：①靠近与定向；②变形与扭曲；③共价催化；④酸碱催化；⑤酶活性部位的低介电区。 在这一部分中，还要了解某些酶的作用原理： ①溶菌酶：活性部位有Clu3，和ASP52典型的酸碱催化。 ②胰凝乳蛋白酶：活性部位有ASPl02、His57和Serl95组成的电荷拉力网。 ③羧肽酶A：含金属离子zn2＋的酶。 2. 酶的调节：酶调节的类型(共价调节，化学修饰，酶原激活，酶含量在分子水平的调节)。 几个概念也很重要：别构酶，调节酶等。 （一）名词解释 1.变构酶（allosteric enzyme）；2．同工酶（isozyme）；3．活性中心（active center）；4. 酶原的激活（activation of zymogen）； 5. 别构效应（allosteric effect）； 6. 正协同效应（positive cooperative effect） （二）选择题（在备选答案中选出1个或多个正确答案） 1. 酶原激活的实质是 A. 激活剂与酶结合使酶激活 B. 酶蛋白的变构效应 C. 酶原分子一级结构发生改变从而形成或暴露出酶的活性中心 D. 酶原分子的空间构象发生了变化而一级结构不变 E. 以上都不对 2. 同工酶的特点是 A. 催化相同的反应，但分子结构和理化性质不同的一类酶 B. 催化相同反应，分子组成相同，但辅酶不同的一类酶 C. 催化同一底物起不同反应的酶的总称 D. 多酶体系中酶组分的统称 E. 催化作用，分子组成及理化性质相同，但组织分布不同的酶 3. 乳酸脱氢酶（LDH）是一个由两种不同的亚基组成的四聚体。假定这些亚基随机结合成四聚体，这种酶有多少种同工酶？ A. 两种 B. 三种 C. 四种 D. 五种 E. 六种 4．下列关于酶活性中心的叙述哪些是正确的 A.是由一条多肽链中若干相邻的氨基酸残基以线状排列而成 B．对于整个酶分子来说，只是酶的一小部分 C．仅通过共价键与作用物结合
货号：QS2300 规格：50管/24样酸性蛋白酶（Acid protease, ACP）试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。 测定原理： 酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算ACP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10 mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10 mL试剂一，沸水浴溶解。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入50 mL蒸馏水溶解。 试剂五：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液，4℃避光保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 2.血清或培养液：直接测定。 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。 3. 对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A对照管。 4. 测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二） 第1页，共2页
酶的反应机理如下： 蛋白质的空间结构去看，而不能孤立地看形成蛋白质后的氨基酸残基。因为酶一般都是具有三级，或四级空间结构的，其中有功能的是部分氨基酸残基形成的结构域，包括底物结合部位和催化部位。首先底物结合部位和底物结合，再由催化部位作用，形成过渡态中间体，进而使底物发生化学变化。 生物学中的酶是具有高活性的蛋白分子。它的作用机理 有很多种，如趋近作用，亲核作用，亲电子作用等。 它具有高效性，专一性，条件性（条件严格，因为蛋白质容易变性） 而化学里讲的催化剂只具有一般的催化作用， 其作用机理是降低化学反映的活化能。 ----------------------------------------------------------- 生化中酶的作用机理： 酶的作用机理 酶催化反应机理的研究是当代生物化学的一个重要课题。它探讨酶作用高效率的原因以及酶反应的重要中间步骤。 