抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及功能验证猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以脱水、腹泻、肠绒毛严重萎缩为主要病变的传染病。2010年以来,PEDV变异株在世界多国猪场相继暴发流行,其对哺乳仔猪致病性强、死亡率高,一周龄以下的仔猪感染后其致死率可高达100%。 该PEDV变异株的出现在我国及全球造成重大经济损失,严重威胁着养猪业的健康发展,开发用于检测PEDV感染的制剂和相应方法显得尤为重要且紧迫。核衣壳蛋白(N)在不同的PEDV毒株间高度保守、且在宿主感染早期合成,因此,PEDV N蛋白是作为感染早期检测的理想靶标。 为有助于开发一系列检测PEDV感染的方法,本研究制备了抗PEDV N蛋白的单克隆抗体,并测试了其在不同检测方法中的应用前景。首先,本研究从PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法扩增获得了N基因,随后将其因克隆至 pET-30a(+)原核表达载体,获得了表达PEDV N蛋白的重组表达质粒,并将其命名为pET-N。 将pET-N转化至BL-21(DE3)感受态细胞中表达N蛋白,结果表明,该目标蛋白以分泌型及包涵体形式同时表达。经优化表达条件,最终获得大量分泌型表达的N蛋白。 采用镍柱亲和层析技术对所获得的重组N蛋白进行纯化,结果显示,本研究获得高纯度的PEDV N蛋白。将200μg纯化后的PEDV N蛋白与ISA15佐剂混合后于背部皮下多点免疫BALB/c小鼠,每两周以相同剂量及方式进行加强免疫。 第三次免疫一周后,采用等量N蛋白于腹腔注射进行加强免疫,3 d后处死小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,采用酶联免疫吸附
4.5 蜘蛛丝里有学问 你听说过用一小束细丝就能把小型飞机吊起来的事吗?这种丝就是我们许多人都看见过的蜘蛛丝。 曾经有人做过试验，发现扯断蜘蛛丝所需的力，比扯断同样粗细的钢丝所需的力足足大上100倍。通过对蜘蛛丝研究，还发现蜘蛛丝在目前已知的所有的高强度纤维里，是最柔软的，重量也最轻。 蜘蛛丝是由蛋白质分子构成的，因此，它和人体有生物的亲和性，可被微生物所分解，也有一定的吸湿性能，用它做的防弹衣将是世界上最坚固而又最轻柔、最舒适的防弹衣了。 据英国《每日邮报》报道，坚韧如钢、交错如织的蛛网无疑是大自然的神奇造物，富有弹性的蛛网甚至能抵御飓风的侵袭。日前，美国的科学家们正试图揭示蛛网的奥秘，希望能将其用于未来的建筑设计或耐用材料的研发。 美国麻省理工学院的研究人员表示，蛛网的成功之处在于：即使有多根蛛丝断掉，蛛网也不会垮掉，甚至会变得更牢固。实验中，研究人员在蛛网各处去掉了总计10%的蛛丝，蛛网的韧性不单没因此而降低，却反而增强了10%。 研究人员发现，这种韧性不单是源自每根蛛丝在质地上的强度，也同时源自蛛丝的内部结构。蛛丝纤维能够根据所承受压力的不同而变化柔韧程度，这种特性是其他任何自然纤维或人造纤维所不具有的。科学家们已经证明，蛛丝的强度是等质量钢丝的5倍。实验表明，蛛网的韧性是其他网格的6倍有余。 工程师可以将蜘蛛丝的构造原理应用到其它方面。蜘蛛丝在受到破坏时只受很小的损坏、而不影响整个结构这一特性可以应用于设计虚拟网络，如互联网，在遭受攻击期间只有本地节点被破坏，而整个系统可继续运行。了解其微观的蛋白质结构和其宏观性质，可能有助于将碳纳米管串在一起，可能有一天会用于生产太空电梯。 蜘蛛丝具有广泛的用途：这是用蜘蛛丝做成小的提琴琴弦。 在医学领域，这种精细的蜘蛛丝是外科医生手术时是理想的缝合线，和医用尼龙线相比，这种蜘蛛丝既有尼龙线的灵活和结实，而且还有可以打结的优点。此外，它还可以用来制作人造肌腱或合成韧带。 由于蜘蛛丝的强度大，人们还可利用它制作降落伞绳，或航空母舰上帮助战斗机在甲板上降落的缆绳、高强度的轮胎帘子线和高强度渔网等。 既然蜘蛛丝有这么好的性能，有人会说我们也可以像养蚕宝宝那样来养殖蜘蛛，不就能得到好多蜘蛛丝了吗？事实上，这是不可能的，因为蜘蛛是一种同类相食的动物，如将众多的蜘蛛饲养在一个房舍里，它们会相互残杀吞噬。 能不通过蜘蛛来得到蜘蛛丝呢? 科学家们告诉我们，完全有这样的可能。 这有两个方面的工作，第一要得到蜘蛛丝的蛋白质，利用转基因技术，将蜘蛛的相关基因转移到细菌、植物体、哺乳动物的乳腺上皮或肾细胞中，进行表达，生成蜘蛛丝蛋白质，并进行提纯。 第二把这蛋白质纺成丝，这样就可得到人造蜘蛛丝了。
