抗体偶联药物研发中的生物分析
李秀立, 陈笑艳, 钟大放*
(中国科学院上海药物研究所, 上海药物代谢研究中心, 上海201203)
摘要: 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂共价偶联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 可以提高抗肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用。ADCs结构具有异质性并且其药物?抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在体内呈动态变化, 其生物分析面临着巨大的挑战, 常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应(ELISA)和液相色谱?质谱分析(LC-MS)。ADCs同其他生物制品一样, 在体内可能会产生抗药抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), 影响其药效、药动学及安全性, 因此有必要评价其免疫原性。本文综述了在ADC研发过程中常见的基于ELISA和LC-MS方法的待测物分析, 包括DAR分布、总抗体、结合型抗体、结合型药物、游离药物以及ATA分析, 可为我国的ADCs研发提供参考。
关键词: 抗体偶联药物; 药物?抗体比值; 免疫原性; 酶联免疫吸附反应; 液相色谱?串联质谱
中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2016) 04-0517-12
Bioanalysis in the development of antibody-drug conjugates
LI Xiu-li, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang*
(Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai Institute of Materia Medica,
Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)
Abstract: Antibody-drug conjugates (ADCs) are complex molecules with cytotoxic small molecular drugs covalently bound to monoclonal antibodies via a linker and can improve the targeted drug delivery with minimizing the systemic toxicity. ADCs are heterogeneous mixtures with different drug-to-antibody ratios (DARs) and the DAR distribution is dynamically changing in vivo, therefore the bioanalysis of the ADCs is challenging. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and LC-MS have been widely used in the ADCs bioanalytical assays. Just like other biotherapeutics, ADCs may elicit the host immune response and produce the anti-therapeutic antibody (ATA), which could affect its efficacy, pharmacokinetics, and safety. It is thereby important to investigate its immunogenicity in the ADC development. In this review, we summarized the ELISA- and LC-MS-based bioanalysis strategies for the development of ADCs, including DAR distribution, the determination of total antibody, conjugated antibody, conjugated drug, free drug, and ATA, with the expectation of providing insights and reference for the ADC development in China.