酶原的激活(proenzyme activation)着重研究酶在激活——由无活性的酶原转变成有活性的酶时构象发生的变化。 一、与酶的高效率有关的因素 据现在所知，重要的因素有以下几个方面： 1．底物与酶的“靠近”(proximity)及“定向”(orientation) 由于化学反应速度与反应物浓度成正比，若在反应系统的某一局部区域，底物浓度增高，则反应速度也随之增高。提高酶反应速度的最主要方法是使底物分子进入酶的活性中心区域，亦即大大提高活性中心区域的底物有效浓度。曾测到过某底物在溶液中的浓度为0.001mol/L，而在其酶活性中心的浓度竟达100mol/L，比溶液中的浓度高十万倍！因此，可以想象在酶的活性中心区域反应速度必定是极高的。 “靠近“效应对提高反应速度的作用可以用一个著名的有机化学实验来说明，如表4-12，双羧酸的单苯基酯，在分子催化的过程中，自由的羧基作为催化剂起作用，而连有R的酯键则作为底物，受—COO-的催化，破裂成环而形成酸酐，催化基团—COO-愈靠近底物酯键则反应速度愈快，在最靠近的情况下速度可增加53000倍。 但是仅仅“靠近”还不够，还需要使反应的基团在反应中彼此相互严格地“定向”，见图4-19。只有既“靠近”又“定向”，反应物分子才被作用，迅速形成过渡态。
酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究 一、概述 本项目2004年获得河南省科技攻关项目的立项支持，项目编号：0424240040。 酶是生物细胞原生质合成且具有高度催化活性的蛋白质。人类早在认识酶之前就知道利用酶为生产和生活服务，例如酿造、鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史。1897年Büchner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳。二十世纪初，有更多的酶被发现和分离提纯，注意到了某些酶的作用需要有低分子物质（辅酶）的参加，并陆续认识了很多酶所催化的反应。1926年Sumner第一次从刀豆中分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶。30年代，J.Northrop 又连续分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500种酶得到结晶，2000多种酶得到鉴定，200种左右商品酶已经开发，但工业上应用的酶仅有50多种。二次世界大战后抗生素工业的通风搅拌发酵技术的利用，使微生物酶制剂工业得到迅速发展。20世纪40年代末，生产α-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。20世纪50年代后期遗传工程、蛋白质工程等现代生物技术的研究成果，促使世界酶制剂工业持续地高速发展，成为生物工程四大主导产业中最早产业化的高技术产业。由于酶制剂是一种绿色高效生物催化剂，具有高效、节能、安全和环保等特点，对酶制剂应用产业开发新产品、提高质量、节能
降耗、保护环境重要意义；因此，这一产业的发展受到各国政府的高度重视，有着广阔的发展前景。 国际酶制剂市场目前保持着9％的增长速度，2010年世界酶制剂年销售额达160亿美元，目前已有一大批可用于工业发酵生产的各种胞外酶的微生物，如芽孢杆菌、大肠杆菌、放线菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品种数量主要有糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、延胡索酸酶、青霉素酰化酶、溶菌酶、链激酶、漆酶、植酸酶、复合酶等等。应用范围覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多领域，创造工业附加值数千亿多元。我国自1965年建立起第一个专业酶制剂工厂，由于不断引进技术、资金和设备，酶制剂工业得到迅猛发展，产量由1965年的10吨增长到2010年的219万吨，平均每年以20％以上的速度增长，产值达6亿多元，应用范围愈来愈广泛。我国酶制剂工业与发达国家相比，存在的差距主要有：（1）技术研究与开发滞后，基础理论研究与技术开发研究严重脱节，科研资金力度不够且分散，科研技术转化能力不强。（2）行业规模小而分散，市场调控能力弱，我国现有100多家酶制剂生产企业，企业数量占世界三分之一还多，但销售额仅占世界酶制剂销售额5％，企业规模小、产品的市场覆盖率低，导致企业对市场的调控能力普遍较弱，企业间无序的
