免疫透射比浊法
一、原理
当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick 等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。在介质溶液中，抗原与特异性抗体在一定条件下才能形成复合物，一定的条件包括：①对抗体的要求，作为体液或组织中蛋白质种类很多，若要快速特异检测，要求有单价特异抗体才能与抗原形成复合物。某一种蛋白质，有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（见图18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH为6.5～8.0之间为宜。载脂蛋白有形成两性螺旋片（amphipathic helix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。
图18-4 抗原抗体反应曲线
在免疫比浊过程中，由于抗原抗体结合的三过程，从而导致光密度与浓度之间不呈线性关系，一般是3次方程曲线关系。若将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经过3次方程拟合成近似直线化的曲线方程，再进行运算，免疫比浊中，采用终点法或速率法，用5个或7个不同梯度进行定标，经3次曲线方程求出一条能反映真实情况的浓度与光密度的关系曲线方程，才能作为定量的工作曲线。
二、血清ApoAⅠ（B100）透射比浊测定法
脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒，分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B100）的定量测定。
（一）手工操作
1．原理
血清ApoAⅠ（B100）+抗人ApoAⅠ（B100）→抗原抗体复合物→测定光密度
2．试剂（伊利康）
（1）Apo缓冲液（RⅠ），含4%PEG6000和表面活性剂
（2）羊抗人ApoAⅠ（B100）抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，待用，置冰箱一周内有效。
（3）ApoAⅠ（B100）参考血清（RⅢ）
3．操作
（1）按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl，加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂（Apo抗体液）。最好临用前配制当天用量。
（2）各试剂用量如下表
ApoAⅠApoB100
标准管测定管空白管标准管测定管空白管
参考血清5μl5μl
待测血清5μl5μl
ApoAⅠ抗体液 1.0ml 1.0ml 1.0ml
ApoB100抗体液 1.0ml 1.0ml 1.0ml 混匀各管，37℃保温10min，波长340min，于半自动分析仪上先吸入空白管液，再吸入标准管，仪器根据光密度及参考值得出一换算系数，再吸入测定管，仪器内根据光密度及系数进行运算，打印结果。
（3）定标方法，根据免疫比浊法原理，应取多点（3～9点），按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回归曲线进行定标，制作参考工作曲线。
①校正工作曲线的绘制：
配制抗血清稀释工作液：按RⅠ试剂0.9ml，加RⅡ试剂100μl的比例（Apo抗体液）混匀，待用。
制备5点校正液：取RⅢ（参考血清），用0.9%生理盐水倍比稀释成5个浓度，第5管为原参考血清浓度，其他4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或浓度为0即0.9%NaCl）。
表18-20 标准曲线制备的各管（点）浓度
管号 1 2 3 4 5
1号管（0）（μl） 5
2号管（1/8）（μl） 5
3号管（1/4）（μl） 5
4号管（1/2）（μl） 5
5号管（1/1）（μl） 5
Apo抗体液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀各管，置37℃水浴保温10min，按程序上机作工作曲线。
②标本测定：吸待测血清（测定管）5μl，加上述稀释抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保温10min，
上机读数，打印结果。
③如测定值超过工作曲线上限值，仪器会打印显示“过高”，此时，将待测标本稀释1倍再测。
④每批号的抗血清应作一次多点定标，即测定标本的抗血清应与定标的抗血清是同一批号抗血清。
（二）生化分析仪测定
1．原理
脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B100）的定量测定。
ApoAⅠ（B100）+抗人ApoAⅠ（B100）→抗原抗体复合物→测定吸光光密度
2．双试剂单（双）波长法
（1）试剂（温州伊利康）
RⅠ：Apo缓冲液，含4% PEG6000和表面活性。
RⅡ：羊抗人ApoA（B100）稀释抗血清
RⅢ：Apo定值血清
（2）各试剂及标本用量如下表：
项目血清
Apo缓冲液
（RⅠ）ApoAⅠ抗血清液
（RⅡ）
ApoB100抗血清液
（RⅡ）
ApoAⅠ2～5μl300～350μl80～100μl
ApoB1002～5μl300～350μl80-100μl （3）定标：以5点Apo梯度浓度，采用免疫定标法按表18-21参数上机定标，如图18-5所示。
图18-5 ApoAⅠ五点免疫定标曲线图（以CL-7200仪器为例）
（4）上机（终点法或两点法）
（5）说明：①Apo测定的光密度从340～700nm范围都可采用，多用340nm；②国内已有的Apo试剂盒均无需处理；③血清标本也无需处理，均可直接检测；④本法适用于多种类型的全自动生化分析仪检测，自动扣除空白，快速准确；⑤效价不同的抗血清，其用量应作适当的调整。
(5)计算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定标自动运算。
3.单一试剂单波长法
(1)试剂同双试剂法