Key words: antibody-drug conjugate; drug-to-antibody ratio; immunogenicity; enzyme-linked immunosorbent assay; LC-MS
抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂(linker) 共价偶
收稿日期: 2015-09-08; 修回日期: 2015-10-11.
*通讯作者 Tel / Fax: 86-21-50800738, E-mail: dfzhong@https://www.doczj.com/doc/1211489926.html, DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0792联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 用于治疗恶性肿瘤。单克隆抗体可以靶向结合肿瘤细胞表面的抗原, 通过细胞内化作用进入细胞。进入细胞后, 其结构中的小分子药物在溶酶体低pH环境或蛋白酶作用下释放出来, 发挥细胞毒作用。由于单克隆抗体的靶向性, 正常组织细胞内药物浓度较低。因此与传统
的抗肿瘤药物相比, ADC的系统毒性减少[1?3]。
ADC由于自身的优势, 逐渐成为工业界新药研发的热点。目前已经有3个ADC上市: Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, 2000年上市, 由于安全性问题2010年主动撤市)[4]、Adcetris (brentuximab vedotin, 2011年上市)[5]和Kadcyla (trastuzumab emtansine, T-DM1, 2013年上市)。Immunomedics公司的sacituzumab govitecan (IMMU-132) 在2015年进入FDA快速审评通道。截止2013年, 已有30多个ADC处于临床试验, 涉及20多个靶点, 分别针对血液肿瘤和实体瘤[6?8]。目前国内多家制药企业, 如山东齐鲁制药、江苏恒瑞、浙江海正和正大天晴等公司纷纷开展ADC的研究; Li等[9]也合成了多种新型高活性抗CD20抗体偶联药物, 其中2F2抗体的突变体定点偶联MMAE (monomethyl-auristatin E) 而成的ADC体内外抗肿瘤活性提高。
在药物研发过程中, 生物分析对于药动学(PK) 测定、PK/PD关系和安全性评价具有重要意义。随着ADC的研发热潮, ADC生物分析面临的挑战也凸显出来。本文首先概括了ADC生物分析需要考虑的因素, 并总结了基于酶联免疫吸附反应(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 和LC-MS方法的ADC 相关物质的生物分析。
1 ADC生物分析的考虑因素
1.1 ADC的异质性
ADC中抗体与小分子药物通过一段连接臂共价链接, 小分子药物可以通过该连接臂与抗体中的赖氨酸侧链氨基结合, 如T-DM1[10]; 或者与抗体链间的二硫键还原后得到的巯基结合, 如抗CD30的IgG1单克隆抗体cAC10-MMAE偶联物[11,12]; 或者与抗体上特定位点引入的工程化半胱氨酸残基结合, 如THIOMAB-药物偶联物[13,14]。通过前两种形式得到的ADC中小分子药物数目以及连接位置可能会不一致[15], ADC实际为混合物。有文献报道T-DM1的药物与抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在0～8之间, 平均DAR值为3.5[16], 通过链间二硫键还原得到的ADC DAR值通常为偶数[17]。通过抗体特定位点引入工程化半胱氨酸而得到的ADC异质性较低, 如有文献[14]报道可以获得DAR值为2的同源ADC。
1.2 DAR值体内动态变化
ADC中连接臂的化学稳定性、连接位置和溶剂可接触性(solvent accessibility) 等因素均会影响ADC 的稳定性[18]。尽管连接臂在设计时考虑到与靶标结合之前的pH值和蛋白酶等因素, 理论上ADC在血浆中是稳定的, 但是连接臂仍可能会在某些特殊情况下断裂, 小分子药物解离。例如, 以腙为基础的连接臂在血液中性(pH 7.3～7.5) 环境下稳定, 在溶酶体酶或低pH环境中小分子化合物可能会解离[19]; 通过二硫键或者半胱氨酸形成的ADC可能会对内源性含游离巯基的肽类或蛋白比较敏感, 如谷胱甘肽和白蛋白等, 连接臂?小分子药物会转移至谷胱甘肽或白蛋白结构中[18, 20]。小分子药物的解离会改变ADC的DAR值比例或出现新的DAR值ADC, 如抗体链间二硫键还原后得到的ADC在体内可能会出现奇数DAR 值[17, 21]。huC242-DM1 (即Cantuzumab mertansine) 实验中观察到结合型ADC比未结合的抗体清除快, 推测与药物的解离有关系[22], 有文献[23]表明ADC的清除率随DAR值增加而加快; T-DM1的体内研究表明随着时间的推移, T-DM1的平均DAR值逐渐降低[21]。尽管工程化的ADC异质性较低, 但是它在体内也可能会部分解离, 形成异质的混合物。小分子药物的解离和不同DAR值ADC清除率的不同, 造成ADC在体内动态变化。