蜘蛛丝纤维之我见 高（101）张春娟 1008093006 摘要：蜘蛛丝是一种具有特殊品质的材料，迄今为止人类还无法生产出像它那样具有超强强度和弹性极强的化合物。人类一直梦想着利用蜘蛛丝的奇特性能来造福社会大众。 关键词：蜘蛛丝,性能,应用 节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜘蛛目(Araneida或Araneae)所有种的通称。除南极洲以外，全世界分布［1］。蜘蛛在整个生命过程中会产生许多不同的丝，它的柔韧性和弹性都很好，耐冲击力也很强。无论是在干燥状态或是潮湿状态下都有很好的性能，是一种目前已知弹性和强度最高的天然动物纤维。首先蜘蛛丝很细而强度却很高,它比人发还要细而强度比钢丝还要大。其次它的柔韧性和弹性都很好,耐冲击力强。无论是在干燥状态或是潮湿状态下都有很好的性能。蜘蛛丝网还有很好的耐低温性能。由于蜘蛛丝是由蛋白质构成,是生物可降解的,把这些优良的性能集中在同一种纤维上十分困难。人们开始考虑,如果能够用人工的方法大量而经济地生产这种纤维,必将对纤维和纺织业的发展产生 深远的影响。目前美国、加拿大、德国和英国等发达国家已投入大量的人力和物力进行研究,并已取得相当的进展,对蜘蛛丝的研究,已成为当今纤维界的热 门课题。 1 蜘蛛丝的形成原理及其性能 1.1 形成原理 在显微镜下，我们看到丝从蜘蛛的分泌出来，蜘蛛的腹腔里有许多丝浆，它的尾端有很小的孔眼。结网的时候，蜘蛛便将这些丝浆喷出去。丝浆一遇到空气，就凝结，且富有粘性和惊人的强度。每根蜘蛛丝的抗拉强度是钢材的2倍，弹性也比人造纤维好得多。比如，蜘蛛网可以延伸到原长的10倍，而尼龙一旦延展到原长的20％就会发生断裂无论什么飞虫，一撞到网上就别想再跑掉。而蜘蛛的身上和脚上经常分泌出一层油质，粘丝是不粘油的。但是，一般飞虫是没有这层油质的，所以，蜘蛛网能牢牢地粘住飞虫却粘不住蜘蛛［2］。
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 宁
1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min 90min 18H 24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较
第三节蜘蛛丝 蜘蛛丝是一种天然高分子蛋白纤维和生物材料。纤维具有很高的强度、弹性、伸长、韧性及抗断裂性，同时还具有质轻、抗紫外线、比重小、耐低温的特点，是其它纤维所不能比拟的。纤维初始模量高、断裂功大、韧性强，是加工特种纺织品的首选原料。蜘蛛丝由蛋白质组成，是一种可生物降解且无污染的纤维。 蜘蛛丝纺织品的生产可追溯至18世纪，最具代表性的是1710年巴黎科学院展出的蜘蛛丝长统袜和手套，这是人类历史上第一双用蜘蛛丝织成的长统袜与手套；1864年美国制作了另外一双薄蛛丝长统袜，所用的蛛丝是从500个蜘蛛喷丝头中抽取出来的，这种长统袜由于太薄而不能穿；1900年巴黎世界博览会上展示了用2.5万只蜘蛛吐出的9.14万米长的丝织成的一块长16.46m、宽0.46m 的布，该产品花费太高，没有带来商业利润。到1997年初，美国生物学家安妮·穆尔发现，在美国南部有一种被称为“黑寡妇”的蜘蛛，它吐出的丝比现在所知道的任何蜘蛛丝的强度都高。蜘蛛丝特殊的结构和性能已引起世界各国的关注，并在纺织、医疗卫生和军事领域产生了极其重要的影响。目前，国内外许多科学家已通过基因工程将蜘蛛的基因移植到其它动植物体内，从而使蜘蛛丝纤维实现工业化生产的梦想成为现实。 