(2)标本及试剂用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相应的Apo缓冲液(RⅠ)0.3m l的比例混合成单一试剂(Apo抗体液)。最好临用前配制当天用量,此抗体液置2～8℃保存一周有效。
（3）定标：按五点梯度稀释定值血清（见表18-21），以终点法或两点法进行免疫定标。
（4）按以下步骤操作：
（5）以△A=A2-A1值按免疫定标自动运算。
（6）说明：①该法一般用半自动生化分析仪；②通过设延迟时间以扣除空白；③RⅠ、RⅡ试剂以临用时混合为好，未用完的混合试剂应置于2～8℃冰箱保存，只允许使用一周；④血清标本无需再处理。
4.ApoAⅠ、AⅡ、B、CⅡ、CⅢ和E的全自动生化分析仪检测的有关数据。
（1）上机参数（以CL-7200型为例）如表18-21所示。
表18-21 自动生化分析仪检测Apo有关参数
ApoAⅠAⅡ B CⅡCⅢ E
反应类型终点法
样品量3μl3μl3μl8μl3μl5μl
600nm（第一）数据数据700nm 700nm 700nm
测量波长
700nm（第二）数据数据340nm 340nm 340nm
第一波长5min 数据数据数据数据数据
反应时间
第二波长4.99min 数据数据数据数据数据
试剂Ⅰ350μl290μl350μl300μl290μl350μl
试剂Ⅱ100μl75μl100μl50μl75μl50μl
单位g/L g/L g/L mg/dl mg/dl mg/dl
标准浓度点数 5 5 5 5 5 5
（2）标准曲线制备参数如表18-22所示。
表18-22 生化分析仪检测Apo的定标浓度
标准管号 1 2 3 4 5 6
稀释倍数0 1：2 1：4 1：8 1：16 0
ApoAⅠ度数(g/L) 172 86 43 21.5 10.8 0
ApoAⅡ度数(g/L) 36 18 9 4.5 2.25 0
ApoB浓度(g/L) 180 91 45.5 22.6 11.3 0
ApoCⅡ浓度(mg/dl) 4 2 1 0.5 0.25 0
ApoCⅢ浓度(mg/dl) 5 2.5 1.25 0.63 0.31 0
ApoE浓度(mg/dl) 10 5 2.5 1.25 0.625 0 5．单一试剂和双试剂检测方法的比较
单一试剂和双试剂在全自动生化分析仪测定的光密度变化过程，如图18-6所示。
从理论上考虑任何一种生化测定方法的试剂，临用时混合最好，可以消除试剂各种成份的自身化学变化和相互影响。而在实际工作中，是不可能的，只能是将几种不会起化学反应而又无相互影响的试剂配制成2～4种，临用时按一定比例配制使用。临床化学试剂盒，目前主要以1或2种试剂形式供医学检验使用，即单一试剂和双试剂两种形式。
笔者认为双试剂比单一试剂好，尤其是含酶试剂和免疫试剂以双试剂包装形式为好，有利于对酶的活性或抗体效价的保存。单一试剂是所有试剂混合在一起，存放过程中，有可能因化学物质的存在而损害试剂中的工具酶或抗体，存放时间越长，损害可能性越大，然而双试剂不存在这一问题。
对脂质的测定双试剂法更显其优越性，因为血清中脂质与载脂蛋白是以脂蛋白的形式存在，当测定试剂与血清标本混合后，首先解联脂蛋白，让其释放出脂质和载脂蛋白，。作为免疫测定试剂还兼有使载脂蛋白抗原决定簇暴露的作用。当R1试剂作用完后，加进第二试剂（R2）后，使其抗体适应抗原决定簇的要求，达到抗原抗体结构呈完全的互补状态，从而产生最大的抗原抗体结合量，达到定量的目的。双试剂测定法，既能自动扣去空白，又能使化学反应快速进行，从而迅速地完成检测的全过程。
图18-6 单双试剂法反应过程的光密度变化曲线图
A：双试管法；B：为单一试剂法
（贺小玲胡汉宁）
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纤维蛋白（原）降解产物测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法） 主要生产工艺及反应体系的研究 一、实验目的 研究合适的纤维蛋白（原）降解产物的生产工艺和最佳反应体系。二、实验设计思想 纤维蛋白（原）降解产物测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）原理是样本中的FDP抗原与试剂中的抗体结合，形成抗原抗体复合物，产生吸光度变化，胶乳试剂可特异性的增大该吸光度的变化，增大试剂的灵敏度。该吸光度变化的高低与样本中的FDP的含量成正比，测定该吸光度，采用与校准品比较，即能得出样本FDP的含量。 三、主要仪器及试剂材料 1.D240全自动生化分析仪/雷杜420全自动生化分析仪 生产商:南京神州英诺华医疗科技有限公司/深圳雷杜生命科学股份有限公司 2.纤维蛋白（原）降解产物校准品 FDP含量：84μg/mL 生产商：上海捷门生物技术合作公司 批号：S2814-1 四、实验内容及程序 纤维蛋白（原）降解产物测定试剂盒主要生产工艺过程的研制及试剂盒反应体系的建立分为三个部分：生产工艺的研制、试剂盒组成的研制、试剂盒反应体系的建立。 产品拟定标准： 线性范围：在拟定线性范围内，相关系数r≥0.99； 准确度：测定已知溯源的FDP质控品，相对偏差（Bias%）≤±25%； 灵敏度：测定已知溯源的FDP质控品12次，结果CV≤20%； 精密度：测定已知溯源的FDP质控品20次，结果CV≤15%。 1.主要工艺描述
1.1原液的准备 购进商品化的高效价纤维蛋白（原）降解产物抗体致敏胶乳，将其稀释成合适的倍数，作为试剂2备用。选择合适的缓冲体系，加入一定量的增浊剂和稳定剂作为试剂1备用。 1.2原液的验证 购进有溯源的定值校准品，在生化分析仪上，将适量的校准品加入试剂1中，在适宜的条件下，和试剂2反应，根据校准品浓度和吸光度做剂量/响应曲线，得出一条持续上升的平滑曲线，即得到合格的原液。 2.反应体系的组成及其研究 2.1购进有溯源并标示有定值的校准品； FDP含量：84μg/ml 生产商：上海捷门生物技术合作有限公司 批号：? 2.2致敏胶乳的准备 抗体致敏胶乳：上海捷门生物技术合作有限公司提供 用实验室PBS缓冲液（0.1mol/L，PH=7.4）将其倍半稀释，分别稀释成：3.5倍、3倍2.5倍、2倍、1.5倍。用上述已准备好的不同稀释倍数FDP抗体致敏胶乳和稀释好的校准品在生化仪上进行操作。 2.2.1实验方法 2.2.2实验结果
甘胆酸测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人血清中甘胆酸的含量。 1.1规格 校准品(选配)：1×1mL； 质控品(选配)：1×1mL。 1.2组成
