*基金项目:国家高技术研究与发展计划(863)重大专项(2002AA206111)资助。
赵春江，男，1970年生，中国农业大学生物学院博士后。E-mail:
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(4):470~475
·综述
·人乳铁蛋白转基因研究进展*
赵春江刘兆良
樊宝良李
宁**
(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，
北京100094)摘要：人乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的糖基化蛋白，可可逆性地结合两个铁离子。概述了人乳铁蛋白的结构和理化性质，以及乳铁蛋白基因的结构，并着重论述了人乳铁蛋白转基因研究的状况和主要研究成果。在此基础上，提出了尚未解决的问题，并展望了人乳铁蛋白转基因研究的前景。
关键词：人乳铁蛋白；人乳铁蛋白基因；重组人乳铁蛋白
Study Progress of Human Lactoferrin Transgene
ZHAO Chun-Jiang
LIU Zhao-Liang FAN Bao-Liang LI Ning**
(State Key Laboratory for Agrobiotechnology,China Agricultural University,Beijing 100094,China)
The human lactoferrin (hLF)is an iron-binding glycoprotein with muti-functions,including broad spectrum antimicro-bial activity and anti-inflammatory and immunoregulatory activities.In the review,the protein and gene structures and their physical and chemical properties of hLF were briefed.The main achievements of hLF transgenic study were assessed in detail.On the basis of the assessment,the aspects in the study which need more efforts to be investigated were
presented.
human lactoferrin;human lactoferrin gene;recombinant human lactoferrin
人乳铁蛋白（human lactoferrin ，hLF ）是一种属
于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白[1]，由Sorensen 和
Heremans [2]首次发现，
并由Blanc 和Isliker 命名。乳铁蛋白可以可逆性地结合两个铁离子，其离子结合强度是运铁蛋白（在体内对铁起运输作用的主要蛋白）的300倍[3]。人乳铁蛋白由692个氨基酸组成，分子量约为80kD [4]。在乳铁蛋白内有2个具有铁离子结合能力的叶状结构，一个是氨基端区，即
N-lobe ，另一个为羧基端区，
即C-lobe [5]。两区间有40％的同源氨基酸序列。每个区能结合一个铁离子，同时结合1个二价炭酸根阴离子。人乳铁蛋白为N 端连接的糖基所修饰。经酶促反应，一个寡聚糖苷链以共价键结合在以Asn-Xaa-Thr/Ser 顺序排列的天冬酰胺酸残基上[6]。人乳铁蛋白有3个可能被糖基
化的位点，
分别位于C 叶的第138的天冬酰胺酸残基、N 叶的第479、624天冬酰胺酸残基上[4]。在3个位点中，位于138、479的天冬酰胺酸残基优先被糖
基化，第624的天冬酰胺酸残基的糖基化受第479
位天冬酰胺酸残基糖基化的限制[7]。乳铁蛋白广泛存在于哺乳动物的体液和嗜中性粒细胞的次级颗粒中，乳铁蛋白具有的生理功能主要包括：广谱的抗菌功能、抗炎症功能和免疫生理调节功能[8]。这些功能是通过乳铁蛋白直接获取铁离子或结合在细胞表面而使菌体细胞通透性增加实现的[9]。乳铁蛋白可结合发生炎症区域的铁离子，从而阻止游离的铁离子参与催化有害的氧化反应。乳铁蛋白同时也能影响T 细胞的扩增反应[10]。一些研究表明，乳铁蛋白在体内的抗菌作用远比体外强。这可能是由于乳铁蛋白上存在着抑菌和潜在的免疫调节功能区。在体内，乳铁蛋白通过与体内的细胞结合而发挥抗菌和免疫调节作用[11]。人乳铁蛋白的许多生理功能的发挥有赖于与特异性细胞受体的结合[12]。现已发现人乳铁蛋白受体存在于多种细胞，如肠细胞、血小板、哺乳动
物上皮细胞、
淋巴细胞等[13,14]。其它人乳铁蛋白潜在
第4期赵春江等:人乳铁蛋白转基因研究进展
的功能还包括对骨髓细胞生成的调节、有氧代谢的产生[15]、生长因子作用、DNA结合功能[16]、RNA酶功能等。但乳铁蛋白的某些生物学功能还不甚明了，尚有待于进一步的研究工作阐明。
人乳铁蛋白的多功能属性引发了人们对其编码基因的研究，以便在此基础上对该蛋白进行大规模生产。Powell和Ogden[17]、Rey[18]等在1990年首次分别发表了人乳铁蛋白的cDNA序列和部分基因组序列。后来的研究表明，人乳铁蛋白基因位于人的第3号染色体q21-q23的位置，全长约35kb，共有17个外显子组成，内含子的大小在300bp~3.3kb之间[19]。基于人乳铁蛋白基因的研究，许多研究者开始致力于这一转基因的研究，以了解通过转基因的方式大量生产重组人乳铁蛋白的可能性及重组人乳铁蛋白的性质。人乳铁蛋白转基因研究的最终目的是通过转基因技术生产大量功能上与人乳铁蛋白相同或相近的重组人乳铁蛋白，使之为人类造福。本综述的目的在于归纳和总结过去大约10年内在人乳铁蛋白转基因领域的研究成果和研究进展，以便为开展该方面的工作提供参考。
1人乳铁蛋白转基因研究
过去人们曾以真菌、酵母菌、植物、动物细胞系和动物为宿主进行了人乳铁蛋白的转基因研究。表１概括了该方面研究的情况。
在过去的研究中，人乳铁蛋白cDNA曾广泛用于各类转基因研究中。这主要是因为人乳铁蛋白cDNA比基因组全序列基因更易获得，由于cDNA 序列较短，也更易于被构建到表达载体中去。同时，cDNA可用于原核生物的表达，也使它较早地被用于转基因研究中。Ling和Richardson[22]1993年首次报道了重组人乳铁蛋白在酵母菌中表达的研究。在该研究中，人乳铁蛋白和酵母菌蔗糖酶信号序列区分别用于引导重组人乳铁蛋白的分泌。含酵母菌蔗糖酶信号序列的酵母菌有较高的重组人乳铁蛋白表达量，而含人乳铁蛋白信号序列的酵母菌则重组人乳铁蛋白的表达量很低。在真菌中，菌种在自然条件下分泌糖基化蛋白，这种属性使它成为一种理想的表达重组糖基化蛋白的宿主[32]，现在它已经用于糖基化蛋白的商业化生产[33]。已经有用人乳铁蛋白基因转化真菌和
的报道[20,21]。在此两项研究中，在宿主中高表达的基因的启动子用于引导重组人乳铁蛋白的表达。在中，人乳铁蛋白cDNA和在高效表达的葡糖糖化酶基因连接在一起，中间用KEX-2切割位点隔开。经过翻译，融合蛋白用KEX-2切割，形成单独的重组人乳铁蛋白。在此研究中，在表达重组人乳铁蛋白的转化子中引入突变，可获得较高的重组人乳铁蛋白的表达量(2000μg/mL)。此表达量是迄今为止在酵母菌、真菌和细胞系的人乳铁蛋白转基因研究中重组人乳铁蛋白表达量最高的[19~24]。这可能是因为采用了融合的方法进行转染并把
作为转基因宿主的缘故。根据以往研究的结果，转基因所用宿主、启动子和分泌信号区序列显著影响着重组人乳铁蛋白在酵母菌、真菌和细胞系中的表达水平。由于人乳铁蛋白抗菌的作用，影响了一些酵母菌和真菌的正常生长，在培养后达不到较高的浓度，它们的生长被分泌的重组人乳铁蛋白所抑制。这样，选择对重组人乳铁蛋白抑菌作用不敏感的细菌就显得很重要。当转基因寄主的自身基因的启动子和信号区序列用于转基因研究时，往往会得到较高的外分泌重组人乳铁蛋白的表达水平。到目前为止，还没有人乳铁蛋白全基因在真菌和细胞系内进行转基因研究的报道。在这方面还有待进一步的研究。对植物进行乳铁蛋白转基因研究的最初目地是生产大量的重组人乳铁蛋白并增强植物对细菌、真菌以及酵母菌的抵抗能力。对重组人乳铁蛋白在烟草和土豆中的表达已有报道[25,26]。在这些研究中，人乳铁蛋白cDNA和CaMV的启动子整合在一起对植株进行转化，重组人乳铁蛋白在植株中得到了正确表达。但在实验中对植株抗病菌能力的提高尚未有报道，在这方面尚有待于进一步的研究证实。人乳铁蛋白基因组全序列在植物中转基因的研究尚未有报道。1993年，Platenburg等[27]首次报道了人乳铁蛋白基因转基因小鼠获得了成功。早期该领域的研究仅局限于人乳铁蛋白cDNA。后来的研究发现，携带有人乳铁蛋白基因组全序列的转基因小鼠分泌的重组人乳铁蛋白的量远高于携带有人乳铁蛋白cDNA的量。1997年Nuijens等[28]分别用人乳铁蛋白cDNA和人乳铁蛋白全基因组序列片段与ALPHAs1-casein基因启动子相连接构建成乳腺组织特异性表达载体。结果显示，cDNA转基因小鼠重组人乳铁蛋白的表达范围为400~1300μg/mL，而在基因组全基因片段的转基因小鼠中为300~3800