芽孢杆菌概况及其作用机理 引言：也许您已加入微生态制剂行业数年，对该行业的发展和现状如数家珍；也许您刚刚踏入这个行业，对此行业还感到有些不甚明了，但是，只要您选择了宝来利来公司，选择了宝来利来公司的微生态产品，您就不难发现，公司的几款拳头产品，如产酶益生素系列、肽菌素系列、固本康系列等等，都有一个共同的菌株——芽孢杆菌，有的产品含枯草芽孢杆菌、有的产品含地衣芽孢杆菌、有的产品是二者的组合。 我们再来看宝来利来公司发展的历程： 1996年宝来利来公司第一份产品枯草芽孢杆菌问世，这是中国第一家取得生产批准文号的动物微生态产品，从此开端了一个产业的萌芽。 2001年产酶益生素问世，枯草芽孢杆菌产酶菌株N9正式选育成功，并在引进消化国家948项目的基础上突破乳酸菌的真空冷冻干燥技术，从此将益生素引入营养微生态、免疫微生态新纪元。产酶益生素也被国家科技部、国家经贸委评为国家重点新产品。 2006年，宝来利来产酶益生素进一步完成了产品的升级换代，在N9的基础上选育出N9-1-35，产酶能力再次提高300%，达到国际领先水平；抗感染菌株枯草芽孢杆菌B7348和乳酸菌LP-11的选育成功，使
产酶益生素真正进入到营养微生态、免疫微生态、抗感染微生态的时代。 截至目前，公司承担6项“国家863计划”课题，拥有6项国家重点新产品。在中国整个动保行业取得如此殊荣的，目前仅宝来利来一家企业。 宝来利来公司所取得的成就，产品得到的广泛认可，除了与公司强大的研发实力外，更与公司准确定位、成功选育的菌株有直接关系。现在我们重点学习一下芽孢杆菌的相关特性。 1 芽孢杆菌的概况 芽孢杆菌属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，能形成内生孢子——芽孢的革兰氏阳性杆菌，需氧或兼性需氧，具有鞭毛。芽孢杆菌广泛分布于土壤、空气、水和动物肠道中，其稳定性强，芽孢一旦形成，便能耐受各种不利条件，如干热(150℃干热1h仍有芽孢存活)、湿热、紫外线、强酸、强碱、有机溶剂、极度干燥、真空干燥、氧化剂的氧化作用等。在一定条件下，芽孢能够长时间保存，可以保证益生菌制品的有效期。 所有菌属中芽孢杆菌是最理想的微生物添加剂。大量试验证明，芽孢杆菌添加剂具有类似于泰乐菌素的效果，可明显改善机体内菌群组成和具有促生长的功效，并且芽孢杆菌在颗粒料、粉料的加工过程中以及酸性环境中具有较高稳定性，在肠道内环境中能发挥作用而增殖，符合微生物添加剂的条件。
芽孢杆菌作用机理 地衣芽孢杆菌 种属: 芽孢杆菌科细菌 革兰氏染色性;为革兰氏阳性杆菌 细胞大小:0(8μm×(1(5,3(5)μm 细胞形态及特点:细胞形态和排列呈杆状、单生。细胞内无聚-β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒芽孢形态:产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大 培养特性:在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm 一、地衣芽孢杆菌饲料添加剂作用机制 地衣芽孢杆菌饲料添加剂有效成分为地衣芽孢杆菌活菌，属于益生素的一种。1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单，其中包括地衣芽孢杆菌。中华人民共和国农业部318号公告也把地衣芽孢杆菌列入了饲料添加剂目录。国内外对地衣芽孢杆菌在动物领域的应用进行了大量的研究。一般认为，地衣芽孢杆菌主要从以下几个方面发挥作用: 1、生物拮抗作用 拮抗动物病原细菌并维持和调整肠道微生态平衡。在正常情况下，动物肠道微生物种群及其数量处于一个动态微生态平衡状态，当机体受到某些应激因素的影响，这种平衡可能被破坏，导致体内菌群比例失调，需氧菌如大肠杆菌增加，并使蛋白质分解产生胺、氨等有害物质，动物表现下痢等病理状态，生产性能下降。研究表明，饲喂地衣芽孢杆菌能产生蛋白多肽类抗菌物质，拮抗肠道病原细菌，从而抑制病原菌的生长繁殖，使有益微生物在细菌种间的相互竞争中占优势。陈惠等(1994)在给肉鸡饲喂地衣芽孢杆菌后，肠道菌群中厌氧菌(双歧杆菌、乳酸杆菌等)