注：校准品靶值、质控品质控范围详见包装标签。 2.1 外观 2.1.1试剂1：无色至淡黄色液体，无浑浊，无未溶解物。 2.1.2试剂2：乳白色液体。 2.1.3校准品：无色至淡黄色液体。 2.1.4质控品：无色至淡黄色液体。 2.1.5包装外观应整洁，标签字迹清晰，不易脱落。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不低于标示体积。 2.3 试剂空白吸光度 试剂空白吸光度≤1.5。 2.4 分析灵敏度 样本浓度为20 mg/L时，△A≥0.003。
2.5 线性区间 在[0.7，80] mg/L范围内，线性相关系数r≥0.990；测试浓度在[0.7，10] mg/L时，绝对偏差不超过±1.0 mg/L，测试浓度在（10，80] mg/L时，相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1 批內精密度 用高、低2个浓度的样本测试试剂盒，各重复测试10次，其变异系数（CV）应不大于10%。 2.6.2批间差 用样本分别测试3个不同批次的试剂盒，每个批次测试3次，其相对极差（R）应不大于10%。 2.7 准确度 回收率在85%-115%范围内。 2.8 质控品赋值有效性 检测结果在质控范围内。 2.9 瓶内均匀性 校准品和质控品瓶内均匀性（CV）应不大于10%。 2.10 量值溯源 校准品量值溯源至公司内部工作校准品，并与北京世纪沃德生物科技有限公司生产的甘胆酸测试试剂盒（胶乳免疫比浊法）比对验证。 2.11 稳定性 2.11.1校准品开瓶稳定性
免疫透射比浊法 一、原理 当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick 等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。在介质溶液中，抗原与特异性抗体在一定条件下才能形成复合物，一定的条件包括：①对抗体的要求，作为体液或组织中蛋白质种类很多，若要快速特异检测，要求有单价特异抗体才能与抗原形成复合物。某一种蛋白质，有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（见图18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH为6.5～8.0之间为宜。载脂蛋白有形成两性螺旋片（amphipathic helix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。
胶乳增强免疫比浊反应原理： 免疫比浊反应原理： 当样本中的待测抗原与试剂中的特异性多克隆抗体相遇后，即可发生特异性的结合反应（一个抗原具有多个不同的抗原决定簇（反应位点），可以连接多个不同的对应位点抗体；而抗体具有两个相同的抗原结合位点，可以同时结合两个待测抗原；），从而形成网状的抗原-抗体分子复合物，引起溶液中浊度的变化，通过测试溶液中透射或散射的吸光度变化，从而确定样本中待测抗原的浓度； 胶乳增强免疫反应比浊原理： 基于免疫反应原理，和纳米颗粒的特殊效应（表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应），不只可以检测样本中的完全抗原，也可以检测样本中的半抗原、抗体，从而引起浊度变化，此时浊度与空白样本的不同作为待测物浓度的检测依据。 免疫透射比浊法 原理： 可溶性抗原与相应抗体反应后形成的免疫复物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下，吸光度（A 值）与免疫复合物量呈正相关。透射光强度和形成的免疫复合物呈反比。 优点：透射比浊法灵敏度比单扩高5-10倍，重复性好，结果准确，操作简便，且能用全自动或半全自动生化分析仪进行检测。 不足： ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原-抗体复合物分子应足够大（35-100nm)，分子太小则阻挡不了光线的通过；数量要足够多，如果数量太少，则溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。灵敏度较散射比浊法低； ③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段，需在抗原抗体反应达到平衡后进行检测，耗时较长。 胶乳增强免疫比浊法 在一般的透射比浊法中，少量小分子免疫复合物极难形成浊度，要形成较大的免疫复合物，参与反应的抗原、抗体量应较大（浓度高），这无法满足高灵敏度检测项目的要求。胶乳增
铁蛋白（FER）测定试剂盒（胶乳免疫比浊法） 适用范围：用于体外定量测定人体血清中的铁蛋白的含量。 1.1试剂盒包装规格 试剂1：1×20ml，试剂2：1×10ml；试剂1：2×36ml，试剂2：2×18ml； 试剂1：1×400ml，试剂2：1×200ml。 校准品（可选）：4×0.5ml（四水平），4×1ml（四水平）。 1.2试剂盒主要组成成分
2.1 外观 液体双试剂：试剂1无色澄清液体；试剂2 乳白色悬浊液。 校准品：浅黄至棕红色液体。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不得低于标示体积。 2.3 试剂空白吸光度 在37℃、660nm波长、1cm光径条件下，试剂空白吸光度应不大于2.0。 2.4 分析灵敏度 测定浓度为400ng/ml样本时，吸光度变化绝对值（|ΔA|）应不小于0.03。2.5 线性范围 在（6，450）ng/ml范围内，线性相关系数r不小于0.996，在（50，450）ng/ml 区间内线性相对偏差不大于±15%，（6，50]ng/ml区间内线性绝对偏差不大于±7.5ng/ml。 2.6 重复性 重复测试两份高低浓度的样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于8%。 2.7 批间差 不同批号试剂测试同一份样本，测定结果的批间相对极差应不大于10%。 2.8 准确度 相对偏差：相对偏差应不超过±10%。 2.9 校准品溯源性 依据GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，校准品溯源至NIBSC生产的有证参考物质（WHO 94/572）。