1.3待测物的选择
对于小分子药物和蛋白类药物, 一般测定原形药物即可了解其暴露量与药效应答(exposure- response, ER) 的关系。但是ADC中同时具有抗体和小分子药物部分, 体内DAR值动态变化, 再加上目前ADC临床数据有限, 难以判断哪一种待测物决定或影响了ADC的ER关系。一般来说, 在ADC研发初期, 尽可能测定多种待测物以了解ADC中各个组成部分的PK特征。这些待测物一般包括: 总抗体(DAR≥0, 包括结合型抗体和游离的抗体)、结合型ADC (结合型抗体和结合型药物) 和游离小分子药物[21, 24]。总抗体的测定可以用于考察其PK特征是否符合一般的抗体PK特征, 不会因为药物结合而发生改变[21]。结合型抗体可以从两个角度进行考察: 测定结合型的抗体或药物, 后者可以提供抗体载药量的直接信息, 结合后者与总抗体的数据, 可以大致评估ADC平均DAR值的变化[21]。游离小分子药物的浓度被认为与其毒性相关, 如果游离小分子药物广泛分布在血浆中, 可能发生脱靶作用, 产生毒性[24]。上述待测物的信息综合起来有助于了解ADC的ER关系。除上述待测物外, DAR值的测定还可以提供ADC体内变化的信息, 有助于选择合适的分析技术[21]。此外, ADC作为生物大分子进入体内后, 可能会引起免疫原性, 产生抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), A TA 可能会导致ADC清除加快或药效降低, 或者ADC被
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ATA带至其他部位产生毒性, 因此在ADC研发过程中有必要评估ATA[21, 24, 25]。
1.4 生物分析平台的选择
传统上, 体内生物大分子的定量分析采用ELISA 方法[26,27], 小分子药物采用LC-MS/MS方法[27]。如上所述, ADC在研发过程中均需要对其抗体部分和小分子药物部分进行生物定量, 因此ELISA和LC-MS/ MS的方法成为ADC分析的常用方法。ELISA方法可以用于抗体和小分子药物测定[15,21,24,28], LC-MS/ MS目前主要用于测定游离小分子[21,24,28]。近年来出现亲和捕获LC-MS/MS方法, 该方法首先采用亲和捕获的方法纯化样品, 随后经过酶消化过程测定代表性肽段或小分子药物, 从而实现对总抗体、结合型抗体和结合型药物的测定[21,29]。与小分子药物的生物分析不同, ADC生物分析中所用的对照品实际为混合物, 且由于ADC的DAR值在生物体内动态变化, 因此所使用的对照品并不能准确反映体内样品的真实浓度[21]。不同DAR值的ADC与实验中捕获试剂或检测试剂的结合能力可能不同, 影响总抗体和结合型抗体分析的准确度[17,23,24,30]。有文献[21]报道, 某抗前列腺1的六跨膜上皮抗原(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 1, STEAP1) 的ADC在DAR值过高或过低时会由于立体位阻或低亲和力而不能被准确测定。目前的生物分析方法尚不能对单个DAR值的ADC进行定量, 为准确测定样品浓度, 应尽量选择对DAR值不敏感的生物分析方法[24]。在分析方法建立时, 可以用纯化或富集的ADC和未结合抗体的对照品验证该方法对DAR值的不敏感性[24]。如果不能获得纯化或富集的ADC,以总抗体分析为例, 可以尝试在体外基质(如血浆) 中37℃孵育ADC一段时间, 假设在该时间内ADC会发生药物解离, 采用LC-MS方法鉴定样品中DAR值分布变化, 然后用不同的总抗体方法测试DAR值分布改变的样品, 如果所有样品测试结果一致, 则该总抗体方法对DAR 值不敏感, 可以准确测定不同DAR值的ADC[21]。
基于ADC的复杂性, Genentech公司[21]、辉瑞公司[15]以及美国药学科学家协会[24]总结了针对ADC研发中的待测物的常用分析方法(表1), 以下将重点介绍各类待测物的生物分析方法及其应用。
2 ADC的生物分析
经典的ELISA方法为首先在载体表面(如96孔板)包被捕获试剂,如重组抗原胞外结构域(extracel-lular domain, ECD)、互补决定区(complementarity determining region, CDR) 的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)、抗人IgG的mAb等, 然后加入待测物样品, 孵育一定时间后, 再加入检测试剂, 如偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 的抗人IgG的mAb、生物素偶联抗CDR的mAb/链霉亲和素偶联HRP, 此时形成一个三明治结构, 再加入酶的底物(如3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) 和反应终止液, 检测特定波长下的吸收度, 计算其浓度(图1)[21]。
