2008-6 Volume 8
疏水层析填料
疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为
在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下
图：
填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl对疏水性
蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）
色谱柱：8.2 x 150 mm
柱体积：8 ml
流动相：2.0 - 0.0M
Ammon ium Sulfate
in 0.01M phosphate, pH 7.0
流速：1.32 ml/min
Asahipak NH2P 色谱柱是Shodex 公司生产的用于分析糖类物质的正相柱
色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在
pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基
材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱 Asahipak NH2P ，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种 应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外， Asahipak NH2P 可用于定量分析；还可 以用碱性溶剂冲洗
聚合物基材氨基柱与硅胶基材 氨
基柱的柱寿命比较 左图为
Asahipak NH2P
色谱柱与硅胶基材氨基柱的寿 命对比试验。结果显示：随着 使用时间的延长，硅胶基材氨 基柱对单糖、二糖的保留快速 下降，其原因应是硅胶基材氨 基柱的氨基降解所致。
色谱柱：Asahipak NH2P-50
4E,
其它公司的氨基柱
2008-6 Volume 8
样品：5 mg/3 ml 100 卩 l
Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）
Asahipak NH2P
(4.6mmlD*250mm)
Asahipak NH2P 色谱柱可在正相模式下分离糖类物质， 糖类物质按照分子量由小到大的顺序依次被洗
脱。增加洗脱液 中有机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。
Asahipak
NH2P 色谱柱可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇 混合物。
右图为Asahipak NH2P 色谱柱分离单糖、二糖及三 糖混合物的应用实例。
单糖、二糖及三糖混合物的分离
1
色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmlD*250mm) 流动相：H2O/CH3CN=25/75 流速：1.0mL/min 检测器：Shodex RI 柱温：30度
2008-6 Volume 8
学习园地
导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案
第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是
HPLC 系统导致的压力上升。
由于HPLC 系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力 上升，所以，应先对HPLC 系统进性排查。
CH3CN/H2O=75/25
流速：1.0mL/min 检测器：Shodex RI 柱温：30度
b Fructose
D
C- Glucose Sucrose e Maltese f. Raffitw? e
10
20
30 mir
排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系统压力。如果此时HPLC 系
统压力正常，则考虑是柱压升高。
第二阶段：确定是否使用了保护柱（预柱）。
一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。如果使用了保护柱，那么压力的升高就有可能是保护柱的柱压升高导致的。
排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱仅以色谱柱连接管路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起的柱压升高，请清洗、或更换保护柱。
第三阶段：如果不是上述第一、第二点原因造成压力升高，就可以确认是色谱柱的原因了。
如果柱压是随着使用时间的延长，慢慢上升，这属于正常现象，是色谱柱达到使用寿命了，只能更换色谱柱了。
如果柱压是在实验开始时，实施中或经过一次、几次实验后，突然上升，则要结合实验情况考
常规的色谱柱清洗方法（正向冲洗）
使用比目前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱。如果您使用的流动相是乙腈：水
疏水层析经验 1、疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。在高盐离子强度的情况下，蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用，从而结合在柱子上。不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。随后，逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来，形成一个个的蛋白质洗脱峰。 2、柱子的装填：如果是预装柱，就不存在装柱的问题了。不是，则从头开始：首先，把柱子洗干净，一定要洗干净，不然会出现气泡。填料预先融涨（注意，进口一般已经是融涨好的，不必再做这一步），取一定的填料（例如：想装5.0ml的柱子，一般将瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的话）取10.0ml出来）先脱一下气（请人帮忙，不然控制不好会暴沸出来！），然后缓缓装入柱子（柱子上下口一定不要搞错！！！），打开下口让水流出，最好一次性装完，等待其自然沉降，柱子就装好了。