μg/mL。1999年Kim等[31]进行的转基因实验中显示，在同时用Beta-casein作为启动子的情况下，含人乳铁蛋白基因全序列片段的转基因小鼠的泌乳量
471
农业生物技术学报2004年
表1人乳铁蛋白转基因研究的概况Table 1The outline of the hLF transgenic study
1)The total amount of rhLF (recombinant human lactoferrin )is produced at levels up to 5μg/mL.Approximately 30%of the rhLF produced in this system is secreted into the growth medium;2)In the research,two expression vectors were constructed.The one contained yeast invertase signal sequence (pLFIS10)secreted rhLf with 1.5~2.0μg/mL while another containing hLF secretion signal sequence (pRL1)produced quite low level of rhLF in the yeast culture medium.The rhLF contents in colonies containing pLFIS10and pRL1were estimated to be 20~30μg/mL.The recombinent hLF concentration was detected by scanning the Western blotting film with an enhanced laser densitometer;3)(1)The expression level of rhLF of the transgenic plant containing hLF signal peptide sequence.(2)The expression level of rhLF of the transgenic plant containing sweet potato sporamin signal peptide sequence;4)0.01%of total soluble protein for Mas p2promoter and 0.1%of total soluble protein for CaMV 35S promoter;5)This is an unpublished research work mentioned by J.Platenburg in 1993.The exact expression level was not reported.;6)The rhLF concentrations in the milk from the hLF cDNA transgenic mice ranged from 400~1300μg/mL and they were 300to 3800μg/mL in the genomic hLF gene transgenic mice;7)The expression level of the protein in milk of 7mice ranged from 1~200μg/mL;1~34μg/mL in 6mice and 200μg/mL in 1mouse;8)In the research,the amount of the protein in 5transgenic mice ranged from 60~6600g/mL judged by ELISA analysis.Among them,3mice expressed the
protein at the level higher than 500μg/mL;9)The rhLF expression levels in 3out of 9offspring of 4transgenic cattle harboring genomic
gene were 300~900μg/mL,and the levels in other 6offspring ranged from 1600~2800μg/mL;10)In the study,the rhLF expression levels of 7transgenic mice (2offsprings of the transgenic mouse were included)varied from 400~7,800μg/mL.six out of the 7mice had the rhLF expression levels over 1000μg/mL.A daughter of a hLF transgenic male mouse had the highest rhLF expression.
转基因宿主基因序列启动子rhLF 表达水平作者及发表年代Transgenic host sequence Promoter rhLF expressing level Published year &author
真菌Fungi
2.3kb cDNA
300bp r
5μg/mL (total)Ward,et al.(1992)[20]
alcA promote
1.5μg/mL (secreted)(ELISA analysis)1)真菌Fungi
2.1kb cDNA 1.1kb glucoamylase 2,000μg/mL (secreted)gene promoter (ELISA analysis)Ward,et al.(1995)[21]酵母Yeast Full length cDNA Yeast chelatin promoter 20~30μg/mL (total)Liang,et al.(1993)
[22]
1.5~
2.0μg/mL (secreted)2)仓鼠肾脏细胞 2.3kb full length MT-1promoter
20μg/mL (secreted)
Stowell,et al.(1991)[23]
Baby-hamster cDNA
(Determined by the A280of the kidney cells pooled column fractions)烟草细胞Full length cDNA CaMV 35S promoter 0.6%~2.5%of the total Mitra,et al.(1994)[24]cellular protein
烟草 2.1kb full length DP35ScaMV promoter
(1)0.1%of total extracted Salmon,et al.(1998)[25]
Tobacco
cDNA
leaf proteins
(2)0.3%of total extracted leaf proteins 3)(ELISA)
马铃薯 2.3kb full length 1.Mas P2promoter (1)0.01%of total soluble protein Chong,et al.(2000)[26]
Potato cDNA
2.CaMV 35S promoter (2)0.1%of total soluble protein 4)(ELISA analysis)小鼠Mice Full length cDNA 7.7kb αs1-casein 0.1~36μg/mL Platenburg,et al.(1994)[27]promoter
(RIA analysis)小鼠Mice Genomic sequence 6.2kb αs1-casein gene >1000μg/mL
De Wit,et al.(1993)promoter 小鼠Mice
1.hLF cDNA αs1-casein gene 1400~1300μg/mL Nuijens,et al.(1997)[28]
2.hLF genomic promoter
