《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理
1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择
选择实验动物应注意以下几点：
1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
三、小白鼠腹腔接种
[目的要求]
l．掌握小白鼠腹腔接种的实验方法。
2．了解动物接种在微生物分离和鉴定中的作用。
3．了解其他的动物接种方法，如动物皮下、皮内、肌肉、家兔耳静脉注射等接种方法。
4．了解实验动物的处死和尸检的方法。
[原理]
在临床微生物实验室中，动物接种主要用于分离和鉴定病原微生物。通过在易感和不易感动物体内传代，微生物的各种性质都可能发生变化。常用的实验动物包括大鼠、小鼠、豚鼠、家兔及绵羊等。常见的接种部位包括皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔及脑内等部位。本实验主要进行小鼠的腹腔内接种。
[器材和动物]
1．菌液肺炎链球菌培养液。
2．器具鼠笼、无菌注射器、棉球煮针锅、剪刀、解剖台、大头针、纸张。
3．试剂碘酒、酒精、3％来苏儿、凡士林。
4．动物小白鼠。
[步骤和方法]
１.接种方法：
（１）用无菌注射器以无菌操作方式吸取肺炎链球菌培养液，吸取量稍多于使用量，排除气泡(将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻推出，须避免菌液四溅，特别注意防止眼结膜感染)。
（２）用右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙物面上，再用左手拇指和示指抓紧小白鼠两耳及颈项皮肤，鼠体被固定在左手手指与掌间，用左手无名指和小指夹住鼠尾，用碘酒消毒腹壁皮肤。
（３）左手倾斜，使小鼠头部稍向下，将预先准备好的菌液注入腹腔内，注射时右手持已吸
有菌液的注射器，针尖自小白鼠左侧腹股沟处刺穿皮肤，使针尖(针头宜小，常用5号针头)在皮下组织内向前移动1cm左右，然后再轻轻向下刺进腹腔。抽吸注射器，如无回血或尿液，表示针头未刺人肝、膀胱等脏器，即可进行注射，注入菌液0.2ml后将针头退出，用酒精棉球轻擦针刺处消毒。
（４）将接种小鼠用的肺炎链球菌菌液作一张细菌涂片，以备与以后的实验结果比较。
（５）将注射后的小白鼠做好标记(以染液涂于鼠的头部或背部)，置于鼠笼中，填写实验动物记录卡或标签，包括实验动物的名称、编号、注射材料及部位、剂量和注射日期等，然后将卡片挂在动物容器上。
２.结果观察方法：
（１）感染动物须隔离喂养，并逐日观察，注意有无发病症状，如食欲不振、竖毛、不活泼等现象，加以记录，必要时定期测量体重及体温。若有致死可能，务必在动物濒死前及时杀死并作解剖，进行病原学和病理学检查。
（２）小白鼠在濒死前或死亡后立即进行解剖，若尚未死亡可用人工处死，如拉其头及尾部，使其颈椎脱臼，即刻死亡。
（３）将小白鼠胸腹部朝上，四肢用大头针固定于铺有纸张的解剖板上，用碘酒消毒整个胸腹部及四肢，左手用镊子提起耻骨部皮肤，右手持剪刀在其上剪开，然后由小口中将剪刀头部伸入，将皮肤分离，并沿正中线自耻骨到下腭处将皮肤剪开，四肢处皮肤亦用剪刀分离后剪开(注意不能将肌肉层剪破)，将皮肤向两侧剥离，露出整个胸腹部，观察皮下组织及淋巴结有无水肿、出血和肿大等病变。
(4)另换无菌镊剪，左手持镊子先将腹壁提起，依照剪开皮肤的方法，右手持剪将腹壁自耻骨到横膈，横膈向两侧，耻骨至两腿处剪开(注意勿剪破肠)。然后将腹壁翻向两侧观察腹腔。如有渗出液则用接种环取渗出液接种于适当的培养基，并作涂片和染色镜检。同时亦可剪取脾或肝脏，取切面作压迹涂片，如欲做组织切片检查时，可将脏器剪下浸入10％甲醛液内固定。
(5)再换一套无菌镊剪，将两侧肋骨沿锁骨中线切开，用镊子夹住胸骨下缘，将横膈肋骨缘剪断，将剪断的胸骨向上翻起暴露出胸腔，观察心肺有无病变及胸腔有无渗出液。用无菌镊子将心脏固定，剪开心包膜，烧灼心室表面，以无菌注射器插入心脏内取心血数滴，置血平板上进行划线分离培养(或把心脏剪成两半，将切面在平板面压印后，再行划线分离)。将血平板放入37 ℃培养箱培养24h，亦可将心脏剪开做压迹涂片。
(6)将腹腔渗出液或脏器压迹涂片用革兰染色和荚膜染色法染色镜检。
(7)7)动物尸体解剖完毕后，用垫在尸体下面的纸张将尸体包裹，集中后放焚烧炉中焚化。所用的剪刀、镊子、注射器等均应煮沸消毒，实验台用3％来苏儿消毒擦洗干净。
[结果]
１．腹腔渗出液或脏器压迹涂片经革兰染色镜检，可见有荚膜的革兰阳性双球菌，形态和染色特征符合肺炎链球菌。
２．血平板分离培养的结果，在划线区出现细小、灰白色、α-溶血的纯菌落，经鉴定符合肺炎链球菌。
四、鸡胚接种
[目的要求]
掌握能用鸡胚分离培养的病毒种类及四种常用的鸡胚接种途径。
[器材和试剂] ．
1．毒种流行性感冒病毒悬液、乙型脑炎病毒悬液及2型单纯疱疹病毒悬液。
2．来享鸡受精卵。
3．1ml注射器及6号、12号针头，无菌生理盐水。
4．其他卵架、检卵灯、碘酒、酒精棉球，无菌手术刀、镊子、剪刀，平皿、砂轮、透明胶带等。
[步骤和方法]
1．鸡胚的准备：选择表面光泽干净，最好是白色蛋皮的受精卵，放入38～39℃孵卵器内孵育，相对湿度40％～70％。孵育3天后，需每日翻动鸡胚1次。第4天起，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵只见模糊的卵黄黑影，应予淘汰；受精卵可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，随着转动鸡胚可见胚影活动。随后每天观察一次，若出现胚动吊滞或胚影固定于卵壳，或血管昏暗模糊者，说明鸡胚将要死亡或已死亡，需随时淘汰。生长良好的鸡胚一直孵育到适当的胚龄。
2．接种方法：
（1）尿囊腔接种法：
1)取9～11日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室界限，于胚胎面与气室交界的边缘上约1mm处或在胚胎的对侧处，避开血管作一标记，作为注射点。
2)用碘酒、酒精消毒后，用无菌刀尖在记号处打一小孔。
3)用无菌注射器吸取流行性感冒病毒悬液，从小孔处刺入5mm，注入病毒液0.1-0.2ml(图4-1)
图4-1 尿囊腔接种法
4)用透明胶带封闭注射孔，蜡笔
标记号码及日期等，放卵架上置33～35℃孵箱孵育，每日检视鸡胚的死活，如果鸡胚在接种后24h内死亡者为非特异性死亡，弃之。