（实际上，因为疏水层析的原理与分子筛不同，所以其装柱远远没有分子筛的柱子那么严格，很容易的！放心好了！看着顺眼就应该差不多吧） 3、注意：柱子装好之后，任何时间都不能让缓冲液流到柱面以下而干柱，切记！ 4、缓冲液的选择：a、pH值：要在蛋白质的pI值附近，因为这时蛋白质的疏水力会最强，但是也不要把缓冲液的pH正好调到pI，因为蛋白那时会发生等电点沉淀！（大家都知道，呵呵…）。所以，如果你的蛋白等电点是8.5的话，配一个8.0或9.0的缓冲液应该都可以！b、缓冲介质：常用的是PBS或者Tris-HCl缓冲液，都可以，看个人习惯了，或者，你以后的实验要用Tris-HCl，那么这里也用Tris-HCl就是了。蛋白质技术手册上用的是PBS，自己选择吧。c、缓冲液的浓度：依照蛋白质技术手册上的浓度即可：20mM。 5、样品的处理：疏水层析是在高盐离子强度的情况下上样的。而且，样品在上样之前一定要注意没有沉淀，有的话应该离心除去。样品的盐离子强度的调整：可以直接将固体的磨的很细的盐颗粒加在样品里，使之达到预定的浓度（是硫酸铵的话，就查手册后面的表格，计算应该加多少盐），或者将样品与100%的硫酸铵等体积混合，不就变成50%的了（这样的好处是缓冲液的浓度不会因为加入硫酸铵体积变大而降低，从而影响了样品的pH值）？还有更加重要的是：请仔细选择上样的离子强度，要知道，蛋白质在高盐的情况下是要发生沉淀的（硫酸铵沉淀纯化蛋白的原理）！如果你的蛋白的硫酸铵沉淀范围是50-80%，那么你大可放心地用50%硫酸铵来上样！如果你的蛋白的硫酸铵沉淀范围是30-50%，那么你就只能用30%来上样了，千万记住！！！还有就是，调整盐离子强度的时候要在低温下操作，如果有沉淀产生，轻轻地混匀一会儿，该溶解的就会溶解，离一下心，就可以上样了。 6、不知道你的蛋白的稳定性如何？必要的时候，请加入蛋白酶抑制剂。 7、柱子的预平衡：10倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵（这个浓度要你选择，50%还是30%？）），使其平衡。 8、上样：当平衡层析缓冲液流至恰好与床面相切时，关闭出液口（有泵的话，把它一关就OK!），然后上样。注意：尽量小心，保持床面的平整性！打开出口，让样品缓缓进入柱床，再次相切时，加入少量（很少就可以，稍稍盖过床面就行！）层析缓冲液（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗一下。 9、洗柱：注意，这一步不是洗脱，而是把一些吸附不在柱子上的杂蛋白尽量洗下来！步骤：3倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗柱或者观察检测仪的信号回到基线，那就证明吸不住的杂蛋白完全洗下来了。 10、目的蛋白的洗脱：有梯度混合仪的话，可以梯度洗脱（比如50%-0%洗脱），没有的话，就像手册上那样，配置一系列浓度的洗脱缓冲液，各两倍体积来洗。控制好流速，0.5ml/min左右吧，再问问人家一般用多大的流速？两种洗脱方式各有利弊，梯度洗脱分辨率高一些，操作较简单，不用频繁更换缓冲液，但是不太适合批量蛋白的过柱。分布洗脱比较烦，要不停更换缓冲液（换液之前，别忘了关泵，否则柱子要被吸干！！！），但是批量操作性好，重复性好，样品可以不
2008-6 Volume 8 疏水层析填料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱：8.2 x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：2.0 – 0.0M Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 7.0 流速：1.32 ml/min 样品：5 mg/3 ml– 100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨 基柱的柱寿命比较 左图为Asahipak NH2P色谱 柱与硅胶基材氨基柱的寿命对 比试验。结果显示：随着使用时 间的延长，硅胶基材氨基柱对单 糖、二糖的保留快速下降，其原 因应是硅胶基材氨基柱的氨基 降解所致。 色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E,
多数微生物碱性蛋白酶不耐热，碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用 碱性蛋白酶是加酶洗涤剂的主要添加剂之一，在丝绸、制革工业中也有广泛用途 热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下（30℃，40℃，50℃，60℃，70℃）保温10min 后，立即在0℃冰浴中冷却，然后在40℃下测碱性蛋白酶活力，以剩余的酶活性作为评价酶的热稳定性的指标。测量三个重复求平均值，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下蛋白酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。 以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以 缓冲液的PH＝pI值＋1，上阴离子柱，＝pI值－1，上阳离子柱，一般缓冲液ph范围在6.5～8.5之间，与PI值相差1个PH是比较理想的。 如果不清楚PI值，可以将蛋白溶到PH梯度的缓冲液里，然后分别试阳离子和阴离子填料（50ul左右得体积就够了），看那个PH下挂得好。 强离子交换剂: 在宽pH范围内载量稳定，所以他的优点是不同pH下载量恒定，可控性好，平衡过程快速、简单。 弱离子交换介质的缺点：适用的pH范围比较小，随着pH不同载量发生变化。但是大部分蛋白等电点在5.5 ~ 7.5 。因此强/弱离子交换介质都可以使用 弱离子交换介质（DEAE、ANX、CM)优点在于：和强离子交换介质的选择性不同，因此我们一般先使用强离子交换，如果优化条件还是达不到理想的分离效果，可以尝试弱离子交换，用选择性不同的介质尝试一下。 因此弱离子交换与强离子交换由于选择性不同，可以说是对不同蛋白的结合力有差异。S 技术规格 离子交换剂类型 Q Sepharose FF 季氨基，强阴离子 DEAE Sepharose FF 二乙基氨基乙基，弱阴离子 ANX Sepharose 4FF 二乙基氨基丙基，弱阴离子 SP Sepharose FF 磺丙基，强阳离子 CM Sepharose FF 羟甲基，弱阳离子 离子容量 Q Sepharose FF 0.18-0.25mmol（Cl-）/ml DEAE Sepharose FF 0.11-0.16mmol（Cl-）/ml ANX Sepharose 4 FF 0.13-0.18mmol（Cl-）/ml SP Sepharose FF 0.18-0.25mmol（H+）/ml CM Sepharose FF 0.09-0.13mmol（H+）/ml 动态载量 Q Sepharose FF 120mg HSA/ml 填料 DEAE Sepharose FF 110mg HSA/ml 填料 ANX Sepharose 4 FF 5mg 甲状腺球蛋白/ml 填料 SP Sepharose FF 70mg RNAase/ml 填料 CM Sepharose FF 50mg RNAase/ml 填料