2.10 稳定性 效期稳定性：试剂盒在2℃～8℃下有效期为12个月。取失效期的试剂盒进行检测试验结果满足2.3、2.4、2.5、2.6、2.8的要求。
胶乳免疫比浊法相关知识 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅： 胶乳微球物理吸附： 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1.用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2.用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3.将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4.离心或超滤，除去未结合蛋白； 5.将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1.最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加； 2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2.胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3.储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法： 一、一步法 1.准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2.用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3.用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4.边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5.准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6.将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7.室温下，立即调节pH (Note 7). 8.移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。
类风湿因子测定试剂盒(胶乳免疫比浊法) 适用范围：用于体外定量测定人血清中类风湿因子的含量。 1.1 包装规格 表1 包装规格 试剂1：3×20mL、试剂2：1×20mL 试剂1：1×60mL、试剂2：1×20mL 试剂1：8×3.8mL、试剂2：4×2.6mL 试剂1：2×15mL、试剂2：1×10mL 试剂1：6×50mL、试剂2：2×50mL 试剂1：12×4.2mL、试剂2：6×2.9mL 试剂1：1×45mL、试剂2：1×15mL 试剂1：1×15mL、试剂2：1×5mL 320测试/盒（试剂1：3×20mL、试剂2：1×20mL） 400测试/盒（试剂1：3×20mL、试剂2：1×20mL） 480测试/盒（试剂1：3×20mL、试剂2：1×20mL）校准品（液体，4水平或5水平）：4×1mL；5×1mL；5×2mL 质控品（液体，水平1）：1×3mL；1×1mL 质控品（液体，水平2）：1×3mL；1×1mL 1.2 主要组成成分 表2 主要组成成分 试剂成分浓度试剂1： 氨基乙酸缓冲液 0.17mol/L 试剂2： 乳胶颗粒超敏化的变性IgG悬浮液 0.17%（w/v） 校准品（液体）：人血清基质 类风湿因子 ≥10% 4水平： 水平1：0～20 IU/mL
水平2：20～60 IU/mL 水平3：50～100 IU/mL 水平4：100～140 IU/mL 5水平： 水平1：0～15 IU/mL 水平2：15～30 IU/mL 水平3：30～60 IU/mL 水平4：60～100 IU/mL 水平5：100～140 IU/mL 质控品（液体）：人血清基质 类风湿因子 ≥10% 水平1： 10～30 IU/mL 水平2： 25～50 IU/mL 试剂中含有防腐剂。 2.1 外观 试剂1为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂2为乳白色液体，目测不得有任何沉淀； 校准品为无色或淡黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 质控品为无色或淡黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。 2.2试剂的净含量应不少于表1中的标称量。 2.3 测定项目 2.3.1 试剂空白吸光度 试剂空白：A570nm下测定空白吸光度应≤ 1.0000。 2.3.2 准确度 用国际标准物质NIBSC/W1066，对试剂盒进行测试，其测量结果的相对偏差应不超过±15%。 2.3.3 分析灵敏度 样本浓度为40.0 IU/mL时，其吸光度变化在0.0100～0.1000之间。 2.3.4 线性区间
免疫比浊法检测免疫球蛋白 一、实验目的 利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。（本小组检测的为IgG样品） 二、实验原理 1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。 2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。 分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。 本实验采用透射法。 3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。 三、实验材料 免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组） 免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管） 微量加样枪、ep管（1.5mL离心管） 酶标仪、水浴箱 四、实验步骤 1.在7个EP管中各加250μL IgG试剂1（PEG）。 2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。 3.混匀后37℃水浴5min。 4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。 5.混匀后37℃水浴10min。 6.分别吸取200μL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。 五、实验结果与数据处理 2.标准曲线