5)孵育48～72h取出，放4℃冰箱过夜。
6)次日取出鸡胚，消毒气室部位卵壳，用无菌剪刀沿气室线上缘剪去卵壳，用无菌镊子撕去卵膜。
7)用无菌毛细吸管吸取尿囊液，收集于无菌试管内。用血凝试验检测有无病毒。
（2）卵黄囊接种法：
1)取6～8日龄鸡胚，于检卵灯下画出气室及胚胎位置，垂直放于蛋架上，气室端向上。
2)碘酒、酒精消毒卵顶部气室中央，用无菌刀尖锥一小孔。
3)用装有12号长针头的lml注射器吸取乙型脑炎病毒液，自小孔刺入，对准胚胎对侧，垂直接种于卵黄囊内，深度为35mm左右，注入病毒液0.2～0.5ml退出注射器(图4-2)。
4)透明胶带封口，置37℃孵育，每天检卵羊膜并翻动2次。
5)取孵育24h以上濒死的鸡胚，无菌技术于气室端开窗，用镊子提起卵黄囊蒂，挤出卵黄囊液，用无菌生理盐水洗去卵黄囊上的卵黄囊液后，将囊置于无菌平皿内，低温保存、备用。
（3）绒毛尿囊膜接种法：
1）取12日龄鸡胚，于检卵灯下标记胚胎位置及大血管处。
2）碘酒，酒精消毒附近无大血管走行的卵壳处，用小锯片在其上锯一三角形窗，同时用无菌刀尖在气室顶部锥一小孔。
3）用针头挑去三角形窗之卵壳，勿伤及卵壳膜，滴加灭菌生理盐税1滴于壳膜上。
4）用橡皮吸帽从气室小孔吸气，可见盐水被吸下，绒毛尿囊膜下沉，去壳膜后可见壳膜与
尿囊膜之间形成人工气室。
5）用注射器吸取0.2～0.5ml 2型单纯疱疹病毒液滴于绒毛尿囊膜上，用透明胶带口(图4-3)。置孵箱37℃孵育4～5天后收获。
6) 剪开气室,若接种效果成功，可在绒毛尿囊膜上见到明显疹斑，用无菌剪刀剪下膜，置于无菌平皿内，低温保存、备用。
图4-2 卵黄囊接种法图4-3 绒毛尿囊膜接种法
（4）羊水囊接种法：
1) 取12日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室及胚胎位置。
2）碘酒、酒精消毒气室部卵壳，在气室顶开方形窗，选择无大血管处，用无菌镊子快速刺
破绒毛尿囊膜进入尿囊后，再夹起羊膜，轻轻将其从绒毛尿囊膜破裂处拉出，以lml射器刺破羊膜，注入病毒液0.1～0.2ml（图4-4）。
3) 用镊子将羊膜轻轻送回原位，用透明胶带封闭气室端开窗，置孵箱37℃孵育3～5天。
4) 收获时，先消毒气室部，剪去壳膜及绒毛尿囊膜，吸弃尿囊液，夹起羊膜，用细头毛细吸管刺入羊膜腔内吸取羊水，收集于无菌小瓶内冷藏、备用。
图4-4 羊水囊接种法
五、病毒细胞培养法（录像）
细胞培养是目前最常用的病毒培养方法。选择适当的原代培养细胞及传代细胞系作病毒分离培养。
细胞培养接种病毒的方法及病变观察（示教）：
[材料]
单层细胞培养瓶、营养液、Hanks液、无菌毛细滴管、病毒稀释液。
[方法]
1．取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，用Hanks溶液洗三次。
2．用无菌1ml吸管吸取稀释病毒液0.1ml加入一只单层细胞培养瓶中，另一只单层细胞培养瓶加0.1ml营养液作为对照，细胞瓶平放，使其接触整个细胞层，置37℃作用1小时，使病毒吸附到细胞上。
3．取出单层细胞培养瓶，每只加入营养液0.9ml，盖紧后置37℃培养箱中培养1~2天。
4．取出细胞培养瓶，在低倍镜下观察，注意接种病毒与对照两瓶的的细胞形态、排列等。
六、动物采血
[目的要求]
1．掌握动物采血的几种方法。
2．掌握全血、血浆、血清的分离制备和储藏的方法。
[器材和动物]
1．动物家兔
2．器具无菌注射器、棉球。
3．试剂二甲苯、碘酒、酒精、3%来苏儿、凡士林。
[步骤和方法]
1．耳静脉采血法将家兔固定，暴露耳缘静脉，剪毛后擦少许二甲苯，待静脉怒张后，以碘酒精棉球消毒，用2ml无菌注射器在近耳根处作静脉穿刺抽血。若抽不出，亦可用无菌针头挑破静脉，用小试管收集逐滴流出的血液，最后以干棉球压迫止血。耳静脉采血法收集的血液一般用于测试抗体效价高低。
2．心脏采血法
（1）家兔仰卧固定或请助手左手握住双耳及前肢，右手握住后肢，将心脏部位稍微突起，然后在前胸的心脏部位剪毛，以碘酒和酒精消毒。
（2）抽血者左手食指按摸心脏搏动最强的部位(约在左侧近胸骨的第三肋间处)，将针头自下向右上方刺人，针头进入一半长度时即已刺人心脏。此时针筒内有回血，握针筒的右手也可感觉到针头随心脏的搏动而搏动。轻轻抽动注射器针筒芯，血液即涌出，短时间即可抽20～30ml。若用力抽吸血液仍不多，说明针头不是正好在心脏内，此时应将针头适当向前或向后调整。
（3）将血液立即注入无菌平皿，室温凝固后置37℃0.5h，然后转4℃3～4h，分离血清，加入等量甘油或1／10000叠氮钠，储存低温冰箱备用。
3．颈动脉放血法
（1）将家兔仰卧固定于解剖板上，剪去颈部之毛，用碘酒和酒精消毒皮肤，沿颈部正中线自下颏至锁骨上切开皮肤，剥离皮下组织，暴露胸锁乳突肌，注意尽量勿损伤血管，若伤及较大血管可用线结扎，小血管用血管钳夹一下即能止血。
（2）用血管钳或无钩镊子在气管与肌肉之间仔细分离出静脉与迷走神经，暴露出搏动的颈动脉，然后仔细剥离颈动脉外面的结缔组织，及时结扎隐藏在结缔组织中的小血管，使颈动脉暴露3～5cm。
（3）用线结扎颈动脉的远端，其近心脏端用动脉钳夹住。然后以左手食指垫在动脉下面，小心用小剪刀在颈动脉中部斜剪一小口，仔细地用塑料管插入动脉中，用线将导管固定在动脉上。
（4）用左手食、拇指固定插入导管的动脉，以防因兔跳动而使导管滑出动脉；也可保证导管在动脉中央，不被管壁堵住，导管的另一端接橡皮管，后者通入无菌三角烧瓶或平皿中。放开动脉钳，血液即顺导管和橡皮管流入三角烧瓶或平皿中，待放血至动物即将死亡时，松开两后肢，有意识地让其跳动，或人为地弯曲后肢、腹部，这样能再收集到10～20ml血液，总量可达l00ml左右。
（5）血清分离、防腐及储存如前所述。