2.300~3800μg/mL sequence
(RIA analysis)6)小鼠Mice 2.5kb hLF cDNA 2kb bovine β-casein 1~200μg/mL 7)Kim,et al.(1994)[29,30]
gene promoter (ELISA analysis)小鼠Mice 27kb genomic 10kb bovine β-casein 60~6600μg/mL 8)Kim,et al.(1999)
[31]
sequence gene promoter (ELISA analysis)小鼠Mice 147kb genomic 90kb hLF gene 400~7800μg/mL Liang,et al.(2003)[32]sequence promoter (RIA analysis)10)牛Cattle
Genomic 6.2kb αs1-casein 300~2800μg/mL 9)van Berkel,et al.(2002)[33]
sequence
gene promoter (ELISA analysis)
472
第4期赵春江等:人乳铁蛋白转基因研究进展
最高可达6600μg/mL，而用cDNA得到的转基因小鼠的重组人乳铁蛋白的表达量不超过30μg/mL。2002年刘兆良等[32]用含有人乳铁蛋白基因全序列及其完整调控序列的BAC大片段进行转基因小鼠研究，得到最高重组人乳铁蛋白表达量为7800
μg/mL。在大家畜的转基因研究中，新西兰科家学van Berkel等[33]以人乳铁蛋白基因全序列片段和αs1-casein基因启动子构建载体，经过近10年努力终于成功获得了人乳铁蛋白转因牛。总体来看，用人乳铁蛋白全基因序列比用其cDNA序列为转基因材料得到的重组蛋白表达量高。在转基因研究中，有些情况下，用cDNA作为转基因材料可得到较高的重组蛋白的表达量。如人体蛋白C的cDNA[34]，人IGF-1cDNA[35],和人EPO cDNA等[36]。但在另外一些情况下，用cDNA转基因得不到高表达量[37]。为此，有研究采用了模式附着元件(matrix attachment elements,MARs)，位点控制区域(locus control regions,LCRs)，或YAC克隆等克服位置效应，以获得高表达量的重组外源蛋白[31,32,38]。以往的工作表明，有一些基因的内含子内存在着正向的或负向的调控元件，调控着基因的表达。人乳铁蛋白转基因的研究表明，在人乳铁蛋白基因内部存在着重要的调控元件，对人乳铁蛋白的表达发挥着正向的调控作用。现在尚需进一步的研究以调查人乳铁蛋白内含子内调控元件对表达起调控作用的机理。过去，对哺乳动物的人乳铁蛋白转基因的研究主要局限在小鼠上，对大家畜少有涉及。对牛、羊等大家畜进行人乳铁蛋白的转基因研究将是下一步的发展方向。
2对重组人乳铁蛋白主要理化性质和生物活性的分析
人乳铁蛋白转基因研究的最终目的是生产在生物活性、功能方面与天然人乳铁蛋白相同或相似的重组人乳铁蛋白，使之造福于人类。于是，对重组人乳铁蛋白的理化性质和生物活性的分析与鉴定就显得特别重要。现在已建立起一些鉴定重组人乳铁蛋白主要理化性质和生物活性的方法，主要包括免疫属性鉴定，氨基酸序列分析，铁离子结合能力的测定，糖基化的分析，生物结合能力的分析，抑菌能力的测定等。到目前为止，就得到的实验结果来看，重组人乳铁蛋白的生物活性的测定是很乐观的。
N端测序分析的结果表明，重组人乳铁蛋白与人乳铁蛋白的序列一致[22,23,28,33,39]。1996年Nuijens等[28]进行的小鼠免疫实验中，用人乳铁蛋白注射人乳铁蛋白转基因小鼠，发现在11只转基因鼠中有9只没有发生免疫抗性反应，而作为对照的注射过人乳铁蛋白的非转基因小鼠则都产生了免疫应答反应。这一结果表明，在人乳铁蛋白转基因小鼠中，进入体内的人乳铁蛋白已被免疫系统所承认，而不被认为是侵入体内的抗原[28]。
金属离子与人乳铁蛋白的结合可改变蛋白的构象，在进行SDS-PAGE凝胶电泳时的迁移率较没有结合金属离子时快。人乳铁蛋白在pH4.0时释放出铁离子，在pH2.5时完全和铁离子分离。重组人乳铁蛋白铁离子的结合属性在以往的研究中已被证明和人乳铁蛋白完全一致[22,23,28,39]，但有报道称，重组人乳铁蛋白比人乳铁蛋白的铁饱和程度高[28]。
蛋白糖基化具有组织特异性和物种特异性[40,41]，因而重组人乳铁蛋白和人乳铁蛋白在糖基化方面有所不同。在进行SDS-PAGE凝胶电泳时，重组人乳铁蛋白的带型有些弥散，不象人乳铁蛋白那样界线分明。这主要是由于在重组人乳铁蛋白中杂合型的糖基化造成的。但在相同条件下经肽－N－糖基化酶的消化，在SDS-PAGE电泳时表现出相同的分子量[22,23,28,33,39]。在van Berkel等[39]的研究中，在人肾脏细胞中转入人乳铁蛋白基因，使其表达人乳铁蛋白。同时，在同类细胞中加入可阻断糖基化的衣霉素，表达没有糖基化的人乳铁蛋白。结果表明，没有糖基化并不影响人乳铁蛋白的主要属性，如在体内的抗菌和抗炎症功能。但没有糖基化的人乳铁蛋白比糖基化的乳铁蛋白更容易被胰蛋白酶所消化。这表明糖基化对人乳铁蛋白的主要功能没有显著影响，但对其稳定性也许是重要的。
在抗菌功能方面，在研究中已发现人乳铁蛋白转基因小鼠对菌有更强的Th1反应[42]。人乳铁蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用[24,26,43,44]。对预先注射过重组人乳铁蛋白和没有预先注射过重组人乳铁蛋白的小鼠注射致死量的大肠杆菌078:H11，结果表明，预先注射过重组人乳铁蛋白的死亡率显著低于对照组。有研究表明，重组人乳铁蛋白在体外可抑制多种细菌的生长[21]。人乳铁蛋白的结合属性与其抗菌和抗消炎作用密切相关。研究发现重组人乳铁蛋白对DNA、hLZ、LPS [28,39]、某些抗体以及对表达乳铁蛋白的细胞的结合属性与人乳铁蛋白相同[27]。
尽管许多人乳铁蛋白的生物活性已被科学家所证实，但重组人乳铁蛋白在体内的细致功能尚有待于实验研究的进一步阐明。
473
农业生物技术学报2004年
3人乳铁蛋白转基因研究的展望
在过去的20年时间里，人乳铁蛋白转基因研究已取得了很大进展。一些成功的转基因系统可得到较高表达量的重组人乳铁蛋白（高于1g／L）。许多重组人乳铁蛋白的属性与人乳铁蛋白相同。但离最终通过转基因方法大量生产有生物活性的重组人乳铁蛋白并使之造福于人类的目标还有一段不小的距离。下列一些方面尚有待于实验工作进一步阐明:①用人乳铁蛋白基因基因组全序列片段研究在大家畜(牛、羊等)乳中表达具有生物活性的重组人乳铁蛋白的可能性；②在酵母菌等真菌中以人乳铁蛋白基因基因组全序列进行转基因研究，以期得到高表达量的重组人乳铁蛋白；③重组人乳铁蛋白在生物体内的功能尚需进一步的研究；④对于重组人乳铁蛋白与人乳铁蛋白不同的属性，应作为重点做细致研究，以调查其对人类潜在的副作用。
参考文献
1Chasteen N D.Transferrin:A perspective.Adv Inorg Biochem,1983,5:201~233
2Masson P L,Heremans J https://www.doczj.com/doc/126355621.html,ctoferrin in milk from different https://www.doczj.com/doc/126355621.html,p Biochem Physiol,1971,39:119-129
3Sánchez L,Calvo M,Broch J H.Biological role of lactofer-rin.Arch Dis Child,1992,67:657~661
4Rey M W,Woloshuk S L,De boer H A,et https://www.doczj.com/doc/126355621.html,plete nu-cleotide sequence of human mammary gland lactoferrin.Nu-cleic Acids Res,1990,18:5288
5Anderson B F,Baker H M,Norris G E,et al.Apolactoferrin structure demonstrates ligand-induced conformational change in transferrins.Nature,1990,344:784~787
6Opdenakker G,Rudd P M,Ponting C P,et al.Concepts and principles of glycobiology.FASEB J,1993,7:1330~1337
7van Berkel P H C,van Veen H A,Geerts M E J,et al.
Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asn138in human lactoferrin:A study with glycosylation-site mutants.Biochem J,1996,319:117~122 8Baveye S,Elass E,Mazurier J,et https://www.doczj.com/doc/126355621.html,ctoferrin:A multifunctional glycoprotein involved in the modulation of the inflammatory process.Clin Chem Lab Med,1999,37: 281~286
9Ellison R T,LaForce F M,Giehl T J,et https://www.doczj.com/doc/126355621.html,ctoferrin and
transferring damage of the gram-negative outer membrane is modulated by Ca2+and Mg2+.J Gen Microbiol,1990,136: 1437~1446
10Djeha A,Brock J H.Effect of transferring,lactoferrin and chelated iron on human T-lymphocytes.Br J Haematol,1992, 80:235~241
11Bhimani R S,Vendrov Y,Furmanski P.Influence of lactoferrin feeding and injection against systemic staphylococcal infections in mice.J Appl Microbiol,1999, 86:135~144
12Spik G,Legrand D,Leveugle B,et al.Characterization of two kinds of lactotranserrin(lactoferrin)receptors on different target cells.Hutchens T W,Rumball S V,L nneral
https://www.doczj.com/doc/126355621.html,ctoferrin Structure and Function.AdvExp Med Biol,
1994,357:13~19
13Mikogami T,Marianne T,Spik G.Effect of intracellular iron depletion by picolinic acid on expression of the lactoferrin receptor in the human colon carcinoma cell subclone HT29-18-C-1.Biochem J,1995,308:391~397
14Rochard E,Legrand D,Lecocq M,et al.Characterization of lactotransferrin receptor in epithelial cell lines from non-malignant human breast,benign mastopathies and breast carcinomas.Anticancer Res,1992,12:2047~2052
15Klebanoff S J,Waltersdorph A M.Peroxidant activity of transferring and lactoferrin.J Exp Med,1990,172: 1293~1303
16He J,Furmansky P.Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA.Nature,1995, 373:721~724
17Powell M J,Ogden J E.Nucleotide sequence of human lactoferrin cDNA.Nucleic Acids Res,1990,18:4013
18Rey M W,Woloshuk S L,Boer H,et https://www.doczj.com/doc/126355621.html,plete nucleotide sequence of human mammary gland lactoferrin.Nucleic Acids Res,1990,18:5288
19Kim S J,Yu D Y,Pak K W,et al.Structure of the human lactoferrin gene and its chromosomal localization.Mol Cells, 1998,8:663~668
20Pauline P W,Gregory S M,Denis R H,et al.An inducible expression system for the production of human lactoferrin in
.Gene,1992,122:219~223
21Ward P P,Piddington C S,Cunningham G A,et al.A system for production of commercial quantities of human lactoferrin:
A broad spectrum natural antibiotic.Biotechnology,1995,
13:498~503
474
第4期赵春江等:人乳铁蛋白转基因研究进展
22Liang Q W,Richardson T.Expression and characterization of human lactoferrin in yeast.J Agric Food Chem,1993,41:1800~1807
23Stowell K M,Rodo T A,Funk W D,et al.Expression of cloned human lactoferrin in baby-hamster kidney cells.
Biochem J,1991,276:349~355
24Mitra A,Zhang Z Y.Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein.Plant Physiol,1994,106:977~981
25Salmon V,Legrand D,Slomianny M C,et al.Production of human lactoferrin in transgenic tobacco plants.Protein Expr Purif1998,13:127~135
26Chong D K X,Langridge W H R.Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants.
Transgenic Res,2000,9:71~78
27Platenburg G J,Kootwijk E P A,KooIman P M,et al.
Expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice.
Transgenic Res,1994,3:99~108
28Nuijens J H,van Berkel P H C,Geerts R R P,et al.
Characterization of recombinant human lactoferrin secreted in milk of transgenic mice.J Biol Chem,1997,272: 8802~8807
29Kim S J,Lee K W,Yu D Y,et al.Expression analysis of a bovineβ-casein/human lactoferrin hybrid gene in transgenic mice.J.Reprod Dev,1997,43:143~149
30Kim S J,Cho Y Y,Lee K W,et al.Expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice using bovine β-casein/human lactoferrin cDNA fusion gene.Mol Cells, 1994,4:355~360
31Kim S J,Sohn B H,Jeong S K,et al.High-level expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice using genomic lactoferrin sequence.J Biochem,1999,126: 320~325
32Liu Zhaoliang,Zhao Chunjiang,Fan Baoliang,et al.Variable expression of human lactoferrin gene in mice milk driven by its90kb upstream flanking sequences.Animal Biotechnolo-gy,2004,15:21~31
33Berkel H C,Welling M W,Geerts M,et https://www.doczj.com/doc/126355621.html,rge scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows.Nat Biotech,2002,20:484~487
34Velander W H,Johnson J L,Page R L,et al.High level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic
swine using the cDNA encoding human protein C.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:12003~12007
35Brem G,Hartl P,Besenfelder U,et al.Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1(IGF-1)in the mammary gland of transgenic rabbits.Gene,1994,149:351~355
36Hashido K,Arai Y,Kajihara S,et al.Copy-dependent and position-independent expression of rat aldolase A gene.J Biochem,1995,118:601~606
37Hansson L,Edlund M E,Johansson T,et al.Expression chracterization of biologically active human extracellular superoxide dismutase in milk of transgenic mice.J Biol Chem,1994,69:5356~5363
38Fujiwara Y,Miwa M,Takahashi R,et al.
Position-independent and high level expression of human 琢-lactalbumin in the milk of transgenic rats carrying a210-kb YAC DNA.Mol Reprod Dev,1997,47:157~163
39van Berkel P H C,Geerts M D J,van Veen H A,et al.
Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide,but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis.Biochem J,1995, 312:107~114
40Derisbourg P,Wieruszeski J M,Montreuil J,et al.Primary structure of glycans isolated from human leucocyte lactotransferrin.Absence of fucose residues questions the proposed mechanism of hyposideraemia.Biochem J,1990, 269:821~825
41Coddeville B,Strecker G,Wieruszeski J M,et al.
Heterogeneity of bovine lactotransferrin glycans.