免疫比浊法和免疫投射比浊法 1.定义： （1）免疫比浊法：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。 （2）免疫投射比浊法：当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒 的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。一般 采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。2.原理 （1）免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规 定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促 聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使 反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的 量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增 加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算 出检样中抗原的含量。 （2）免疫透射比浊法是抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免 疫复合物吸收。免疫复合物量越多，光线吸收越多。光线被 吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。利用比浊
计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。 3.关系 4．免疫比浊法适用的仪器 紫外可见分光光度计 全自动生化仪 全自动生化仪常见的检测方法 终点法 连续检测法 比浊法 均相酶免疫分析
本试剂盒用于体外定量测定人血清或血浆类风湿因子。 【产品信息】 货号试剂盒规格 170229910021 试剂1 5×25ml＋试剂2 1×25ml 170229910730 试剂1 4×20ml＋试剂2 2×8ml 170209910059 5×1ml TruCal RF (类风湿因子校准品) 5个不同浓度水平的校准品 【摘要】 类风湿因子(RF)是一类自身抗体，包括所有类型的免疫球蛋白。它们是抗变性或聚合IgG分子Fc片段的抗体[1]。诊断所检测的RF主要是IgM类RF，用来检出各种类风湿疾病，是炎症的起源[2]。 大约70％～80%的类风湿性关节炎(RA)患者RF为阳性，但是并不特异，因为RF浓度的升高还出现在非类风湿疾病中。在无RA临床症状的高龄人群中，阳性率达到大约10%[3]。检测RF为鉴别诊断风湿疾病提供了重要的信息[4]。另外，RA中的高浓度RF值常和疾病的进行性临床发展有关。但是RF的阳性结果必须结合临床或其他检验结果予以证实。 【方法】 免疫透射比浊终点测定法。 【原理】 使用热聚合IgG和样品中的类风湿因子进行抗原-抗体反应，形成抗原-抗体复合物，进行透射比浊终点测定。 【试剂】 在测定时的各组分和浓度 试剂1（R1）： 磷酸缓冲液pH 7.4 40 mmol/L 试剂2（R2）： 热聚合人IgG 适量 试剂稳定性与贮存 试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂不可冰冻！ 注意事项 1. 试剂中含叠氮钠（0.95g/L），不可入口，避免接触皮肤及粘膜。 2. 应采取必要的预防措施使用试剂。 废液处理 参照各地方法规要求。 试剂准备 试剂为即用式。 未提供的实验所需物品 9 g/L氯化钠溶液 一般的实验室仪器设备 【标本】 血清，肝素或EDTA血浆。不要使用含氟化钠的血样收集瓶。稳定性：20-25℃保存可稳定1天 2-8℃保存可稳定3天 -20℃保存可稳定4周 不可使用已被污染的标本。 【测定程序】 若需要自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。 测定条件 波长340 nm，Hg 334nm 比色杯光径 1.0 cm 温度37℃ 分析类型终点法 检测扣除试剂空白 操作步骤 R1（试剂1） R2（试剂2） A1，然后加R2: 50 μl : 15 μl 〃R1: 250 μl ΔA=[(A2－A1) 校准品管或样品管] – [(A2－A1)空白管] 【计算】 按照公司配套校准品使用要求，用5个不同水平的校准液，连同9g/L氯化钠溶液为空白。经测定后，由仪器自动对校准品响应量通过合适的数学模型如Logit/Log，拟合成校准曲线，校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果。 校准稳定期：4周 【校准品和控制品】 建议使用DiaSys公司提供的TruCal RF 校准品系列对自动分析仪进行校准。 每批样品检测时，建议使用DiaSys公司提供的TruLab 【性能特性】 病人结果可报告范围 本公司对内含RF浓度水平低于某商品化试剂检测限的10份血清进行了检测，这10份血清的检测均值为5 IU/ml，均值加3倍标准差为12 IU/ml，因此认为只有当样品中RF浓度≥ 12 IU/ml时，本试剂才可以将其和不含RF的样品加以区分。 本法对RF的检测上限为700 IU/ml。当样品测定值超过上限时，应将样品用9 g/L氯化钠溶液作1+ 1稀释，重新测定，结果乘以2。 前带限制 血清RF值≤ 3000 IU/ml时，没有观察到前带效应。 特异性/干扰 当样品中抗坏血酸浓度≤1704 μmol/L，胆红素浓度≤684 μmol/L，血红蛋白浓度≤ 5 g/L，甘油三酯浓度≤22.6 mmol/L时没有观察到干扰。 灵敏度/检测限 记录吸光度A2 1