一、蜘蛛丝的组成 蜘蛛丝产生于蜘蛛体内特殊的分泌腺，这些分泌腺因蜘蛛的种类不同而各异。到目前为止，生物学家共发现了7种类型的分泌腺，常见的有葡萄腺、梨状腺、壶状腺、叶状腺、集合腺等。蜘蛛的种类繁多，会吐丝结网的大约有2万多种。按吐丝种类的多少，蜘蛛可分为古蛛亚目、原蛛亚目和新蛛亚目。古蛛亚目的蜘蛛只能吐出一种丝；原蛛亚目的蜘蛛可吐出3种丝；新蛛亚目的蜘蛛可吐出7种丝。一般来说，新蛛亚目所有的蜘蛛都会有7种丝腺，各种丝腺分别能吐出不同性质的蜘蛛丝(见表1-6)。 蜘蛛丝的主要成份是蛋白质，其基本组成单元为氨基酸。蜘蛛丝中含17种左右的氨基酸，各种氨基酸的含量因蜘蛛的种类不同而存有一定的差异。蜘蛛丝中含量最高的7种氨基酸的总和约占其总量的90%，它们分别为甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、亮氨酸和精氨酸(见表1-7)。 表1-6 圆蛛族7种丝腺吐丝及其性质
毕业设计开题报告 纺织工程 蜘蛛丝蛋白/聚吡咯复合纤维膜细胞相容性研究 一、选题的背景、意义 组织工程材料是当前生命科学和材料科学共同的前沿研究热点之一。目前已经开发应用于组织工程等生物医学领域的生物相容性高分子材料主要有胶原蛋白、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等，但大多数这类材料的原创性研究工作属于国外。我国是一个人口大国，因创伤和疾病造成的组织、器官丧失或功能障碍病例居世界各国之首，每年仅因烧伤需进行皮肤移植的患者就达百万之多。因此，积极寻找合适的原料，研制具有我国自主知识产权的生物材料，对于减小我国组织工程支架等生物材料对国外的依赖性，培育新的高新技术产业和实现国民经济的可持续发展具有重要意义。 研究者一直在寻找具有良好的生物相容性的支架材料以应用于细胞培养中，以及研究支架材料在细胞培养中的各项性能指标以及实验环境对细胞培养的影响，了解细胞在支架材料上的生长情况，以便更好的应用在临床中[1]。而导电支架细胞培养技术发展迅速，是近年来研究的热点。本文主要选择蜘蛛丝蛋白和聚吡咯复合制得的支架材料，将细胞培养在带电的支架材料上，重点研究培养过程中支架材料的性质、电刺激的电流强度及电刺激的时间长短对细胞再生的影响。 二、相关研究的最新成果及动态 2.1 蜘蛛丝蛋白的概况和研究现状 2.1.1蜘蛛丝蛋白的概况 蜘蛛丝的主要成份为蛋白质，如所有的蛋白质纤维一样，其组成长链蛋白质的单元为带不同侧链R的酰胺结构，同尼龙2结构相似[2]。蜘蛛丝的氨基酸的摩尔分数和氨基酸的主链序列与天然聚肽如蚕丝、羊毛和人头发有很大的差异。这种差异和组成取决于蜘蛛的种类、食物、气候及其它因素。不同蜘蛛丝所含的氨基酸种类差异不大，为十七种左右，各种氨基酸的含量也因蜘蛛的种类不同而有一定的差异。它们的共同点为具有小侧链的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸的含量丰富，十字圆蛛和大腹圆蛛的这两者含量之和分别达到59.6％和53.2%与蚕丝的含量74.0％相比较就显得较低[3]。 蜘蛛丝是一种特殊的蛋白纤维，它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度和抗断裂功能，
蛛丝蛋白的研究现状和进展 摘要：蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由于其高度重复的一级结构、特殊的溶解特性 和分子折叠行为以及具有形成非凡力学特性丝纤维的能力而引人注目。本文主要对蛛丝蛋白的结构、特点以及目前对其研究比较多的应用和新型的合成方法进行综述，同时也对将来蛛丝蛋白的研究方向以及在研究中可能会遇见的问题进行分析。通过本文的介绍希望可以在其蛋白质的结构上有更深刻的理解和认识，同时也为蛛丝蛋白的研究和应用提供一个很好的参考和依据。 