Characterization of alpha-D-Galp-(1-->3)-beta-D-Gal-and alpha-NeuAc-(2-->4)-beta-D-GlcNAc-substituted N-linked glycans.Carbohydrate Res,1992,236:145~164
42Guillen C,Vaughan D M,Kommajosyula S,et al.Enhanced Th1response to staphylococcus aureus infection in human lactoferrin-transgenic mice.J Immun,2002,168:3950~3957 43Bellamy W,Takase M,Yamauchi K,et al.Identification of the bactericidal domain of lactoferrin.Biochem Biophys Acta,1992,1121:130~136
44Yamauchi K,Tomita M,Giehl T J,et al.Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment.Infect Immun,1993,61:719~728
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转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望 （1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。 （2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 （3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 （4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。 （5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。 当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。
开题报告 食品质量与安全 重组铁蛋白的活性研究 一、选题的背景与意义 铁是人体生理代谢必需元素之一，也是不可缺少的营养元素。缺铁对儿童的智力、身体发育，免疫功能，消化吸收功能均有较大影响。缺铁性贫血是世界上最普遍的营养缺乏症，会损坏免疫系统，降低人的生理和心理机能，也会阻碍大脑认识能力的发育。据估计，全球约有30％的人口受缺铁的痛苦。在以稻米等植物性食物为主食的发展中国家，缺铁的影响程度更大，有近半数的5岁以下儿童和超过一半的孕妇患有铁缺乏症。 铁蛋白是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的铁储存蛋白，是动植物生长发育的储存铁的共同来源。当细胞内二价铁离子含量高时，铁蛋白通过它的亚铁氧化还原中心，在氧气的帮助下，将其催化氧化生成无毒的三价铁储藏在它的内部，1分子铁蛋白最多可储存4500个三价铁，这个特点是铁蛋白与其它酶最大的不同之处；当细胞需要铁时，铁蛋白在还原剂的帮助下，将三价铁还原为二价铁离子从其内部释放出来，以供其它蛋白质合成利用，所以铁蛋白在细胞内具有去除二价铁离子的毒性以及调节铁代谢平衡的双重作用，同时它还参与细胞RNA代谢的调节。有研究认为该蛋白是解决动物和人类全球饮食缺铁的有效方法。 纽虫是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布，它具有柔软、能伸展、无分节的身体，以及一个极具特征性的捕食器——能够翻转的吻。研究表明其铁蛋白有较强的结合铁的能力，因此通过基因工程技术导入铁结合蛋白基因来提高食品铁含量以改良其营养品质将具有十分重要的意义。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1、重组铁蛋白的获取 （1）IPTG诱导重组蛋白的表达，SDS—PAGE检测表达的情况； （2）大量表达蛋白并检测该蛋白为可溶性还是包涵体形式存在；
浅谈我国转基因水稻的研究(一) 论文关键词]水稻转基因论文摘要]稻转基因研究是国内外植物分子遗传学研究的热点之一。目前，水稻转基因研究在我国已取得显著进展。详细介绍转基因技术，并阐明我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展， 水稻是我国的重要经济作物和粮食作物。水稻分布极其广泛，由于生态环境的复杂性和所处地理环境的影响，水稻在漫长的进化过程中，形成了极其丰富的遗传多样性，染色体组型和数目复杂多样，成为研究稻种起源、演化和分化必不可少的材料。 植物转基因技术是利用遗传工程手段有目的地将外源基因或DNA构建，并导入植物基因组中，通过外源基因的直接表达，或者通过对内源基因表达的调控，甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达，使植物获得新性状的一种品种改良技术。它是基因工程、细胞工程与育种技术的有机结合而产生的一种全新的育种技术体系。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的各种抗性或抗性相关基因转入水稻，进一步拓宽了水稻抗病基因源，为抗病育种提供了一条新途径。 一、国内外的转基因技术 转基因技术自20世纪70年代诞生以来，已经取得迅速的发展。到目前为止，中国已经是全球第4大转基因技术应用国。 转基因生物技术的应用，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。中国是继美国之后育成转基因抗虫棉的第二个国家。现在河北省与美国孟山都合作育成33B抗虫棉（高抗棉铃虫、抗枯萎病、耐黄萎病）。由中国农科院生物中心、江苏省农科院导入Bt基因，由安徽省种子公司，安徽省东至县棉种场共同选育的抗虫棉“国抗1号”在安徽省已通过审定。国际水稻所将抗虫基因导入水稻，育成抗二化螟、纵卷叶螟的转基因水稻。中国农科院、中国农业大学、中国科学院、河南农科院等许多科研单位和高校将几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦育成抗病转基因小麦、转基因烟草、转基因水稻等等。英国爱丁堡大学将水母发光基因导入烟草、芹菜、马铃薯等作物，获得发光作物，驱赶害虫。 至于油菜方面利用转基因工程培育雄性不育系及其恢复系的研究，亦取得了突破性的进展。比利时为了提高菜饼粗蛋白质的含量，将一种草控制的蛋白质基因转移到油菜上来，选出高蛋白质含量的转基因油菜品种。瑞典Svalow-Weibull等公司利用基因工程技术将外源基因导入甘蓝型油菜，培育成抗除草剂油菜新品种；比利时PGS公司采用基因工程手段创造出新的油菜授粉系统；法国应用原生质体融合技术将萝卜不育细胞质的恢复基因引入甘蓝型油菜，充分利用萝卜不育细胞质不育彻底的特性，实现了萝卜不育细胞质的三系配套，对推动全球杂交油菜育种具有革命性的影响。 二、我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展 我国是农业超级国，因此，中国人吃饭问题的关键是水稻问题（高产和抗性问题），而水稻问题的核心便是转基因技术在水稻中的成功应用。 近年来，植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟，国内外相继开展了水稻东格鲁病、条纹叶枯病、黄矮病、矮缩病等8种病毒病的转基因育种研究，将各病原病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、编码结构或非结构蛋白基因干扰素CDNA等分别导入水稻，获得了抗不同病毒病的转基因株系或植株。在我国，转基因技术在水稻中的应用已经取得了惊人的成果。（一）转基因技术在提高水稻植株的抗Basra除草剂的成果 王才林等利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系“E32”，获得转基因植株。抗性鉴定表明，转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性；通过对转基因植株后代PCR分析，证实bar基因已整合到受体植株的基因组中，遗传分析表明，bar基因能在有性生殖过程中传递给后代，并在T代开始分离出抗性一致的稳定株系。段俊等利用转基因技术，
生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名：魏斌聪 学号：200806016139 专业/班级：生物工程081班 课程名称：生物工程原理 指导教师：陈蔚青教授 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月