增多，而需氧菌及兼性厌氧菌特别是大肠杆菌显著减少(p< 0(05)。直接作用表现在地衣芽孢杆菌对葡萄球菌、白色念珠菌体外实验有很强的拮抗作用。因为地衣芽孢杆菌在生长代谢过程中能产生多种抗菌物质(如短杆菌肽、枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和头孢菌素C等。间接作用表现在地衣芽孢杆菌进人肠道后会持续性的对微生物起到生物耗氧效应(造成生态环境低氧状态。为肠道内的生理性厌氧菌如双歧杆菌、乳酸杆菌、消化链球菌、类杆菌等菌的生长繁殖创造有利条件(通过支持生理性厌氧菌的增殖(抑制致病菌的生长，使菌群失调得以调整，使肠道功能得以恢复。 2、生物屏障作用 地衣芽孢杆菌生长条件要求低，其兼性厌氧的生长特性使之能很快的在动物肠道繁殖，并能迅速定植在肠黏膜上，在短时间内成为肠道的优势菌群，在肠道内长时间定植下来。由于该菌能持续性的耗氧，支持和促进肠道厌氧菌的生长。使地衣芽孢杆菌和厌氧菌一起构成膜菌群。起到占位性保护作用，保护肠黏膜免受病原菌的粘附(从而发挥生物屏障作用。 3、促进有益菌生长 实验证实，由于地衣芽孢杆菌具有生物夺氧，降低氧化还原电位的功能，因而能明显促进双歧杆菌、乳酸菌、类杆菌等理性厌氧菌的生长(通过该菌与厌氧菌产生的机能酸、过氧化氢以及抗生物质，抑制致病菌的生长繁殖。 4、产生多种酶 地衣芽孢杆菌在肠道生长繁殖过程中能产生多种酶。柏建玲报道，该菌能产生淀粉酶、蛋白酶和植酸酶，笔者通过淀粉酶平板试验，也证实该菌能富产淀粉酶。如用于动物，在动物体内可形成一个小型的“酶工厂”。不但能防病治病，而且有促进消化和提高饲料利用率的作用。特别是植酸酶的产生，可使植酸磷降解为肌醇和磷酸，提高饲料中磷的利用率，降低粪便中磷的排放，降低植酸盐的抗营养作
酸性蛋白酶生产工艺 1.种子罐 1.1、投料体积 1.2、配方及制作方法 糊精5% 豆饼粉3% 酵母膏0.5% 磷酸氢二钾0.2% 羧甲基纤维素钠0.5% 玉米浆2% 消泡剂PPE0.06% 灭菌后PH4.6-4.8 1.3、培养基配制方法：先将上述原料用自来水溶解，搅拌30分钟，然后用磷酸调节PH4.6 左右。 注：羧甲基纤维素钠单独溶解当主料升温至90℃时加入。 1.4、灭菌：121℃35分钟 1.5、接种：冷却到33℃接入种子。 1.6、培养条件：温度：30℃ 通风量：0-10小时1：1 10小时-移种1：1.2 罐压：0.05-0.08Mpa 1.7、液体种子成熟标准：培养液稠密，菌丝体多，染色深，无杂菌，PMV达到40%，周 期20小时左右，移种量20%。 2、发酵罐 2.1、投料体积 2.1、配方 玉米粉5% 玉米浆2% 豆饼粉4% 酵母粉0.5% 氯化钙0.5% 磷酸氢二钾0.3% 氯化铵0.5% 消泡剂PPG0.06% 高温淀粉酶（2万） 制作方法：先将基础料中的玉米粉、豆饼粉、酵母粉、氯化钙加水溶解后，投入罐中，搅拌20分钟使其充分溶解，调节PH6.0，加入液化酶，加热至91℃液化20分钟后再加入玉米浆及各种无机盐，最后用磷酸调节PH5.2。 3、接种：冷却到30℃接入种子。 4、培养条件：温度：29-30℃ PH:初始PH5.2，当PH降至4.8时，补氨控制4.7-4.8。 通风量：0-10小时1：1 11-120小时1：1-1：1.2 罐压：0.06-0.07Mpa
搅拌转速：200-650rpm(根据溶氧可调) 5、补料罐 配料 麦芽糖浆20% KA水解液40% 玉米浆2% PPG 0.06% PH不高于4.5，若高于4.5用磷酸调回。 KA水解液的水解方法：KA：水1：6 加入石灰6%（相对KA），升温至1.2kg/cm2,保压1小时。 6、补料控制：当发酵10小时左右，PH自然回升时开始补料，控制溶氧30%。 酸性蛋白酶发酵生产控制工艺 1、一级种子罐（2m3） 1.1、投料体积1m3，实际投料体积0.8m3。 1.2、配料方法：原料加入配料罐后，搅拌溶解30分钟后测PH值（灭菌前），调节PH5.0 ±0.1。 1.3、灭菌：慢慢升温至90℃，保温15分钟，灭菌121℃35分钟。 1.4、控制工艺：温度30℃ 罐压0.05Mpa 通风量0-5小时36m3/h 6小时后72 m3/h 1.5、移种标准：培养24小时左右，取样镜检无杂菌，pmv25%，即可移种。 2、二级种子罐（10m3） 2.1、投料体积5m3，实际投料体积4.5m3。 