疏水作用层析 实验概要 通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。 实验原理 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。 主要试剂 1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.0 3. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4
4. 蛋白质样品溶于溶液B 主要设备 层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计 实验步骤 1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。 2. 装柱：将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。加入溶液B，打开下口让溶液流出，排出残留气泡，柱中保留高度约2厘米的溶液。将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。等到层析介质在柱中沉积高度超过1厘米时，打开下口。柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完，避免出现界面。 3. 柱平衡：用溶液B平衡1-2个床体积。注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。 4. 上样：取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱下口流出组分，调节流速为1ml/min,每管3ml。 5. 洗涤：用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。收集层析柱下口流出成分。 6. 洗脱与收集：梯度混合器左面装入250ml溶液A，右面装入250ml溶液B。按照 100%-0%1.7M (NH4)2SO4梯度洗脱500ml，收集洗脱液。 7. 检测：取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。 8. 疏水层析介质清洗与保存：层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后用水洗至中性。处理好的层析介质放在20%乙醇中，4℃保存。 9. 以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱曲线。分析实验结果并讨论。
第二部分 药学生化实验 实验一. 疏水作用层析 【实验目的】 通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。 【实验原理】 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 结构示意图如下。 O CH 2CH CH 2O OH 【实验材料】 1．实验器材 层析柱（1.6X20cm ）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计 2．实验试剂 （1）疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow （2）溶液A ：0.1M Na 2HPO 4, pH7.0 + W P ：固相支持物 L ：疏水性配体 S ：蛋白质或多肽等生物大分子 H ：疏水补丁 W ：溶液中水分子 P
第四章疏水层析 疏水层析：亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类。 疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离生命物质的依据是一致的，即: 视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，将有效成分分离出来。 反相层析： 与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类物质具有较大的吸附力； 欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相(降低极性)洗脱，方可见效。 洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变性， 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质。 疏水层析(所用基质的性能与反相层析不同)： 与基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物容易被解析下来。 故，较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的物质。 这不仅使有效成分的纯度得到提高，而且还保持了其原来的结构和生物活性。 第一节基本原理 一、疏水作用 就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。 一般球形蛋白和膜蛋白的结构均较稳定，在很大程度上是取决于分子中的疏水性作用。 亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理 一是:靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)； 二是:令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基； 三是:高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用(这与普通吸附层析和离子交换层析的操作是绝然不同的)。 