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验 实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。 一、实验动物的管理 1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。 2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。 3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。 4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。 5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。盛装动物的笼具等，也应付以标签。 6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。 7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。任何用过的动物，不宜再做其他试验。 二、实验动物的选择 选择实验动物应注意以下几点： 1．易感性：是选择实验动物的首要条件。 2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。 3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
第十二章病毒的培养 一、实验动物 二、鸡胚 三、组织培养 (一)组织（块）培养 (二)器官培养 (三)细胞培养 (四)组织和细胞的培养方法 (五)细胞克隆技术 (六)细胞的保存 四、病毒的组织培养 五、病毒蚀斑技术 病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。 一、实验动物 实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。 GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。
GN是确知所带微生物的动物。只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。 SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。限于条件,某些实验室当前仍常应用普通实验动物,但也必须健康,并使用纯系品种。一次实验使用的动物,在年龄、体重和营养状态等方面要尽量一致。 国外实验动物科学发展迅速,我国已在部分大城市建立实验动物中心,专供应各种经过人工遗传控制和微生物控制而育成的纯系高品位实验动物。为了满足生物学、医学和兽医学研究的需要,国外按遗传控制标准已育成各类实验动物2600余种,其中小鼠就有1700余个品系,而且已经规范化、标准化,从而保证了研究工作的科学性和严密性。 虽然病毒学实验中应用实验动物的比重正在逐步降低,但是乳鼠至今仍是分离某些虫媒披膜病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒的主要工具。兽医学上除常应用家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠和鸡胚等进行病毒分离、驯化以及疫苗生产以外,还常直接应用自然易感动物,例如羊、猪、狗、鸡甚至马和牛等大动物作各该病毒的实验研究。 但如上述,普通实验动物经常自身带毒,甚至发生病毒病的流行。例如家兔常有乳头状瘤、多型瘤、疱疹、兔痘、脑脊髓炎和传染性口腔炎等病毒感染,小白鼠常有鼠痘(脱脚病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、病毒性肺炎、脑脊髓炎、白血病、乳腺瘤、鼠肝炎等病毒感染,仓鼠有唾腺炎等病毒感染,豚鼠有脑膜炎、唾腺炎等病毒感染,实验研究时必须注意。 实验动物主要用于: (1)分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒; (2)培养病毒,制造抗原和疫苗; (3)测定各毒株之间的抗原关系,例如应用实验动物作中和试验和交叉保护试验; (4)制备免疫血清和单克隆抗体; (5)作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定,建立病毒病动物模型等。进行动物实验时,首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和系,以及适宜的接种途径和剂量。至于实验动物的饲养管理、接种和采血、剖检等具体方法,请参阅微生物学实验指导或有关专著。 二、鸡胚 鸡胚(包括其它禽胚)是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。 应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母鸡
医学微生物学实验报告 （本科） 实验室： 姓名： 学号： 班级： 海南医学院微生物学与免疫学教研室编写 二OO四年四月
第一次实验 【实验内容】 实验一微生物的形态与结构的观察 实验二微生物的分布 【结果记录及判定】 实验一微生物的形态与结构的观察 1、细菌正常形态及特殊结构的观察及记录（示教）：绘图并描述 形状：形状： 排列：排列： 染色性：特殊结构：霍乱弧菌破伤风梭菌芽胞 形状：形状： 排列：排列： 特殊结构：特殊结构：肺炎链球菌荚膜伤寒沙门菌鞭毛 形状：形状： 排列：排列： 特殊结构：特殊结构：炭疽杆菌脑膜炎球菌 2、病毒包涵体观察及记录（示教）：绘图并描述 描述： 狂犬病毒包涵体（H-E染色） 3、真菌的形态观察及记录（示教）：绘图并描述
形状：形状： 排列：排列： 特殊结构：特殊结构：白假丝酵母菌皮肤癣菌 4、革兰染色法结果观察及记录：绘图并描述 形状：形状： 排列：排列： 染色性：染色性：葡萄球菌大肠埃希菌 实验二微生物的分布 结果记录： 1、空气中的细菌 种类（种）：数量（个）： 2、水中细菌数检测 （1）自来水中细菌的种类（种）：数量（个）： （2）污水中细菌的种类（种）：数量（个）： 3、物品和手指上的细菌检查（记录本人结果） 物品表面的细菌种类（种）：数量（个）： 手指表面的细菌种类（种）：数量（个）： 结论： 成绩：_________________ 批改教师签名：____________ 批改时间：________________
第二次实验 【实验内容】 实验三微生物的分离培养 实验四抗菌药物敏感性试验 实验五消毒、灭菌、除菌 【结果记录及判定】 实验三微生物的培养 1、细菌分离培养方法（分区划线接种法），生长现象为： 2、纯种细菌接种技术 （1）琼脂斜面接种培养，大肠埃希菌生长现象： （2）液体培养基接种法，大肠埃希菌生长现象： （3）半固体培养基接种技术 ①标本名称：大肠埃希菌半固体培养基②标本名称：痢疾志贺菌半固体培养基 穿刺线：穿刺线： 培养基：培养基： 结论：结论： 3、沙保弱琼脂平板上的真菌菌落观察及描述（示教）： 类酵母型菌落： 丝状菌落： 实验四抗菌药物敏感性试验 实验五消毒、灭菌、除菌 一、紫外线灭菌法（示教） 玻璃盖遮住平板的一半 现象：现象：