关键词：蛛丝蛋白；结构；基因合成；弹性、韧性材料 前言：蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白，它是由节肢动物门昆虫纲、蛛形纲和多足纲中 某些类群的特殊腺体产生的。蛛丝主要包括拖丝和捕捉丝, 其中拖丝主要用于构成蜘蛛网的牵丝和轮状网面, 捕捉丝则用来粘附昆虫并在昆虫挣扎时提供强大的弹性, 以免由于强大的动能导致反弹, 将捕捉到的食物弹出去。因此，蛛丝蛋白的结构性能以及其强大的力学特性值得深入的研究。另外，尽管某些具有优良力学特性的蛛丝可以被开发为有潜力的、应用价值高的新型生物材料，但在人工条件下大规模、高密度地养殖蜘蛛以获得蛛丝的现实困难迫使人们寻求另外的途径生产蛛丝蛋白来满足研究、开发和应用的需要。因此，高效的合成和生产方法变得也不可忽视。纵观近十年的研究史，大多数好的研究技术也逐渐走向成熟。比如近来从蜘蛛丝腺cDNA文库中克隆蛛丝蛋白基因或通过化学合成编码蛛丝蛋白的人工基因用于重组蛛丝蛋白基因工程生产已成为制备蛛丝蛋白的一个主要方法。蛛丝蛋白基因克隆和表达的成功为人们初步了解各种类型蛛丝蛋白分子的结构、折叠行为和功能之间的内在联系及各种类型蛛丝各自独特力学特性的分子基础提供了良好的开端。与上述蛛丝蛋白的结构与性能的研究深入，它的应用也逐渐发展起来。比如研究人员首先通过转基因技术培育出了一种山羊，这种山羊能够生产出具有蛛丝蛋白的羊奶。在羊奶中加入一种特殊的溶剂后，就能提取到大量的蛛丝纤维。这种蛛丝纤维甚至比著名的凯夫拉尔纤维还结实，强度是钢的10 倍。将这些纤维纺纱编织就能制成所需要的“超强布料”。同时，蛛丝蛋白在其结构性能和应用方面的研究同时也面临着众多的问题等待解决。 一、蛛丝蛋白的结构和功能 1、总体认识：蛛丝蛋白具有典型的蛋白质二级结构，即蜘蛛丝由α-螺旋和β-片层共同 组成。 特点：1、规则的β-片层被不规则的α-螺旋和β-弯曲所包围。 2、β-片层赋于丝力度α-螺旋赋于丝弹性。
万方数据
一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一呈四尘篷野詈翼第７ｐ期有良好的弹性和强度，一根直径几微米的丝纤维能承受不同力学性能的，能满足不同用途要求的蜘蛛丝纤维。 几克重的蜘蛛，这些现象引起了人们对蛛丝研究的极大兴趣。蜘蛛丝力学性能的具体测试结果的报道最早见于１９０７年，在随后的几十年中，人们对络新妇、十字园蛛、大腹园蛛以及黑寡妇等多种不同蜘蛛牵引丝、包卵丝、捕获丝、框丝等做了大量的研究和分析”ｅ｜。研究结果表明，蜘蛛牵引丝具有优于其他天然纤维、化学纤维的综合力学性能。强度高、弹性大、韧性好，单位重量的蜘蛛丝承受外加能量的能力不但大于蚕丝，而且大于钢丝及Ｋｅｖｌａｒ等高性能合成纤维。表ｌ所示为主要的几种蜘蛛牵引丝的力学性能以及与其他纤维的比较。 表１蜘蛛丝与其他纤维力学性能的比较１．１．２超收缩性能１．２蜘蛛丝的结构特点 蜘蛛丝是具有多级结构的蛋白质纤维，牵引丝具有皮芯层结构，芯层内含有数十根纳米级的微纤维。蜘蛛丝的基本组成单元为氨基酸，纤维性能受分子的构象、结晶度、取向度、纤维的形态结构等多种结构因素的综合影响。下面以牵引丝为例，分析其结构和性能间的关系。 １．２．１氨基酸组成 如图ｌ所示，为不同种类蜘蛛分泌的牵引丝的氨基酸组成，牵引丝中含量最多的是甘氨酸、其次是丙氨酸，两者之和占总氨基酸含量的５０％～７０％，同时含有较多的谷氨酸和脯氨酸。研究表明［１７￣２０Ｉ，聚丙氨酸分子链段为Ｂ一折叠结构，主要存在于结晶区，甘氨酸含量较多的氨基酸片段为螺旋或更复杂的结构。谷氨酸和脯氨酸对分子结构有重要作用。谷氨酸为酸性氨基酸，其侧基上的氨基和羧基使分子问的键合作用加强，而脯氨酸的存在将有利于分子链形成类似于Ｂ一转角的弹性螺旋状结构，增强纤维的弹性。牵引丝中小侧基氨基酸含量普遍比蚕丝丝素低得多，而极性氨基酸含量远大于后者，蜘蛛牵引丝的这 蜘蛛牵引丝的另一重要性能特征是在水中具有超收种氨基酸组成特征，对于多肽大分子链的构象以及纤缩能力。在湿态下蜘蛛大囊状腺分泌丝的横截面增加约维的聚集态结构有很大的影响。 ６０％ｎ３１。牵引丝在不同极性溶剂中的收缩能力有较大差、。