转基因作物的研究进展 魏斌聪 （浙江树人大学生物与环境工程学院生工081班浙江杭州310015） 摘要：人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程，对其基因问题的研究作了讨论，并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析，最后对此项技术作出展望。 关键词：转基因作物；DNA技术；基因导入；安全性 前言 转基因植物（transgenic plant），是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面，如可食用的大豆、玉米等，或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来，转基因作物同普通植物似乎没有任何区别，它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来，生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去，以便使它具有某种新的特性：抗除莠剂的特性，抗植物病毒的特性，抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体：细菌、病毒、昆虫等。这样，通过生物工程技术，人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性，这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年，全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年，首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年，美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、
作物转基因技术的研究进展 摘要：作为生物技术领域的前沿，转基因技术已在多种植物上取得重大进展。本文主要介绍了当前作物转基因技术的三大主流方法：农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法，并阐述了这几种转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆，甘薯等几种主要农作物的应用进展状况。 关键词：转基因技术、农作物、应用 Genetically Modified---转基因，简称GM，是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，再从结果中进行数代的人工选育，从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。而其衍生出的转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的，即把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。 1983年比利时科学家Montagu 等人和美国Monsanto 公司Fraley等人分别将T- DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株———转基因烟草。自此之后，作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段. 国际农业生物技术应用服务组织2 月13 日在京发布的1 份报告显示，全球27 个国 家超过1800 万农民，2013 年种植转基因作物，种植面积比2012 年增加了500 万公顷。此外，首个具有耐旱性状的转基因玉米杂交品种亦于2013 年在美国开始商业化。 据该报告显示，全球转基因作物的种植面积于转基因作物商业化的18 年中增加了100 倍以上，从1996 年的170 万公顷增加到2013 年的1.75 亿公顷，其中美国仍是全球转基因作物的领先生产者，种植面积达7010 万公顷，占全球种植面积的40%。国际农业生物技术应用服务组织创始人兼荣誉主席、本年度报告作者Clive James 表示，目前排名前10 位的国家种植转基因作物的面积均超过100 万公顷，这为将来转基因作物的多样化持续发展打下了广泛基础。在种植转基因作物的国家中，有19 个为发展中国家，8 个为发达国家；发展中国家的种植面积连续2 年超越发达国家。 目前，作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.但在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术也相对较为成熟. 一、农杆菌介导法 农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时，受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激，活化质粒上Vir 区基因的表达，将质粒上的另一段DNA（T-DNA）共价整合到植物基因组上，在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响，如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件（pH、温度和光照条件）等[32]，此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低[33]，且基因沉默少，转移的基因片段长等优点。 农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法，迄今为止，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%，已成为植物基因转化首选方法。 二、基因枪介导法 基因枪法又称微弹轰击法，是将外源基因包裹在直径1~2 nm的钨或金颗粒表面，加速轰击植物外植体靶组织，穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此，通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制，可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。 最早的基因枪是由美国Cornel 大学的Sanford 等在1987 年研制成功的。目前基因枪介
*基金项目:国家高技术研究与发展计划(863)重大专项(2002AA206111)资助。 赵春江，男，1970年生，中国农业大学生物学院博士后。E-mail:
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
纳米凝胶的研究进展 摘要：纳米凝胶是由亲水性或两亲性高分子链组成的三维网状结构，它能显著的溶胀于水但是不溶解于水，由于水和凝胶网络的亲和性，水可能以键合水、束缚水和自由水等形式存在于高分子网络中而失去流动性，因此纳米凝胶能够保持一定的形状。它们可以作为一种药物载体，而且也可以通过盐键，氢键或者疏水作用自发的结合一些生物活性分子。高分子电解质的纳米凝胶可以稳定地结合带相反电荷的小分子药物和生物大分子，比如寡或多聚核苷酸（siDNA，DNA）和蛋白质。目前的研究表明纳米凝胶在生物医药方面有很广阔的应用前景。关键词：纳米凝胶药物载体 前言 纳米凝胶通常指的是由物理或者化学交联的聚合物网络组成的水凝胶颗粒， 它是一种纳米尺度的水分散体。按形成的化学键，凝胶分为两种：一种是化学凝胶（聚合物凝胶），这种凝胶是由交联的共价键而形成的三维网络结构，比如PEG-cl-PEI。另一种是物理凝胶，是由非共价键形成的三维网络结构，比如甘露糖类，右旋糖酐等。按溶剂分，则一般分为有机凝胶和水凝胶。 纳米凝胶可以很好的作为药物运输载体是因为它们有很高的负载能力，高的稳定性，更重要的是相对于普通的药物纳米载体，它们对环境敏感，比如离子强度，pH和温度。至从2002年第一篇关于纳米凝胶的合成与应用的综述发表后，这类新颖的纳米结构材料在药物，大分子和显影剂运输方面受到人们越来越大的关注。这篇综述简单介绍了纳米凝胶的合成与