附件 5 胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法） 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导技术审评部门对胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的技术审评工作，同时也为注册申请人注册 申报资料的准备及撰写提供参考。 本指导原则是对胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适 用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验 证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）是指基于透射 免疫比浊法原理，利用半自动生化分析仪、全自动生化分析仪对人血清、血浆中的胱抑素C进行体外定量分析的试剂。 目前胱抑素C含量的测定方法主要是基于抗原抗体反应的 — 1 ——
免疫方法，如胶乳免疫比浊法、胶体金免疫比色法、单向免疫扩散法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法等， 免疫比浊法可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法。其中透射免疫比浊法可适用于半自动生化分析仪、全自动生化分析仪，散射免疫比浊法需特定蛋白分析仪。 从方法学上讲，本指导原则仅适用于胶乳透射免疫比浊法,不适用于散射免疫比浊法。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管 理总局令第5号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂 分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），胱抑素C测定试剂（免疫比浊法）管理类别为二类，分类代号为6840。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、 生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等 内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资 料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总 局公告2014年第44号）的相关要求。相关描述应至少包含如 下内容： 1.产品预期用途及辅助诊断的临床适应证背景情况 （1）胱抑素C的生物学特征、结构与功能、在体内正常和 病理状态下的代谢途径和存在形式。 胱抑素C（Cystatin C, CysC）是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ—微量蛋白及γ—后球蛋白，广泛存在于各种组织的—— 2 —
α1-微球蛋白测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人血清中α1-微球蛋白的含量。 1.1 规格 校准品(选配)：1×1mL； 质控品(选配)：水平1：1×1mL，水平2：1×1mL。 1.2 组成：
注：校准品靶值、质控品质控范围详见包装标签。 2.1 外观 2.1.1试剂1：无色液体，无浑浊，无不溶物。 2.1.2试剂2：乳白色液体。 2.1.3校准品：冻干粉，复溶后为无色至淡黄色液体，无可见不溶物。 2.1.4质控品：冻干粉，复溶后为无色至淡黄色液体，无可见不溶物。
2.1.5包装外观应整洁，标签字迹清晰，不易脱落。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不低于标示体积。 2.3 试剂空白吸光度 试剂空白吸光度≤1.2。 2.4 分析灵敏度 样本浓度为30mg/L时，吸光度差值应≥0.008。 2.5 线性 在[10，110] mg/L的范围内，线性相关系数r≥0.990。测试浓度在[10，30] mg/L 时，绝对偏差应不超过±3 mg/L；测试浓度在（30，110] mg/L 时，相对偏差应不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1重复性 用高、低2个浓度的样本测试试剂盒，各重复测试10次，其变异系数（CV）应不大于10%。 2.6.2批间差 用样本分别测试3个不同批次的试剂盒，每个批次测试3次，其相对极差（R）应不大于10%。 2.7 准确度 与已上市产品进行对比试验，在[10，110] mg/L的范围内，线性相关系数r≥0.975。测试浓度在[10，30] mg/L 时，绝对偏差应不超过±3 mg/L；测试浓度在（30，110] mg/L时，相对偏差应不超过±10%。
免疫比浊胶乳颗粒使 用
胶乳微球使用中常见问题及解答 问：产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗？ 答：产品说明书中给出的胶乳粒径（Diameter）是平均粒径。 问：如何选择胶乳微球的粒径？ 答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。 问：一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少？ 答：整个测定体系中，微球的浓度大约在 0.01%左右，当然这与试剂本身规定的线性有关系。 问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？ 答：需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关，一般 70nm 左右的微球大概13000g/min 30min 以上，粒径越小所需时间越长，离心力越大。 