一般在lmol／L (NH4)2SO4 或2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起， 然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。 也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。 当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。 （相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来疏水作用强的物质随后被洗下来）对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。 二、吸附剂 固定相: 由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。 配体对疏水性物质具有一定的吸附力。 基质则有亲水性和非亲水性之分。 亲水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成的固定相，称亲水性吸附剂。 疏水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成的固定相，称疏水性吸附剂。 1．亲水性吸附剂 基质主要是：交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) 配体是：苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的 苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂
疏水色谱的原理和应用 疏水色谱是利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的。流动相一般为pH6-8的盐水溶液，具有对蛋白质的回收率高，蛋白质变性可能性小等优势。由于流动相中不使用有机溶剂，也有利于蛋白质保持固有的活性。 疏水作用色谱是在高离子强度的条件下，蛋白质溶解度降低，易吸附在中等疏水性的填料表面。随着离子强度的降低，蛋白质的溶解度增加，逐步从柱子上洗脱下来。该法具有高分辨率及保持蛋白质生物活性的特点。 疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离。 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。 1
疏水层析影响因素解析 1. 疏水层析填料的选择 *不同的配基的疏水填料与蛋白的结合能力强弱不同，在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。 Butyl-S（苯基） （从左往右疏水性增强） *同一配基的疏水填料由于配基密度不同，其和蛋白的的疏水作用力也不同，筛选填料时也要对不同的配机密度的疏水填料进行对比筛选。 2. 样品的性质 蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布，同时与样品缓冲液的离子强度，离 子种类，pH,所处的温度都有一定的关系，在进行疏水层析时要保持恒定的温度，且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度，pH进行筛选对比分析。 3. 层析柱反压升高或柱效下降 （1）确保压力的升高是由层析柱引起的 检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力 升高。 （2）层析柱使用过程杂质的积累 对填料进行清洗：先用0.5M的氢氧化钠洗1CV,然后用去离子水把碱洗掉（5CV),之后在用30%的异丙醇洗1CV，异丙醇洗完后用去离子水洗5CV，上样1CV 1mg/ml胃蛋 白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5CV 0.2M NaOH清洗，再用4CV去离子水清洗。 （3）柱床太高 疏水层析装填高度建议在10-20cm，大于20cm反压增大。 （4）流速过快 使用适当的流速。
（5）层析填料被污染或老化 随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。 4. 层析柱进气泡 大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。 5. 洗脱时没有收到目标物质或者洗脱量太少 (1) 目标物没有与介质结合或结合量较少 先确认目标物质是否和填料结合 (2) 洗脱时间不够 降低流速，延长洗脱液的保留时间 (3) 目标物质和填料结合强度太高 降低平衡液中盐浓度或更换盐的种类或或更换结合能力较弱的疏水介质在洗脱液中加入添加剂（少量去污剂或者低浓度有机试剂） (4) 层析缓冲液及温度 确保疏水层析时的温度适宜，且选择合适的缓冲液。 6. 疏水层析时目标物不与填料结合或结合量较低 *确保合适的保留时间（上样速度）。 *目标物质和填料疏水作用力太弱，更换疏水性强的填料。 *缓冲液的离子强度太低，提高缓冲液的离子强度。
2008-6V o l u m e8 疏水层析填料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图： 填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl 对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱： x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：– 0.0M
Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 流速： ml/min 样品：5 mg/3 ml–100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基 柱与硅胶 基材氨基 柱的柱寿 命比较 左图为 Asahipak NH2P 色谱柱与硅胶