LC-MS/MS方法多用于测定小分子化合物, 目前也逐渐用于蛋白大分子的定量。与ELISA方法相比, LC-MS/MS方法对专属性重要试剂的依赖性低, 方法开发和转移相对简单, 且可以同时检测多个候选药物(表2)[31]。对于分子质量大于10 kDa的蛋白类大分子, 一般采用间接法进行定量, 即检测酶切产生的一条或多条特异性肽段, 用以表征蛋白浓度(图2)。在样品预处理过程中, 首先利用蛋白沉淀法提取蛋白或利用亲和捕获的方法富集待测物, 随后进行酶切和LC-MS/MS检测[31,32]。该方法中内标可选择稳定同位素标记(stable isotope labeled, SIL) 的蛋白、两端添加3～6个氨基酸的SIL特异性肽段、SIL 特异性肽段或未标记的蛋白/肽段类似物, 不同的内标在样品处理过程中加入的时间不同, 对样品处理
Table 1Analytes commonly assessed for antibody-drug conjugates. ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay; HIC: Hydrophobic interaction chromatography; PD: Pharmacodynamics; PK: Pharmacokinetics; DAR: Drug-to-antibody ratio
Analyte type Analyte detail Analysis method Objective
in vitro and in vivo DAR distribution DAR Affinity capture LC-MS, Affinity
capture HIC
Characterize DAR changes in serum/plasma;
Identify ELISA reagents
Total Antibody DAR ≥ 0 ELISA, Affinity capture LC-MS/MS Evaluate the protein component of ADC;
Characterize if it has the general PK
characteristics of an antibody Conjugated antibody DAR ≥ 1 ELISA, Affinity capture LC-MS/MS Evaluate the conjugate exposure Antibody conjugated drug Drug conjugated to antibody Affinity capture LC-MS/MS, ELISA Evaluate the conjugate exposure
Free drug Unconjugated drug Competitive ELISA, LC-MS/MS Assess safety characteristic
Anti-therapeutic antibody (ATA) Antibodies directed against antibody
component of ADC, linker or drug
Bridging ELISA
Evaluate safety, relationship with PK/PD
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Figure 1 ELISA assays of total antibody (A), conjugated antibody (B), conjugated drug (C) and free drug (D). ADC: Antibody-drug conjugates; anti-CDR: Anti-complementarity determining region; HRP: Horseradish peroxidase; ID: Idiotype; mAb: Monoclonal antibody; SA-HRP: Streptavidin-horseradish peroxidase
Table 2 Comparison of LC-MS/MS and ELISA for peptide/protein quantitation
Item
LC-MS/MS
ELISA
Antibody requirement Usually not required, or one antibody is required for affinity capture
Two antibodies required Development time Short, days to weeks Long, weeks to months
Specificity High Low to high, depending on cross-reactivity Dynamic range