问：蛋白（抗体）与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以 10-20 分钟为宜，长时间的活化反而会降低偶联效率。 问：由于抗体不只是 FC 的氨基酸上有 NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA 活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？答：事实的确如此，当然由于抗体的空间折叠方式和 FC 端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在 Fc 端，对抗体与抗原的结合的影响不大。 问：胶乳微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？如何控制和避免？ 答：这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻断剂解决,常见的是 BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。 3、胶乳的自凝现象如何控制和避免？ 答：胶乳自凝与许多因素有关，如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平，使得表面的价负荷被掩蔽，胶乳微球之间发生接触，于是便产生凝集，故高离子强度的缓冲溶液不应使用，缓冲溶液的的浓度不要超过 50mM，但有些 CML 胶乳微球具有高电荷密度，则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球，不能使用阳电荷的缓冲溶液如 Tris 缓冲溶液，因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时，悬浮
附件5 胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法） 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导技术审评部门对胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的技术审评工作，同时也为注册申请人注册申报资料的准备及撰写提供参考。 本指导原则是对胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 胱抑素C测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）是指基于透射免疫比浊法原理，利用半自动生化分析仪、全自动生化分析仪对人血清、血浆中的胱抑素C进行体外定量分析的试剂。 目前胱抑素C含量的测定方法主要是基于抗原抗体反应的 —1 —
免疫方法，如胶乳免疫比浊法、胶体金免疫比色法、单向免疫扩散法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法等，免疫比浊法可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法。其中透射免疫比浊法可适用于半自动生化分析仪、全自动生化分析仪，散射免疫比浊法需特定蛋白分析仪。 从方法学上讲，本指导原则仅适用于胶乳透射免疫比浊法,不适用于散射免疫比浊法。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），胱抑素C测定试剂（免疫比浊法）管理类别为二类，分类代号为6840。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。相关描述应至少包含如下内容： 1.产品预期用途及辅助诊断的临床适应证背景情况 （1）胱抑素C的生物学特征、结构与功能、在体内正常和病理状态下的代谢途径和存在形式。 胱抑素C（Cystatin C, CysC）是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ—微量蛋白及γ—后球蛋白，广泛存在于各种组织的—2 —
胶乳增强免疫比浊法检测血清脂蛋白脂肪酶的研究 Tetsuo Machida等日本群马大学医学研究院临床医学实验部 摘要 背景脂蛋白脂肪酶（LPL）通过催化甘油三酯的水解在富含甘油三酯的脂蛋白代谢中起关键作用。血清脂蛋白脂肪酶的含量测定有利于脂类代谢紊乱的诊断，但目前在临床上没有快速测定LPL的方法。 方法使用胶乳颗粒固定化的LPL单克隆抗体，我们探索了一种快速灵敏的胶乳增强免疫比浊法（LTIA）测定LPL的方法。实验使用生化分析仪器日立7700P进行检测，同时进行了ELISA平行实验来评价实验数据的可靠性。 结果通过稀释实验得到0.5-800ng/ml的校准曲线。批内变异系数被控制在2.2-2.5%。含有潜在干扰物质胆红素F和C以及血红素、甘油三酯、类风湿因子的样本未观察到干扰性。LTIA与ELISA的结果具有很好的相关性（n=40，r=0.967，y=0.99x-1.86）。肝素处理前的血清LPL正常参考范围值为50-77 ng/ml，肝素处理后血浆LPL正常参考范围值为354-410 ng/ml。 结论本文LTIA法既可用于测定肝素处理前的血清LPL值，也可用于测定肝素处理后血浆LPL值。本方法与ELISA相比更为方便快捷，非常适合用于临床常规检查。 1前言 LPL在脂类与脂蛋白的转运和代谢中发挥关键性作用[1，2]，此酶负责乳糜内甘油三酯（TG）和极低密度脂蛋白(VLDL)的水解，分别形成乳糜和极低密度脂蛋白的残渣。血浆中LPL的常规检测方法是在静脉注射肝素后进行ELISA实验测定其活性和浓度。据报道在肝素处理前血清LPL具有比较高的浓度（大约30-100ng/ml），但LPL活性无法检测到，表明大部分循环LPL没有催化活性，只是其受体的配体[3,6]。 肝素处理后血浆LPL的浓度与活性的测定已被用于临床LPL缺失的诊断[2]，但通常不能用于脂类代谢紊乱或心血管疾病风险性的诊断。这是因为肝素的注射使LPL从血管内皮细胞分离出来，因此检测结果不能直接反映循环LPL的生理或病理浓度。 Brunzell等[7]和Ikeda等[8]等此前报道了运用特异性单克隆抗体的LPL-ELISA检测人血浆LPL的方法，在检测前需要给病人静脉注射肝素。从检测时间和操作步骤角度考虑，ELISA法不适合在临床实验室进行大规模的常规检查。 