2.2、原料加入配料罐后，搅拌溶解30分钟后测PH（灭菌前），调节PH5.3±0.1。 2.3、灭菌：慢慢升温至90℃，保温15分钟，121℃，35分钟。 2.4、控制工艺 温度：30℃ 罐压：0.05Mpa 通风量：0-5小时360m3/H 6小时后400m3/H 2.5、移种标准：培养时间6小时左右，pmv35%,取样镜检无杂菌，即可移种。 3、发酵罐（60m3） 3.1、投料体积28m3，实际投料体积26m3，将原料投入配料罐中搅拌20分钟。 3.2、调节PH5.0（片碱） 3.3、灭菌：121℃，35分钟。 3.4、控制工艺 温度：31℃ 罐压：0.05Mpa 通风量：0-5小时1:0.8 1400m3/H 6-180小时1:1-1.5 1700-3500m3/H 根据溶氧调整。
酶 一、酶的作用机理： 1、降低反应活化能：在任何化学反应中，反应物分子必须超过一定的能阈，成为活化的状态，才能发生变化，形成产物。这种提高低能分子达到活化状态的能量，称为活化能。催化剂的作用，主要是降低反应所需的活化能，以致相同的能量能使更多的分子活化，从而加速反应的进行。酶能显著地降低活化能，故能表现为高度的催化效率。例如H2O2酶将H2O2转变为H2O 和O2，酶能降低反应活化能，使反应速度增高千百万倍以上。 2、复合物学说：酶催化某一反应时，首先在酶的活性中心与底物结合生成酶－底物复合物，此复合物再进行分解而释放出酶，同时生成一种或数种产物，此过程可用下式表示：E+S →ES→E+P，ES的形成改变了原来反应的途径，可使底物的活化能大大降低，从而使反应加速。 3、高效率的机理： （1）趋近效应和定向效应：酶可以将它的底物结合在它的活性部位，由于化学反应速度与反应物浓度成正比，若在反应系统的某一局部区域，底物浓度增高，则反应速度也随之提高，此外，酶与底物间的靠近具有一定的取向，这样反应物分子才被作用，大大增加了ES复合物进入活化状态的机率。 （2）张力作用：底物的结合可诱导酶分子构象发生变化，比底物大得多的酶分子的三、四级结构的变化，也可对底物产生张力作用，使底物扭曲，促进ES进入活性状态。 （3）酸碱催化作用：酶的活性中心具有某些氨基酸残基的R基团，这些基团往往是良好的质子供体或受体，在水溶液中这些广义的酸性基团或广义的碱性基团对许多化学反应是有力的催化剂。 （4）共价催化作用：某些酶能与底物形成极不稳定的、共价结合的ES复合物，这些复合物比无酶存在时更容易进行化学反应。
有关酶催化的原理简介 酶的化学本质是蛋白质。具有酶活性的蛋白质分为简单蛋白质类和结合蛋白质类。简单蛋白质类的酶是由氨基酸组成的，不含任何其他物质，如胃蛋白酶。结合蛋白质类的酶是由简单蛋白质与辅基组成的，如乳酸脱氢酶、转氨酶。组成酶的简单蛋白质部分叫做酶蛋白或主酶，辅基部分叫做辅酶。一般是主酶与辅酶相结合，成为全酶，才能起到酶的作用。 降低反应活化能在任何化学反应中，反应物分子必须超过一定的能阈，成为活化的状态，才能发生变化，形成产物。这种提高低能分子达到活化状态的能量，称为活化能。催化剂的作用，主要是降低反应所需的活化能，以致相同的能量能使更多的分子活化，从而加速反应的进行。酶能显著地降低活化能，故能表现为高度的催化效率。通过过氧化氢酶的例子，可以显著地看出，酶能降低反应活化能，使反应速度增高千百万倍以上。 酶的催化作用机理现在普遍被接受的是Koshland DE提出的诱导契合学说（解释酶的专一性）和共价催化与酸碱催化（解释酶的高效率）。诱导契合认为，酶和底物结合咋接触以前并不是完全契合的，只有在底物被与酶的结合中心结合后，酶分子构象产生了微妙的变化（多加了个基团进去分子力不平衡，构象肯定是要变的），从而使催化中心的位置改变到底物附近并刚好有效作用于底物，从而底物得到催化。有些酶通过共价催化来加速催化速率，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或吸收电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间配合物，这个中间物很容易变成转变态，因此反应活化能大大降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。而酸碱催化是通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态、加速反应的一种催化机制。 