《兽医微生物学实验》教学大纲 课程名称：兽医微生物学实验 英文名称：Experimental Course for Veterinary Microbiology 课程总学时：32 实验学时：32 课程总学分：1 适用专业：动物医学 一、课程性质与任务(100～300字) 兽医微生物学实验是动物医学专业的一门专业必修课，其配合兽医微生物学的理论课教学，注重兽医微生物学基本的实验方法和技能的培养，并紧密结合临床实际运用。实验内容包括微生物学基本实验操作，微生物的分离、培养及鉴定方法。通过实验教学和操作使学生加深对理论知识的理解与运用，掌握微生物学诊断中常用的基本实验手段及技能，培养学生正确记录、处理和分析实验数据，养成实事求是、严肃认真的科学作风和细致整洁的实验习惯，为今后从事兽医学相关工作打下良好的基础。 二、教学目的与要求(600字以内) 1、系统练习和掌握兽医微生物学的基本实验室操作技能； 2、掌握微生物的分离、培养及鉴定方法； 3、能够综合运用微生物学实验方法对特定传染病的诊断进行实验设计。 三、实验项目设置 （一）实验一：细菌的基本形态及染色观察 1、实验类型：验证 2、实验学时数：4 3、实验目的：认识细菌的基本形态和结构 4、实验内容
（1）细菌的形态观察。 （2）细菌的特殊结构观察。 5、实验要求：通过细菌标本片观察，进一步熟悉光学显微镜的使用。 6、实验仪器设备：光学显微镜、细菌标本片。 （二）实验二：细菌抹片的制备及染色，培养基的制备 1、实验类型：验证 2、实验学时数：4 3、实验目的： （1）掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。 （2）熟悉一般培养基制备的原则和要求。 4、实验内容： （1）细菌抹片的制备。 （2）几种常用的染色方法。 （3）普通肉汤培养基和普通琼脂培养基的制作。 5、实验要求 （1）认识革兰氏染色和抗酸染色的反应特性。 （2）熟悉一般培养基制备的过程。 （3）掌握培养基酸碱度的测定。 6、实验仪器设备：酒精灯、显微镜、高压锅、培养箱。 （三）实验三：细菌分离培养及移植、环境中微生物检验 1、实验类型：验证 2、实验学时数：4 3、实验目的：
实验三动物病毒的鸡胚培养 一、实验目的 掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用 三、器材 1．病毒痘苗病毒〔Vaccinia virus〕，鸡新城疫病毒〔Newcastle distase virus〕。 2仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，25％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡〔固体石蜡加1／4凡士林，溶化〕，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。 3白壳受精卵〔自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好〕。 四、操作步骤 1．准备蛋胚 孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育〔37℃，相对湿度是45%~60%〕，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比拟大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。 鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d 后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供给缺乏，会导致鸡胚大量死亡。 2接种 〔1〕绒毛尿囊膜接种
℃将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。 ℃用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形〔每边约5~6mm〕的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。 ℃用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜别离。 ℃用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室〔图℃—4〕。 ℃用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴005~痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。 ℃在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，那么将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48~96h观察结果。 温度对痘苗病毒病灶的形成影响显著，应严格控制培养温度在37℃，高于40℃的培养温度，鸡胚不能产生典型病灶。 〔2〕尿囊腔接种用孵育10~12d的蛋胚，因这是尿囊液积存得最多。 ℃将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出其实与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方做记号。 ℃将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。 ℃用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，病毒液〔图℃—5〕。 ℃用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72h。 〔3〕羊膜腔接种