103
?105
Usually 102
Variability and interference
Low; less susceptible to interference from endogenous target and anti-drug antibody High; susceptible to interference from endogenous target and anti-drug antibody Sensitivity ng ·mL ?1?μg ·mL ?1 pg ·mL ?1 Throughput Low to moderate
High
Assay transferrable Relatively easy to transfer between matrix and species Matrix and species selective Catabolism information
Obtainable
Unobtainable
Figure 2 Affinity capture LC-MS/MS. IS: Internal standard;
SIL: Stable isotope-labeled
过程的校正作用也不同[31?33]。亲和捕获LC-MS/MS 方法测定ADC 的相关捕获试剂、检测试剂及内标见表3。目前在LC-MS/MS 法测定生物大分子方面尚没有相关法规, 关于其方法开发和验证可以参见美国药学科学家协会发表的白皮书[32]。 2.1 DAR 分布
ADC 在体内随着小分子药物的解离或不同DAR
值ADC 清除率的不同, 其DAR 值分布也在发生变化。研究DAR 值分布有助于了解ADC 的整体命运, 为ADC 体内生物转化提供理论依据。以上所说的ELI SA 和LC-MS/MS 方法并不能测定DAR 值。UV/VIS 光谱广泛用于测定抗体浓度和DAR 值[34]。Yu 等[35]利用LC-MS 方法和紫外分光光度法测定了通过赖氨酸侧链残基偶联的抗Her2抗体-SMCC [N -琥珀酰亚胺- 4-(N -马来酰亚胺基)环己烷-1-羧化物]-DM1, 但是该方法为缓冲液体系, 不能适用于血浆/血清等复杂生物体系。Genentech 公司的科学家开发出两种可以用于测定血浆/血清样品中DAR 值分布的方法: 亲和捕获LC-MS 方法和亲和捕获疏水作用色谱 (hydrophobic interaction chromatography, HIC) (图3)[21,
29,
36], 这两
种方法均可检测完整的分子量, 用不同DAR 值ADC 去卷积化后的峰面积表征不同DAR 值的相对丰度。
亲和捕获LC-MS 方法利用直接或间接固定在磁珠上的抗原、抗小分子药物的抗体来捕获目标ADC, 随后经过洗涤和洗脱等过程, 样品进行毛细管柱
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Table 3Reagents used for ADC affinity capture LC-MS/MS assay
Objective Capture probe Internal standard Detection specie Total antibody Generic: protein A/G, anti-Fc mAb; Specific: antigen, anti-ID mAb Extended SIL-universal peptide Universal peptide Conjugated drug Generic: protein A/G, anti-Fc mAb; Specific: antigen, anti-ID mAb SIL-drug Drug
Conjugated antibody Anti-drug mAb Extended SIL-universal peptide Universal peptide
Figure 3Antibody-drug conjuates drug-to-antibody ratio dis-tributions characterization. A: Affinity capture LC-MS; B: Affinity capture HIC. ECD: Extracellular domain
LC-MS分析(图3A); 由于本方法在变性条件下完成, 非共价连接的轻链和重链会分开, 因此本方法只适用于含有链间二硫键且共价结合的ADC, 包括通过赖氨酸侧链氨基或工程化半胱氨酸连接而成的ADC[21,36]。使用本方法的前提条件为在检测过程中各DAR值ADC的离子化效率相同或相似, 这样各DAR的峰面积才能用于表征各自的相对丰度[21,36]。Genentech的科学家利用此方法研究了通过工程化的半胱氨酸分别引入到抗体的重链和轻链上所得的两种mAb A-vc (valine-citrulline, 缬氨酸?瓜氨酸)-MMAE ADC (DAR 值为2) 在食蟹猴体内的DAR值变化[36]。