下面通过简述一篇关于生物酶催化合成生物柴油的文献来说明酶催化的过程和催化的特点。 这篇文献研究的背景是石化柴油的应用中所出现的一系列问题，针对这些问题采用动物或植物油脂与甲醇或乙醇进行反应合成脂肪酸单酯代替柴油，这种改性后的油脂（脂肪酸低碳醇酯）有着与柴油十分相似的理化性质，而且燃烧完全，无污染排放，称之为“生物柴油”。从生物柴油的制备原料来看，有着传统石化柴油不可比拟的优点，即原料可再生、产品本身环境友好、而且不用更换和经常清洗发动机等优点。目前生物柴油主要是用化学法生产，即动植物油脂与甲醇在高强度酸或碱催化剂下制备。化学法存在工艺复杂，醇消耗量大，产物不易回收，环境污染大等缺点。用脂肪酶代替酸碱催化剂催化合成生物柴油的报道已有很多，酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无污染物排放等优点，
第10章、酶的作用机制和酶的调节（P384） 本章重点：1、酶的活性中心，2、影响酶活性的条件和因素，3、酶和底物之间的相互作用和关系，4、酶催化反应机制，5酶概念的发展-核酶本章的主要研究内容： （一）酶的活性部位 （1）酶活性部位：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，活性部位又称活性中心。 酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心，分为： ①结合部位：负责与底物结合，决定酶的专一性。 ②催化部位：负责催化底物键的断裂或形成，决定酶的催化能力。 对需要辅酶的酶，辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位组成部分。 （2）酶活性部位特点： 1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分，通常1~2%。P384 表10-1列举一些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共129个氨基酸残基，活性部位为Asp52和Glu35；胰凝乳蛋白酶241个残基，活性部位为His57，Asp102，Ser 。 195 2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至不在一条肽链上，但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。 3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中，相互构象发生一定变化后才互补。如P385 图10-1。 4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境，也含有某些极性氨基酸残基有利于催化，底物在此裂缝内有效浓度很高。 5. 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。 6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。 （二）研究酶活性部位的方法 （1）酶侧链基团化学修饰法： 1.特异性共价修饰：如二异丙基磷酰氟（DFP）专一地与酶活性部位Ser-OH的羟基共价结合，使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共28个Ser，但DFP 只与活性中心的Ser反应，见P386。反应后，用HCl将酶部分水解，得含二异丙基磷酸酯（DIP）基团的肽的片断，序列分析定出DIP-Ser为Ser195。 2.亲和标记：用与底物结构相似的修饰剂，对酶活性部位进行专一性共价修饰。 如TPCK（结构式见P387），结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯（TPE）类似，TPCK只与胰凝乳蛋白酶中His57结合，说明His57为该酶活性部位的一个氨基酸残基。 （2）X-射线晶体结构分析： 可提供酶分子三维结构，了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状态，与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况，被作用键周围残