病毒类疫苗生产过程中的动物细胞培养及其技术发 展 疫苗是将病原微生物（如细菌、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。根据其所预防的传染病病原体种类不同大致可分为细菌类疫苗和病毒类疫苗两大类。现在在人群中使用的病毒类疫苗，除了乙肝疫苗是通过基因工程方法制得，其他病毒类疫苗生产都需要通过对病毒的培养，而后再经过纯化、浓缩、或灭活或裂解等过程制备。病毒体是一类专营宿主细胞内寄生型微生物，其繁殖需要在其特定的宿主细胞内进行。所以，病毒类疫苗生产过程中对病毒的培养就需要首先培养病毒体能够在其中繁殖的动物细胞。直接感染动物培养病毒存在着不同个体之间的差异，后继纯化程序太过繁琐等缺点，存在一定的安全隐患，所以此种病毒培养方法现在已经基本被淘汰。 在2010 年版的《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）第三部生物制品类中预防类生物制品共包括48 种疫苗，其中病毒类疫苗共有27 种，分别针对乙型脑炎、森林脑炎、狂犬病、流感、乙型肝炎、甲型肝炎、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹和肾综合征出血热等11 种病毒性传染病。在这27 种病毒类疫苗的生产工艺过程中，有两种重组乙型肝炎疫苗是使用重组CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）和重组酵母菌生产乙型肝炎表面抗原蛋白质作为疫苗抗原，其他病毒类疫苗生产中病毒的培养方式全是在动物细胞中，包括，通过原代细胞培养方式、通过
人二倍体细胞或Vero 细胞培养方式、在鸡胚中培养方式。在相应的病毒接种之前，首先要做的工作就是培养这些动物细胞。 1 动物细胞培养一般过程动物细胞培养是指在体外培养活的动物细胞群体，当前，许多生物技术领域都会使用到此项技术。特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如疫苗或基因工程药物在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。动物细胞培养常用的仪器设备包括，无菌室、超净工作台、低温冰箱、pH 计、压力蒸气消毒器、电热恒温培养箱、培养器具、CO2培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、离心机、无菌过滤器、洗刷装置、细胞计数板和电子细胞技术仪等等[1] 。细胞培养又可分为原代细胞培养和传代细胞培养。 1.1 原代细胞培养原代细胞培养是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。其基本步骤包括：取材、剪切、消化、分离、计数、培养，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及其生长环境的无菌[2] 。由于原代培养的细胞转化极性较小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗。在《药典》第三部病毒类疫苗中，包括利用原代兔肾细胞培养风疹病毒，利用原代猴肾细胞培养脊髓灰质炎病毒，利用原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒、乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒、森林脑炎病毒，利用原代鸡胚细胞培养麻疹病毒、腮腺炎病毒，利用原代沙鼠肾细胞培养肾综合征出血热病毒。 但原代细胞培养也存在着有潜在外源因子、不能事先检查标化、且
微生物的培养方法 实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内 的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图1） 图1 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌
落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 ８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 ２、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。
动物微生物及免疫学实验报告 一、实验目的 （一）掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。 （二）掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。 （三）掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。 二、实验用品 （一）器材 量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平 皿、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎 绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜 （二）试剂及材料 肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、 0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐 酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏 三、实验步骤 （一）培养基的制备 （所有用到的器皿都已121℃高压灭菌15~30min，倾注平板在无菌操作台内完成，并放在 无菌操作台内） 1、麦康凯培养基