５０，．．Ｒ面丽习 异，在水中，牵引丝的收缩率达５０％左右，在乙醇中§４０｝摘。旧嚣景警ｌ筹鬈雾妻嚣磊淼焉袅？兰筹鬈篙磊曩菲圳．痂．圃．妇血盘盥惹趔纤维所受的原始伸长有很大的关系，当给纤维一定的预翟‘钏叫叫．岫ｌｊ瞄田整．缝．盥．嗌。盥．堡．堡墼 伸长时，收缩率下降…１。牵引丝的这种超收缩性能对氨基酸成分 于解决仿生蜘蛛丝的加工和蜘蛛丝的基础研究中纤维性能多变性的困扰有重要作用。研究证明ｎ６｜，通过控制牵引丝的收缩可以预测和重演丝纤维的拉伸行为。虽然天然牵引丝的力学性能有较大的分散性，但对人工卷取的牵引丝进行不同程度的收缩，可以获得力学行为和各组天然丝纤维十分接近的纤维，因此通过人工卷取和控制牵引丝在水中收缩度的方法可以得到具有不同力学性能的蜘蛛丝，并且这些纤维的力学性能有良好的重现性。如果人造蜘蛛丝在水中也具有超收缩性，则可以将控制水中收缩率引入丝纤维的后加工中，从而获得具有十字园蛛氨基酸组成。２“，脂肋』ｊａ氨基酸组成”…，黑寡妇氨基酸组成【２３］ 图１不同种类蜘蛛牵引丝氨基酸组成比较１．２．２分子构象与聚集态结构 蜘蛛丝纤维中分子的存在状态和排列形式的解析，是分析其力学性能的形成机理的关键因素之一，尤其是天然蜘蛛丝的成丝条件和其分子结构及聚集态结构问关系的研究，对人造蜘蛛丝生产工艺的研究具有十分重要的作用。 络新妇牵引丝含有Ｂ一折叠、３，。一螺旋、Ｑ一螺旋、 ４ｌ 万方数据
蜘蛛丝纤维 蜘蛛是地球上最古老的物种之一，是自然界的神奇动物，经历了几百万年漫长的进化，蜘蛛已能够适应地球上几乎所有环境而生存下来，其最大的臂助正是本身独特的纺丝能力和令人惊讶的蛛丝性能。蜘蛛是自然界产丝和用丝的“专家”，它们一生都离不开丝。蜘蛛生产性能最优异的丝线，并用这种丝线织成蛛丝网，用以捕获猎物，赖以生存，繁衍后代。蜘蛛，属节肢动物门蛛形纲蛛形目，种类繁多，会吐丝结网的大约有2万多种，按吐出丝种类的多少分为古蛛亚目、原蛛亚目和新蛛亚目。 科学家们早就注意到蜘蛛丝非同一般的性能并将它利用了起来。早在1709年就出现了人类利用蜘蛛丝的记载，而且在第二次世界大战时，蜘蛛丝曾被广泛用作显微镜、望远镜、枪炮的瞄准系统等光学装置的十字准线。进入20世纪80年代,蜘蛛丝，尤其是牵引丝，以高强度、高弹性、高断裂功、低密度、良好的耐温及耐紫外线性能、良好的生物相容性等优异性能引起了各国材料、生物和化学等众多领域研究人员的极大兴趣。科技的进步，亦使得破解蜘蛛丝的生物奥秘成为了可能。1996年，美国Science杂志连载3篇文章，揭示了蜘蛛丝性质与结构的关系以及蜘蛛丝的奥秘，近几年，又连续发表了10多篇关于蜘蛛丝研究的文章。美国、瑞士、加拿大、日本、德国、丹麦等国的一些实验室先后对蜘蛛丝做了深入的研究,在利用基因和蛋白质测定技术解开蜘蛛丝奥妙的同时,在蜘蛛丝人工生产方面也取得了突破性进展。 蜘蛛丝的结构与性能 蜘蛛丝能大量吸收动能，同时具有高弹性形变，究其原因，在于其奇妙的分子结构。蜘蛛丝的化学本质为蛋白质，蛛丝蛋白的复杂氨基酸序列和空间结构赋予了外显的性能。蜘蛛丝中分子排列是一种介于晶区与非晶区的中间相的存在。结晶区主要为聚丙氨酸链段，构象为β- 折叠链，分子链或链段沿着纤维轴线的方向呈反平行排列，相互间以氢键结合，形成折曲的栅片，栅片间距离是变化的，在0.93～1.57nm
蜘蛛丝与蚕丝的比较研究 王来力 （上海 东华大学 200051） [摘 要]：从形态结构、物理性能、力学性能、热学性能及成丝机理等几个方面对蜘蛛丝和蚕丝进行了对比分析，指出了蜘蛛丝与蚕丝的异同点，介绍了人造蜘蛛丝的发展趋势和应用前景。[关键词]：蜘蛛丝；蚕丝；结构；性能；比较 1．引言 蚕丝发源于我国，到现在已有六千多年的历史。蚕丝是高档纺织原料，具有强伸度好、细而柔软、富有弹性、光泽好、吸湿性好等优点，被誉为“纤维皇后”，蚕丝织物广泛应用于人们的日常生活，在工业及国防上也有重要的用途[1]。蜘蛛丝作为另一种蛋白质纤维，从上世纪90年代开始成为新材料的研究热点。蜘蛛丝具有高强度、高韧性、高弹性和良好的耐热性能，被称为“生物钢”，在军事、航空航天以及医疗等方面具有很大的应用潜力[2]。