因此，仍需要一种可靠、快速的自动化检测LPL的方法，且具有高灵敏度和校准稳定性，尤其是在肝素处理前血清LPL浓度的测定可能具有临床参考价值的情况下。在过去数十年间Shirai及其同事以 LPL-ELISA法检测了肝素处理前血清LPL的浓度，揭示了肝素处理前血清LPL浓度在心血管疾病和糖尿病中的临床意义[9-16]。 我们近期通过比对研究发现肝素处理前血清中LPL的浓度与肝素处理后的血浆中LPL的浓度可以替换[17]。肝素处理前血清中LPL浓度的测定可以使用自动分析仪检测，不需要提前为病人注射肝素，在高甘油三酯病人的临床诊断方面的应用更具有可操作性。由于肝素处理前血清中LPL的浓度足以用胶乳检测系统测定，我们使用胶乳颗粒固定化的LPL单克隆抗体，研究出了一种快速灵敏的胶乳增强免疫比浊法（LTIA）测定LPL的方法。我们所使用的全自动生化分析仪是日立7700P。我们以本方法和已商业化的ELISA试剂[18]对肝素注射（或未注射的）正常志愿者进行了检测，并将两种方法的检测结果做了相应比较。 2材料与方法 2.1试剂 聚苯乙烯胶乳颗粒购买自日本腾仓公司，胎牛血清白蛋白购买自Sigma公司。干扰性试剂血红素、甘油三酯、类风湿因子和胆红素F、C购买自日本希森美康公司。所有化学药品或试剂均是最高纯度级别。 2.2血液样品制备
胶乳颗粒增强比浊法浅谈 目前，体液标志蛋白的检测方法主要采用免疫学方法，以酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA）、放射免疫测定（Radioimmunoassay，RIA）和胶体金层析法（俗称“金标”）这几种方法为主。ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。RIA灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。金标方法虽然稳定性较好，但灵敏度较低，只能定性，不能定量。特别是重复性差这一缺点限制了这些检测技术在临床上的应用，尤其不适合用于需要通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。因此，寻找更加稳定、准确的血浆蛋白定量检测方法一直是国际上近十年来的研究热点。 胶乳颗粒增强比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。
免疫比浊法检测免疫球蛋白 时间：地点：实验人： 1基本原理： 样本中的IgA、IgG与试剂中的抗IgA和抗IgG的特异性抗体结合，产生不溶性免疫复合物，使得反应溶液产生浊度。溶液浊度与样本中IgA、IgG的浓度成正比。在合适的nm处（700nm）测吸光度，通过计算可以得到IgA、IgG的浓度。 2实验材料： 免疫球蛋白A、G（IgA、IgG）测定试剂（试剂1、试剂2） 免疫球蛋白A、G（IgA、IgG）校准品 蒸馏水、血清样本 微量加样枪、ep管（1.5ml离心管） 酶标仪、水浴箱 3实验方法步骤 在酶标管内反应。 从左到右共做6管试剂： 1：IgG试剂1（125μl）+蒸馏水1μl 2：IgG试剂1（125μl）+校准品1μl 3：IgG试剂1（125μl）+样本1μl 4：IgA试剂1（150μl）+蒸馏水3μl 5：IgA试剂1（150μl）+校准品3μl 6：IgA试剂1（150μl）+样本3μl 混匀，37度水浴五分钟。 继续添加试剂，从左到右： 1、2、3：IgG试剂2（42.5μl） 4、5、6：IgA试剂2（50μl） 混匀，37度水浴五分钟。 在OD700nm测取吸光度，记录数据。 4.实验结果： 4.1 IgG蛋白： 空白管吸光度0.051 校准管吸光度1.155 样本管吸光度0.699 IgG校准浓度31.3g/L 待测血清样本中免疫球蛋白含量IgG浓度（g/L）= 0.699-0.051/1.155-0.051 ×31.3=18.4g/L 实验结果偏高，且误差为（18.4-16.0）/16.0 ×100% =15.0% 4.2 IgA蛋白： 空白管吸光度0.049 校准管吸光度0.372 样本管吸光度0.212 IgA校准浓度4.15g/L 待测血清样本中免疫球蛋白含量IgA浓度（g/L）=0.212-0.049/0.372-0.049
髓过氧化物酶测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人血清中髓过氧化物酶的含量。 1.1规格 校准品(选配)：1×1mL； 质控品(选配)：水平1：1×1mL，水平2：1×1mL。 1.2组成
注：校准品靶值、质控品质控范围详见包装标签。 2.1 外观 2.1.1试剂1：无色至淡黄色液体。 2.1.2试剂2：乳白色液体。 2.1.3校准品：无色至淡黄色液体。 2.1.4质控品：无色或淡黄色液体。 2.1.5包装外观应整洁，标签字迹清晰，不易脱落。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不低于标示体积。 2.3 试剂空白吸光度 试剂空白吸光度≤2.0。 2.4 分析灵敏度 样本浓度为120 ng/mL时，△A≥0.01。 2.5 线性区间
在[25，1300] ng/mL范围内，线性相关系数r≥0.990；测试浓度在[25，200] ng/mL时，绝对偏差不超过±20 ng/mL，测试浓度在（200，1300] ng/mL 时，相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1批內精密度 用高、低2个浓度的样本测试试剂盒，各重复测试10次，其变异系数（CV）应不大于10%。 2.6.2批间差 用样本分别测试3个不同批次的试剂盒，每个批次测试3次，其相对极差（R）应不大于15%。 2.7 准确度 回收率在85%-115%范围内。 2.8 质控品赋值有效性 测试结果在质控范围内。 2.9 瓶内均匀性 校准品和质控品瓶内均匀性（CV）应不大于10%。 2.10 量值溯源 校准品量值溯源至公司内部工作校准品，并与北京九强生物技术股份有限公司生产的髓过氧化物酶测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）比对验证。 2.11 稳定性 2.11.1校准品开瓶稳定性 校准品开瓶后2℃～8℃避光保存可稳定3天。稳定期过后4小时内进行