应用，尤其是药剂学方面的应用。 没有负载的纳米凝胶含有大量的水而处于一种溶胀的状态。纳米凝胶可以通过生物活性因子与其多聚链基质之间的静电作用，范德华力或者疏水作用自发的负载这些因子。因此，纳米凝胶塌陷而形成稳定的纳米粒子，生物活性因子负载其中。可以在其结构中加入分散的亲水性聚合物比如聚乙二醇来阻止纳米凝胶的聚集。在负载药物的纳米凝胶络合物塌陷的过程中，这类聚合物可以暴露在其表面并形成一个亲水的保护层从而阻止了相分离。纳米凝胶表面的官能团可以进一步的用各种不同的靶向基团修饰以达到靶向输送特定部位的目的。研究表明纳米凝胶可以将其负载送到细胞里面并穿过生物膜。这种纳米凝胶有很好的稳定性并且可以保护生物活性因子不被细胞内代谢系统降解。纳米凝胶在全身性药物输送及提高口服和脑部位的生物利用度方面表现出很大的潜能。 1 纳米凝胶的制备 目前报道的制备纳米凝胶的方法有以下几种：（1）聚合物之间的物理自组装；（2）均相或微小非均相环境下的单体聚合；（3）形成了的聚合物交联；（4）模板辅助。下面详细介绍这几种方法。 许多研究团队用聚合物之间的物理自组装制备了各种不同的纳米凝胶。这种方法通常包括控制亲水性聚合物之间通过疏水作用或者静电作用或者氢键导致的聚集。这种制备纳米凝胶的方法在温和条件和水介质中进行。亲水性聚合物相互作用将生物大分子包裹其中，并且对于制备负载蛋白质的纳米凝胶非常有用。比如Akiyoshi等人通过胆固醇修饰的淀粉之间的疏水作用制备了负载胰岛素的纳米凝胶（如图1a）【1】。这种纳米凝胶在一个窄的胆固醇∕糖比例（1:40-1:100）
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。 水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。 基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d 光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小
水稻转基因育种研究进展 王彩芬,安永平,韩国敏,张文银,马 静 (宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁 750105) 摘要:对水稻转基因技术在抗虫、抗病、抗逆及改良米质等方面的进展进行了综述。 关键词:水稻; 转基因育种; 进展 中图分类号:S511.035.3 文献标识码:A 文章编号:1002-204X(2005)06-0055-03 20世纪下半叶以来,由于分子生物学研究的巨大成就,使生物学成为自然科学的带头学科,它的理论和方法已渗透到生命科学的许多领域,为生命科学的研究带来新的思维方式和研究手段。基因工程技术在植物遗传育种上应用很广泛,并取得了显著成就。 水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。据专家预测,到2025年在现有稻谷产量的基础上再增加60%才能满足需要(K hush,1995)。随着人口的增长和耕地面积的减少,世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战,培育优良品种是提高稻谷产量的主要途径。传统的育种技术已为培育水稻新品种做出了巨大贡献,并将在今后继续发挥主导作用,但由于品种资源的贫乏,单靠传统育种已很难有大的突破。基因工程技术为水稻分子标记辅助育种、水稻转基因育种提供了一条新途径。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱、耐盐、改善品质、提高产量等基因转入水稻,从而实现水稻种质创新和为生产提供优良品种。自1988年以来,国内外已得到了许多水稻转基因植株,涉及到抗虫、抗病、抗除草剂、抗旱、耐盐、改良品质等重要农艺性状,有些已进入田间试验和应用阶段。 1 水稻转基因育种进展 植物转基因育种是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达,使植物获得新的性状的一种品种改良技术。在植物分子生物学研究的众多材料中,水稻不仅是世界重要粮食作物,而且由于其基因组较小、重复序列较少的优点而成为一种重要的分子遗传学研究的单子叶模式植物,基因组测序已完成。自1988年首次获得转基因水稻以来,水稻转基因技术已获得突飞猛进的发展,目前已成功获得籼稻、粳稻、爪哇稻的转基因植物。随着基因枪转化技术的建立和根癌农杆菌介导转化法的成功,水稻基因转化技术日益完善。而且转移目标基因已从报告基因或筛选标记基因进入改良水稻抗性和适应性,以及改善品质,提高产量等重要基因的利用。 1.1 抗虫转基因水稻育种 水稻是虫害最多的大田作物,稻螟虫和稻飞虱危害最为严重,水稻中抗虫资源贫乏,转基因技术为抗虫品种的培育提供了一条新途径。自从1989年实现苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)抗虫基因转化水稻并得到再生植株以来,转抗虫基因水稻的研究取得了很大进展。转抗虫基因水稻包括转Bt基因、转蛋白酶抑制基因和转凝集素基因。在转Bt基因的研究方面,中国农科院生物技术中心杨虹等(1989)将Bt基因导入水稻品种台北309、中花8号的原生质体并获得再生植株;Fujim oto等(1993)通过电激法将cry LAb 基因导入水稻,首次报道了转Bt基因水稻对二化螟和稻纵卷叶螟的抗性。项友斌等(1999)利用农杆菌介导实现了苏云金杆菌抗虫基因cryI A(b)和cryI A(c)在水稻中的转化;黄健秋等(2000)利用农杆菌介导获得转(Bt)基因秀水11和春江11植株;薛庆中等(2002)利用农杆菌介导获得转双价抗虫基因(cryI Ac和豇豆胰蛋白酶抑制基因C pTI)浙大19植株;朱常香等(2002)获得Bt和X a21共转化水稻(C48)植株。近几年转Bt基因研究越来越多,进展很快,在籼稻、香稻、爪哇稻、杂交稻、深水稻中获得成功,选育出克螟稻1号、2号、3号(舒庆尧等,1998)。转Bt基因水稻在我国已进入环境释放阶段,有望培育出应用于生产的抗虫品种。 在转蛋白酶抑制剂基因水稻研究方面,通过电激介导原生质体转化,Xu等(1996)把豇豆胰蛋白酶抑制剂基因C pT i转入粳稻品种台北309,转基因植株对大螟和二化螟2种水稻虫害都具有抗性;通过基因枪介导马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ转化水稻,Duan等(1996)获得了Nipponbare、台南67和Pi4等3个粳稻品种的抗大化螟转基因株系;Lee等(1999)利用PEG介导法将大豆K units胰蛋白酶抑制剂(SK TI)的cDNA转入粳稻Nagdongbyeo的原生质体,再生转基因植株的后代抗褐飞虱。曾黎琼等(2004)利用农杆菌介导将马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)导入玉优1号、HT-7中;孔维文等(2004)利用农杆菌介导将PT A和马铃薯高赖氨酸蛋白基因(S B401)同时转入超级杂交稻亲本材料1826中。在转凝集素基因水稻研究中,主要是转雪莲花凝集素(G NA)基因,采用基因枪法,英国John Innes Centre(Maqbool等,1999;Rao等,1998;Sudhakar等,1998)把G NA基因导入AS D16、M5、M7、M12、FX92D、Basmati370等籼稻品种中,得到200多株转基因植株,G NA在水稻中呈高水平的组成性表达(用Ubi启动子)或韧皮部专一性表达(用Rssl启动子),转基因植株抗褐飞虱。在我国,傅向东等(1997)用G NA基因枪转化水稻IR72、IR76、珍汕97和秀水11等品种,部分转基因植株子代对褐飞虱有一定抗性;T ang(唐克轩等,1999)通过基因枪介导实现了G NA 基因和X a21基因的共转化,得到了转基因植株。唐克轩等(2003)利用农杆菌介导将半夏凝集素基因(pta)导入粳稻鄂宛105、中花12和籼稻E优532中,获得7个转基因纯系。 1.2 抗病转基因水稻育种 抗病转基因水稻包括转抗病毒基因、抗真菌病害基因和抗细菌病害基因。抗病毒转基因已开展了8种病毒的转基因研究,包括水稻通枯罗病毒(rice tungro disease)、水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged 收稿日期:2005-07-21 作者简介:王彩芬(1968-),女,副研究员,从事水稻花培育种研究。T el:0951-*******E-mail:caifen-68@https://www.doczj.com/doc/126355621.html,