本文结合国内外的文献资料，对蜘蛛丝和蚕丝进行了多方面的比较研究，指出了二者的异同之处。 2．蜘蛛丝与蚕丝的形态结构比较 纤维的形态结构在很大程度上决定纤维的性能，蜘蛛丝与蚕丝在力学性能、机械性能方面存在较大的差异，必然是由二者形态结构的不同引起的。 蜘蛛丝是具有多级结构的蛋白质纤维，外观呈金黄色，透明，横截面为圆形，具有皮芯层结构，芯层内含有数十根纳米级的微纤维。蜘蛛丝纤维直径平均为6.9μｍ，大约为蚕丝的一半，体积重量为1.34g/cm3。蜘蛛丝蛋白质是由各种氨基酸组成的多肽链按照一定方式组合而成的，其中的氨基酸主要以甘氨酸和丙氨酸为主，约占总量的70%，其他为丝氨酸、谷氨酸、亮氨酸等[3]。 蚕丝纤维多为白色或乳白色，主要由丝素和丝胶两部分组成，里面为两根平行的丝素，外面包裹着丝胶，其他物质为蜡质、色素和无机物等。蚕丝纤维横截面呈半椭圆形或略呈三角形，单根丝素截面呈三角形。蚕丝纤维的蛋白质是由一条长链和一条短链构成的亚单位结构，长链主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等组成，短链含有较多疏松残基的氨基酸[4]。蜘蛛丝和蚕丝的氨基酸含量对比如表1所示。
实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
天然蜘蛛丝仿生材料 摘要采用仿生学原理, 设计、合成并制备新型仿生材料是近年来快速发展的研究领域. 天然蜘蛛丝是一种生物蛋白弹性体纤维, 具有高比强度( 约为钢铁的5 倍) 、优异弹性( 约为芳纶的10 倍) 和坚韧性( 断裂能为所有纤维中最高) ,为自然界产生最好的结构和功能材料之一, 它在航空航天、军事、建筑及医学等领域表现出广阔应用前景. 受自然界蜘蛛丝启发, 天然蜘蛛丝仿生材料的研究迎来了机遇, 同时也给人们展示了许多新颖的仿生设计方法. 本文从不同仿生学角度综述了天然蜘蛛丝仿生材料的发展, 并提出了一些看法和思考。 1．天然蜘蛛丝结构、功能及应用 天然蜘蛛丝是蜘蛛经由其丝腺体分泌的一种天然蛋白生物材料 , 属于一种生物弹性体纤维 , 它是自然界产生最好的结构和功能材料之一 . 表 1 列出了天然蜘蛛丝和其它几种典型材料的力学性能 , 通过比较可以发现 , 天然蜘蛛丝优良的综合性能 , 特别是其高比强度 ( 约为钢铁的 5 倍 ) 、优异弹性 ( 约为芳纶的 10 倍 ) 和坚韧性 ( 断裂能180MJ /m3 为各材料中最高) 是其它天然纤维与合成纤维所无法比拟的。 此外 , 天然蜘蛛丝还显示出特别的扭转形状记忆效应 , 当它被扭转到其它准平衡位置时 , 由于高阻尼效应 , 它几乎不振荡 , 并且不需要任何额外的刺激就能以指数方式完全恢复到其初始的状态 , 从而有效防止悬挂在空中的蜘蛛转动摇摆正是由于天然蜘蛛丝具有质轻、超坚韧性、突出形状记忆效应及生物相容性好等特性 , 因此 , 它在航空航天( 如飞机和人造卫星的结构材料、复合材料 ,宇航服装 ) 、军事 ( 如坦克装甲、防弹衣、降落伞 ) 、建筑 ( 如桥梁和高层建筑的结构材料 ) 、医学 ( 如人造关节、肌腱、韧带 ) 等领域表现出广阔的应用前景 . 其实 , 早在 l709 年就出现了人类利用天然蜘蛛丝的记载 , 而且在第二次世界大战时 , 天然蜘蛛丝曾被广泛用作显微镜、望远镜、枪炮瞄准系统等光学装置的十字准线 . 天然蜘蛛丝已吸引了世界各国科学家的巨大兴趣和广泛关注。 2．天然蜘蛛丝仿生学及仿生材料 由于蜘蛛属肉食性动物不喜欢群居 , 当几只蜘蛛被放在一起时 , 它们之间往往会相互撕咬 , 所以难以像养家蚕那样大量饲养蜘蛛 ; 而且 , 蜘蛛本身存在很多丝腺器 , 不同腺器产生的丝性能不同 , 很难收集性能单一的丝此外 , 天然蜘蛛丝还难以直接加工成其它特定形状以供不同用途所需。由于以上原因 , 天然蜘蛛丝自身很难批量生产 , 其应用范围也受到了很大限制 , 因此需要寻求新的方法和途径 , 以大量获得具有天然蜘蛛丝相似结构和功能的新材料 . 