（1）组成：蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水1000ml （2）方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节pH至7.2。将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。将 两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌 15~30min。待冷却至50 ~ 55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀 后倾注平板。 注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。 2、血清平板 （1）组成：营养琼脂、牛血清 （2）方法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至45~50℃时，加入牛血清，并混匀，倾注平板。 注：不得将牛血清一并加入后再灭菌。 3、LB培养基 （1）组成：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g （2）方法：在950ml蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠，调节pH至7.4，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。待冷却至50 ~ 55℃时，倾注平板。 4、液体培养基（在LB培养基的基础上，装入大试剂瓶中，不加琼脂，不分装）（二）病料取材 在病猪死亡后，首先用显微镜检查其末梢血液膜片中是否有炭疽杆菌存 在，未发现，则立即用消毒的器械对其进行生理解剖，观察其病理特征 现象，取出病猪的十二指肠、胃、肝脏三处的组织物，并注意组织的完 整性，用储物袋密封保存。
实验一培养基的制备与灭菌 实验步骤： （一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用） 每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。 （二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。 （三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。 培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。 配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。 培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。 （四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用） 每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。 （五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用） 枯草样预处理：每组1瓶。100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。 （六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。
综合性实验 实验一、噬菌体的分离和纯化及效价测定病毒是一类个体极小的超显微生物,必须借助电子显微镜才能观察到。病毒没有细胞结构，大多数病毒是蛋白质与核酸组成的大分子，每种病毒的核酸或是RNA或是DNA。它们是专性寄生物，不能独立进行代谢活动与繁殖，只能在特异的宿主细胞内进行复制。根据宿主的不同，可将病毒分为动物病毒(包括昆虫病毒)、植物病毒与细菌病毒——噬菌体等。由于病毒是专性寄生物，因此还不能用人工培养基进行培养，对病毒的培养与测定主要依靠实验性感染，例如细菌病毒(噬菌体)需要对特异性细菌进行感染：植物病毒进行实验性植物感染，而动物病毒常用鸡胚培养和组织培养来代替动物的实验性感染：昆虫病毒则用昆虫感染或组织培养。 一、实验目的 1、学习噬菌体分离、纯化的基本原理和方法。 2、观察噬菌斑，学习噬菌体效价测定的基本方法。 二、基本原理 因为噬菌体是专性寄生物，某种噬菌体往往只能感染一种或与它相近的某种细菌，其分布一般取决于宿主细菌的分布，所以自然界中凡有细菌的地方，均可发现其特异的噬菌体的存在。例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，在其中能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体：乳牛场有较多的乳酸杆菌，容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。虽然近年的研究表明，自由噬菌体颗粒可以在环境中短期独立存活，对自然条件有一定的耐受能力，又受到自然流动的散布，不一定总是和其宿主细菌同时存在，但没有宿主细菌的地方，其特异噬菌体的数量比较少。 大多数烈性噬菌体DNA (或RNA)侵入细菌细胞后迅速进行复制、转录和系列基因的表达并装配成噬菌体颗粒，通过裂解宿主细胞或通过"挤出"(exclude)宿主细胞(宿主细胞不被杀死，如M I3噬菌体)而释放出来，可使混浊的菌悬液变为澄清或比较清，此现象可指示有噬菌体存在。也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而分离到特异的噬自体。在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染
医学课程教案模板 医学微生物学试验课程教案医学微生物学实验课程教案 主讲教师：宋利琼 （2008年度春季学期） 内容：病毒学检查法（综合性实验） 授课对象：2006级医学专业学生教学时间及学时：3学时教学目的和要求：【目的要求】 一、了解病毒的基本形态，熟悉包涵体的特点及意义。 二、掌握流感病毒血凝和血凝抑制试验原理。 掌握乙型肝炎病毒的血清学检测法及临床诊断意义。 四、了解病毒动物接种法、病毒鸡胚培养法、病毒组织培养法。 五、了解病毒感染的检测方法（如PCR法检测病毒）。教学重点和难点： 一、观察病毒包涵体（内基氏小体等） 二、单层细胞培养及CPE的观察 三、病毒的分离培养（录象） 四、病毒CPE形成过程（录象） 五、PCR鉴定病毒感染（录象）教学方法：1．注重学生综合、分析能力培养，调动学生学习的主观能动性2．启发式、互动式教学手段，强调学生的协作性和团体精神。 3、对学生严格把关，保证实验课的过程和结果。【思考题】