转基因小麦研究进展及前景 摘要：自第一株转基因小麦报道以来，小麦转基因育种研究发展迅速，通过转基因技术实现的小麦遗传转化弥补了经典小麦育种的不足，突破了可利用基因库的限制，取得了可喜的进展。简要介绍了基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法等基因转化方法在小麦遗传转化中的应用，讨论了转基因技术在获得抗除草剂、抗病虫、抗逆、改良品质和雄性不育转基因小麦植株等方面的应用现状及其存在的主要问题与对策。 关键词：小麦；转基因；分子育种；进展 采用远缘杂交技术将小麦野生近缘物种中的有益外源基因导入小麦栽培品种，对其抗性、品质、产量的提高发挥了重要作用。但由于双亲亲缘关系较远造成杂交不结实、杂种不育、杂种后代长期分离、预见性差，使该技术在小麦遗传改良上的应用受到一定限制。 植物转基因技术被证明是进行外源基因定向转移独特而有力的手段，一定程度上补充或改进了传统的育种方法。通过植物遗传转化技术，可以按照需要，将有遗传信息的DNA 片段即目的基因进行人工重组，在离体条件下转入宿主细胞进行复制、表达，定向改造植物，可以打破基因流的界限，而且大大缩短育种周期。小麦是举世公认的最难转化的重要农作物之一，且转基因研究起步较晚，经过许多学者十几年的不懈努力，取得了长足的进展。目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目标涉及到高产、优质、高效、兼抗性及多用途等诸多方面，一批抗逆性（如抗病、抗虫、抗除草剂）转基因作物已进入商品化生产阶段。美国研制成功的世界第一例抗草甘磷除草剂转基因小麦已经通过安全性试验；抗草胺膦转基因小麦、抗咪唑啉酮转基因小麦、高蛋白转基因小麦、抗虫和耐镇草宁除草剂转基因小麦、抗蚜虫转基因小麦、抗小麦黄花叶病毒转基因小麦，以及抗白粉病、赤霉病和黄矮病的转基因小麦正在田间释放[1,2]；高分子量谷蛋白亚基转基因小麦[3]、转Trx-S 基因抗穗发芽小麦新品系已进入中试阶段[4]。近年来，中国在小麦转基因方面也取得了初步的进展，并获得了一批具有抗病虫、抗逆境及改善品质的转基因小麦新材料，部分品系已经进入环境释放阶段。本文概述了小麦转基因研究常用遗传转化技术及其在小麦遗传改良中的应用，讨论了存在的主要问题及采取的应对措施。 1 小麦转基因技术 小麦转基因技术是指用人工方法将外源基因或DNA 导入小麦细胞，使之稳定地整合、表达并遗传的综合技术。小麦转基因技术可根据转化目的基因否需要通过组织培养再生植株分为两大类，第一类需要通过组织培养，常用的方法有农杆菌介导法、基因枪介导法、花粉管通道法等；第二类不需要通过组织培养，如PEG法、电激法等。在小麦遗传改良中应用最广泛的是第一类方法。 1.1 花粉管通道法 中国学者周光宇1974 年提出的DNA 片段杂交假说是花粉管通道法的理论基础，他于1983 年建立了花粉管通道法，该技术利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA 送入胚囊中尚不具备正常细胞壁的合子。利用该法进行基因转移的工作主要集中在中国。1992 年，周文麟等通过花粉管法将C4作物的DNA 导入小麦，获得了具有C4作物若干性状的转“基因”后代[5]。随后，曾君祉等利用该法将带有GUS基因的pBI121 质粒导入小山3号，获得 5株转基因植株，转化率为4.7%[6]。阎新甫等将抗白粉病的大麦DNA导入花76，既获得了符合遗传规律的稳定抗病后代，还明确了抗白粉病基因由一对显性基因控制[7]。Ziberstein A 等将质粒DNA 涂于授粉的柱头，提高了转化频率，并完成后代分析和分子鉴定[8]。成卓敏等将大麦黄矮病毒GPV 株系的外壳蛋白基因导入小麦品种，获得了抗黄矮病毒GPV 的转基
乳铁蛋白的研究进展 摘要：乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的铁结合糖蛋白，是当今乳品界和 食品界最为关注的“热点”之一。本文综述了乳铁蛋白的基本结构、理化性质、生理功能、制备方法及应用前景。 关键词：结构、理化性质、生理功能、制备、应用 乳铁蛋白是一种主要存在于大多数哺乳动物乳汁中的铁结合糖蛋白[1]，属于转铁蛋白家族[2]。1960年首先由Groves从牛乳当中分离获得，因与铁结合呈红色，故又被称为“红蛋白”[3]。大量研究表明LF具有促进铁吸收、广谱抗菌、增强免疫、抗病毒、抗癌等生物学功能；还具有DNA酶、RNA酶、低聚寡糖水解酶、ATP酶以及磷酸酯酶等多种酶的活性。LF 多种功能的发现，使其研究非常活跃，已成为食品界和乳品行业关心的热点问题。 1 乳铁蛋白的基本结构 乳铁蛋白由转铁蛋白演变而来。转铁蛋白包括一大族生物糖蛋白(主要有3种) ，即：血清转铁蛋白，存在于血清和其它胞外液(如乳、脊髓液、精液)中；乳铁蛋白存在于乳汁、泪液、唾液、汗液等分泌液中; 卵转铁蛋白存在于爬行类动物和鸟类的蛋清中。 乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白, 它的分子主体是一个大约有700个氨基酸残基构成的多肽链,相对分子量约为80 ku。该多肽链可以折叠成两个球状叶,一端是氨基末端叶,一端是羧基末端叶,每一叶状结构都含有一个Fe3+和一个碳酸氢阴离子结构部位,每一叶都能高亲和性地可逆的与铁结合。其中, Fe3+结构位于一个很深的裂缝中,当铁离子缺乏时,每一片叶片可以曲折, 使裂缝打开或关闭, 但当多肽链已同铁离子结合时则裂缝处于闭锁状态[4] 。 2 乳铁蛋白的理化性质 2.1 乳铁蛋白的糖基化反应 乳铁蛋白中糖基成分约占7%~11.5%, 天冬酰胺残基可与糖基相连, 由唾液酸与果糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖形成聚—N一乙酰乳糖胺多糖与之相连, 脱去糖基并不影响乳铁蛋白与受体的结合[5]。牛乳铁蛋白的N133,281,368,476,545位点可以进行糖基化反应, 人乳铁蛋白有2个糖基化位点。这些糖化位点都具有异质性, 是由唾液酸的成分及与之相连的糖链大小所引起的。 乳铁蛋白中糖链的作用尚不十分明确, 可能与乳铁蛋白的功能活性、构象稳定性有关, 也可能与免疫原性、微生物结合识别位点有关, 或是与细胞膜上接触信号有关。 2.2乳铁蛋白的配基作用 乳铁蛋白可与多种小分子及生物大分子结合, 如苔盼蓝、免疫球蛋白、血清
转基因水稻简介 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，杂种优势的成功利用使得水稻产量得到了极大的提高，为解决世界范围内的粮食危机做出了极大的贡献。但是，自20世纪80年代以来，杂交水稻的产量就处于徘徊不前的局面。不断提高水稻产量和改良其品质是当前水稻育种的重要任务，这一任务的完成单纯依靠传统的遗传育种是不可能实现的。 80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质、可定向改造植物的遗传性状、外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍、丰富了基因资源等优点而弥补了常规育种方法的不足，得到了前所未有的发展。许多学者在水稻的转基因研究上做了大量工作并取得了很大的进展，为水稻的遗传改良奠定了基础。 转抗虫基因： 害虫是危害我国农业生产的主要限制因素，大量化学农药的使用不但污染环境，而且也使得有益昆虫的数量锐减，害虫的抗药性不断加强。此外，化学杀虫剂使用后的农药残留对人畜都会有严重的危害。因而植物抗虫基因工程成为科学家的研究热点领域之一。由于水稻本身没有足够的抗虫基因，目前研究者利用人工合成或从其它生物中克隆的抗虫基因转化到水稻栽培品种中，提高品种的抗虫性。 在水稻抗虫转基因方面，使用得较多的基因有：苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt)、蛋白酶抑制剂基因(Pin2，SKTI，OC—IAD86，Cp-Ti)、植物凝集素基因(GNA)等，将这些基因导入水稻，可使水稻产生对二化螟虫、三化螟虫、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫及蝗虫、褐飞虱、线虫的抗性。Bt毒蛋白基因是目前使用最广的基因，众多的研究都表明用转基因的方法将Bt毒蛋白基因导入常规水稻可使水稻对螟虫的抗性提高刚。 转抗病基因： 病害(包括真菌病、细菌病和病毒病)是影响我同农业生产的另一类重要限制因素。在我国，大面积发生且危害严重的病害有水稻稻瘟病、纹枯病、白叶枯病，因此，我国科学家在抗病基因工程方面也开展了大量的工作。 转抗逆基因： 逆境是限制植物生长、影响产量形成的重要因素之一。抗逆基因的分离、克隆、转化一直受到科学家们的高度重视。目前已分离出大量的抗逆相关基因，并在抗逆基因的遗传转化中取得了明显的成绩。Hossan等已分离克隆出3个与水稻耐淹能力有关的基因pdc I，pdcⅡ，pdcⅢ，并转入水稻中获得部分转基因植株．Rathinasabathi等将烟草中的CMO基因导入水稻，获得了具有很强抗旱性的转基因水稻．日本村田纪夫将甜菜碱生物合成酶基因codA导入水稻，获得了耐碱性的转基因水稻植株．高倍铁子等将编码大肠甜菜碱生物合成酶基因ktA导入水稻，获得了耐盐性强的转基因水稻植株。