因此利用仿生学原理 , 在认识天然蜘蛛丝结构和功能的基础上 , 设计、制备天然蜘蛛丝仿生材料 , 具有重大的科学意义和应用价值。 2. 1 蛋白基因仿生生物表达法 20 世纪 90 年代初 , Lewis 等首先报道了源于Nephilaclavipes 蜘蛛丝蛋白两种序列 ( 分别被称为MaSp1 和 MaSp2) 的部分 DNA 片段 , 由此揭开了天然蜘蛛丝蛋白基因与结构研究的序幕 . 在获取天然蜘蛛丝各种蛋白基因组成信息的基础上 , 科学家们开始采用生物表达的方法 , 即先构建天然蜘蛛丝相应的部分蛋白基因 , 然后采用生物工程技术手段 , 将这些蛋白基因寄托于某种生物载体 ( 如细菌、酵母、植物、哺乳动物、昆虫等) 进行表达并生产 , 从而获得包含天然蜘蛛丝部分蛋白基因结构的蛋白质原料 , 最后, 将这些仿生蛋白原料加工成所需要的形态( 如纤维) 进行利用( 如NexiaBiotechnologies 公司通过哺乳动物表达生产蛋白质 , 经过特殊的“纺线程序” , 纺出了重量轻、强度高的纤维 , 称之为“生物钢”)。利用蛋白基因仿生生物表达法制
2009;35(3)蚕 业 科 学 CAN Y E KEXUE 收稿日期:2009-06-01 资助项目:浙江省重中之重开放基金(编号S W YX0806),国家高技 术研究发展计划“863”项目(编号2007AA021703,2007AA100504),国家重点基础研究发展计划“973”项目(编号2005CB121006),国家自然科学基金项目(编号30740015)。 作者简介:郑青亮(1982-),男,浙江,研究实习员。 E 2mail:jackie4075@https://www.doczj.com/doc/2915277369.html, 通信作者:张耀洲,教授,博士生导师。 Tel:0571286843194,E 2mail:yaozhou@chinagene .com 蜘蛛丝的结构性能及表达策略研究进展 郑青亮 蒋彩英 张耀洲 (浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所,杭州 310018) 摘 要 蜘蛛丝是一种天然蛋白质纤维,具有高强度、高弹性、高断裂能等机械性能以及显著的可降解性、组织相容性等生物学特性,在生物医学、材料、纺织和军事装备等领域均有重大潜在应用价值。利用原核或真核表达系统表达蜘蛛丝蛋白可以大量获取蜘蛛丝。综述了蜘蛛丝蛋白序列结构特征以及蜘蛛丝蛋白在大肠杆菌、酵母、植物、动物细胞、家蚕等表达系统中的表达策略研究进展,并重点阐述应用家蚕表达系统表达蜘蛛丝蛋白的策略,可供规模化生产蜘蛛丝蛋白参考。 关键词 蜘蛛丝;机械性能;表达策略;家蚕表达系统 中图分类号 Q959.226;TS102.3 文献标识码 A 文章编号 0257-4799(2009)03-0685-07 P ro g ress o f S tu d ies o n th e S tru c tu re an d P rop e rties o f S p id e r S ilk an d its Exp res s io n S tra teg ies ZH EN G Q ing 2L ia ng J I A N G C a i 2Ying ZHAN G Ya o 2Zhou 3 (Ins titu te of B ioc hem is try,Zhe ji a ng S c i 2Te c h U n i ve rs ity,Ha ng zhou 310018,C h ina ) A b s tra c t Sp i d e r s ilk i s a na tu ra l p ro te in fib e r w ith m e c ha n ic a l p rop e rtie s s uc h a s h i g h s tre ng th,h ig h fle xi b il 2ity,h ig h fra c tu re e ne rg y,a nd w ith b i o