一、病毒感染的常见检查方法及程序有哪些？ 二、病毒包涵体是什么？在诊断上有什么意义？参考书目： 1、医学微生物学与免疫学实验指导,三峡大学医学院微生物与免疫学教研室编 2、医学微生物学与免疫学实验指导,河北医科大学微生物与免疫学教研室编 3、医学微生物学与免疫学实验指导,同济医科大学微生物与免疫学教研室编 教学内容及时间分配：（要求全面、具体） 一、病毒感染的常见检查方法及程序（看录像） 60分钟 二、实验考试 60分钟 （一）笔试（每组10个题目） （二）口试（每个学生一个病案讨论） 三、病案讨论 30分钟【附录】临床病毒学讨论 冼某，男，58岁。病案号：159589。因耳鸣、牙龈出血、腹胀7个月，于2003年5月13日入院。患者患有乙型肝炎20年，7个月前出现耳鸣、牙龈出血，在它院治疗，中医诊断为“耳鸣”，经给予滋肾养肝等中药治疗(具体药物不详)，上述症状略有好转，但常反复发作，且于劳累后加重，来我院求诊时症见：面部及胸部皮肤呈浅灰蓝色，耳鸣，牙龈出
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理
动物(兽医)微生物实验(教学实践)报告
四川农业大学 动物微生物学及免疫学教学实践实验报告 大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的猪病料病原菌的 分离与鉴定 专业：动物医学 班级: 组别：第一组 指导教师：
一培养基的制备 ﹝目的要求﹞ 掌握一般培养基的制备原则和要求；熟悉一般培养基的制备过程；掌握培养基酸碱度的测定。 ﹝实验材料﹞ （1）器皿：量筒（100ml两个）、烧杯（100ml 和1000ml各一个）、漏斗（两个）、三角烧瓶（100ml 两个）、试管（七支）、玻璃棒（两根）、玻璃平皿、刻度吸管（1ml和10ml各两个）、PH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、扎绳、包装纸、洗耳球、酒精灯。 （2）试剂：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钾，琼脂条或粉，0.1mol/L和1mol/L的氢氧化钠、0.1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、麦康凯琼脂粉、三塘铁琼脂粉。
﹝方法内容﹞ （1）按下表计量称取各种试剂（先称取盐类再称取蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 （2）普通琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→调节PH—→塞棉塞和包扎—→灭菌 麦康凯琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→装入盐水瓶—→塞棉塞和包扎—→灭菌 三塘铁琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→分装入试管—→塞棉塞和包扎—→灭菌 （3）培养基的分装：用玻璃漏斗、橡皮管、小玻璃管及弹簧夹制作分装装置—→选用15×150平口试管或300ml锥形瓶—→分装（每管约10ml）（4）棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎分别制作试管和锥形瓶的棉塞并塞好，再用干洁的报纸将其头部包扎好。 （5）培养基的灭菌将培养基置于高压蒸汽锅内，121℃灭菌15至30min。 （6）TSI斜面、普琼和麦康凯琼脂平板的制作TSI斜面：灭菌后趁热将管口一端搁在玻棒上，使之
实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测篇一: 实验五十动物病毒的鸡胚培养实验五十一动物病毒的鸡胚培养 三、器材 1(病毒痘苗病毒(Vaccinia virus)，鸡新城疫病毒(Necastle distase virus)。 2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座 木架，注射器， 2.5,碘酒，70,乙醇，镊子，剪刀，封蜡(固体石蜡加1,4凡士林，溶化)，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。 3.白壳受精卵 (自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好)。 四、操作步骤 1(准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育(37?，相对湿度是45%~60%)，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精 卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚 可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后 每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可 能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育 到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。
2.接种 (1)绒毛尿囊膜接种 ?将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。 ?用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形(每边约5~6mm)的小窗，不 可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。 ?用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜 上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在 下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。 ?用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室(图?—4)。 ?用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。 ?在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37?培养，48~96h观察结果。温度对痘苗病毒病灶的形成影响显著，应严格控制培养温度在37?，高于40?的培养温度，鸡胚不能产生典型病灶。 (2)尿囊腔接种用孵育10~12d的蛋胚，因这是尿囊液积存得最 多。 ?将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出其实与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方做记号。 ?将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并 用钢针在记号处钻一小孔。