l og ic a l c ha ra c te ris ti c s of e a s y d e g ra d a tion a nd h is toc om p a tib ility w h i c h ha ve s i g n ifi c a n t p o te n tia l ap p lic a tion va l ue i n the b iom e d i c a l ,m a te ria l ,te xtile a nd m ilita ry a re a s.U s ing p ro 2ka ryo tic o r e uka ryo ti c e xp re s s ion s ys tem to e xp re s s sp id e r s il k p ro te i n c a n yi e l d la rg e q ua n tity of sp id e r s il k .Th i s p ap e r re view e d the s truc tu ra l c ha ra c te ri s tic s of sp i d e r s ilk p ro te in a nd the p rog re s s of sp i d e r s ilk e xp re s 2s ion s tra te g i e s in E .c o li ,ye a s t,p la n ts,a n i m a l c e lls a nd s ilkw o r m e xp re s s ion s ys tem ,a nd foc us e d on the new i d e a s of sp id e r s il k e xp re s s ion s tra te g y i n the s ilkw o r m e xp re s s ion s ys tem.Th is c a n p rovi d e a re fe re nc e fo r fu 2tu re la rg e 2s c a l e p rod uc tion of sp i d e r s ilk p ro te ins. Ke y w o rd s Sp id e r s il k;M e c ha n i c a l p rop e rty;Exp re s s i on s tra te g y;S ilkw o r m e xp re s s ion s ys tem 蜘蛛(A raneida )属节肢动物门(A rthr opoda )蛛 形纲(A rachnida )蛛形目(A raneida 或A raneae )。自然选择使蜘蛛终生分泌蜘蛛丝。大量研究表明,蜘蛛丝是自然界力学性能最优良的天然蛋白纤维之 一,具有的高强度、高弹性和高断裂能等性能是其它人造纤维材料所无法比拟的 [1-2] 。蜘蛛分泌的蜘蛛 丝主要包括蜘蛛网中放射状的拖牵丝、螺旋状的横丝、捕食时缠绕食物的包扎丝以及用于制作卵囊保 护后代的卵囊丝等[3] 。其中,拖牵丝(dragline silk )的机械性能特别优异:其断裂能是同样粗度钢铁纤维的5～10倍,与制作防弹背心的凯夫拉尔芳香族纤维断裂强度相当,约4×109 Pa;其断裂伸长率达35%,而凯夫拉尔芳香族纤维的断裂伸长率仅为5% [4] 。蜘蛛丝具有的优异性能已被广泛应用:在 医疗方面,可制成人工关节、韧带、肌腱和可降解手术缝合线等;在军事装备方面,非常适合制造武器装 586
重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的
高中组11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①抗增生
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta (DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