常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
微生物培养及实验基本操作技术 一、培养基配制 培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。 配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。 注意事項–灭菌锅的使用 ①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀 灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門 進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆 拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套 培养基中的主要成分及其作用： 营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水 常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏 常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖
双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油） 水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等 抑制剂： 1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率 2、种类： 盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等 染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红 胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐 抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素 指示剂 1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含
氮化合物，产酸产碱的能力。 2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。 培养基的类型： ●根据培养基的物理状态来区分： 1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养 2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定 3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种 4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。 ●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装 瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。 ●根据培养基的用途来区分： ➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基 1、增殖培养基：在普通培养基中加入
兽医微生物学实验指导 畜牧兽医教研组编 龙岩学院 二00六年十月
编写说明 本实验指导配合《兽医微生物学》使用，目的是训练学生掌握兽医微生物学最基本的实验操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的兽医微生物学理论知识，同时，通过实验培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是，严肃认真的科学态度；为以后课程的学习和将来的工作以及科学研究打下坚实的基础。 本实验指导是在参考有关院校的兽医微生物学实验教材的基础上，结合我们的实验室条件以及仪器设备状况，经过多方取舍编写而成，可供生物科学系师生参考。 由于编者水平有限，加上时间仓促、经验不足，在许多方面肯定有不少缺点与错误，希望各位读者批评指正。 在编写过程中，得到龙岩学院生物系全体师生的大力支持，在此表示感谢。 编者 2006.10
目录 实验一微生物染色法 (1) 实验二培养基的配制和灭菌 (7) 实验三细菌的分离与培养 (10) 实验四双向免疫扩散试验 (13) 实验五凝集反应 (17) 实验六酶联免疫吸附试验（ELISA） (20) 实验七细菌各论（1） (23) 实验八细菌各论（2） (26) 实验九病毒的鸡胚培养 (28) 实验十病毒的血凝及血凝抑制试验 (31)
实验一微生物染色法 一、目的要求 1、学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。 2、了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。 3、学习掌握细菌芽孢染色方法。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。