结果显示给药后21天, 血浆内重链ADC以DAR1为主, 而轻链ADC仍以DAR2为主, 这表明连接臂的位置影响ADC的稳定性, 连接在重链的药物更容易解离[36], 这与之前的研究结果类似[18]。偶联位置影响ADC的稳定性, 推测可能与马来酰亚胺交换和丁二酰亚胺环水解机制有关, 前者使得小分子药物解离, 后者则通过抑制马来酰亚胺交换使得ADC保持相对稳定[18]。T-DM1的体外和体内实验结果均表明随着时间的延长, T-DM1在血浆中高DAR值ADC相对丰度降低, 低DAR值ADC相对丰度增加, 平均DAR值降低[21,36]。工程化定点合成的抗MUC16 TDC在食蟹猴、大鼠和人血浆中37℃孵育96 h后, 其DAR2比例由初始的93%降到35%～45%, DAR1由初始的7%升高到43%～48%, DAR0增加到13%～17%; 而在PBS缓冲液中DAR值没有发生改变, 表明抗MUC16 TDC在血浆中存在药物解离现象[29]。
对于通过巯基链接的ADC, 变性条件如LC-MS 条件下, 抗体的轻链与重链分开, 此时仅能获得分开后的轻链或重链的分子量和相对丰度, 推测得到平均DAR值[21]。与亲和捕获LC-MS方法不同, HIC和亲和捕获HIC是在非变性条件下完成的, 因此可以测定通过链间二硫键还原形成的ADC的完整分子量。Boswell等[37]利用HIC研究了两种抗STEAP1 ADC标准品的DAR值分布。亲和捕获HIC是将稀释后的样品用蠕动泵泵入偶联了ECD或抗CDR抗体的小柱, 在该过程中ADC被捕获; 随后经过洗涤和洗脱等过程获得富集了ADC的样品, 进行HPLC检测[21,36] (图3B)。该方法与亲和捕获LC-MS方法相比, 灵敏度较低(μg·mL?1级别)。Genentech科学家利用亲和捕获HIC方法研究某ADC (mAb B-vc-MMAE, DAR值为2和4) 在体外血浆中的稳定性, 结果显示37℃孵育48 h后, 丰度最高的DAR4呈降低趋势, 而新出现的DAR1和DAR3呈增加趋势, 在后面的时间点中DAR1丰度相对较高[36]。
由于HIC与质谱离子化不匹配, 因此逐渐趋向于利用纳喷雾或中性条件下采用分子排阻色谱?质谱方法获得链间二硫键还原形成的ADC的完整分子量[38, 39]。Seattle Genetics公司的科学家利用非变性分子排阻色谱(size exclusion chromatography, SEC) 除盐结合LC-MS方法测定了链间二硫键还原形成的两种ADC的完整分子量, 该方法测试结果与HIC结果无显著性差异, 但是该方法尚不能用于血浆/血清体系[38]。离子淌度质谱(ion mobility mass spectrometry, IMMS) 也被越来越多的用于DAR分布研究[40,41], 如非变性MS (native MS) 协同离子淌度(ion mobility) 可以用于测定T-DM1的DAR分布和平均DAR值[41]。分子排阻色谱?质谱方法、离子淌度质谱等方法目前尚未应用于生物样品分析, 今后与亲和纯化过程结合后, 有望用于血浆/血清等生物样品分析研究。
2.2 总抗体分析
总抗体分析测定样品中所有的抗体, 包括结合型的抗体(DAR≥1) 和未结合的抗体(DAR=0), 可
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以用于评估ADC是否符合单克隆抗体的一般PK特性。如果总抗体分析表明ADC快速清除, 则提示ADC不能与靶标有效结合, 不适用于后期开发。
总抗体分析传统上采用ELISA方法(图1A)。对于非临床PK和TK实验, 由于专属性试剂难以获得, 通常采用通用型分析方法, 即捕获试剂和检测试剂均为抗人IgG的抗体。这些经过亲和纯化后的试剂往往已商业化并且不会与非临床生物基质发生交叉反应。如Xie等[22]利用山羊抗人IgG抗体作为捕获试剂, 利用偶联有HRP的驴抗人IgG抗体作为检测试剂, 测定了huC242-DM1在小鼠血浆中的浓度, 其定量下限可以达到10 ng·mL?1; 猴血清吸附后的抗人IgG的抗体可以用于测定猴血浆/血清中抗体的浓度, 但是不能用于测试临床样品[42]。
对于临床样品, 一般需要用到重组抗原、抗ID (idiotype) 的抗体或抗CDR的抗体作为捕获试剂, 用抗人IgG的抗体、抗ID的抗体或抗CDR的抗体作为检测试剂, 以最大程度的减少基质蛋白的干扰[21]。如Gemtuzumab ozogamicin中总抗体的测定利用CD33抗原作为捕获试剂, 用鼠源抗人IgG4-HRP作为检测试剂, 检测其临床II样品[43]。T-DM1总抗体分析利用重组HER2 ECD作为捕获试剂, 用山羊抗人IgG Fc 片段的F(ab')2-HRP偶联物作为检测试剂, 检测非临床或临床样品, 其定量下限为0.16 ng·mL?1[16, 28]。Hamblett等[23]首先采用抗cAC10的抗体来捕获抗体cAC10, 用小鼠抗人IgG抗体偶联HRP作为检测试剂; 随后类似的方法也用于小鼠血浆中抗PSMA抗体-DM1 ADC的药动学测试[44]。为测定小鼠中1F6- C4v2-bac (bromoacetamide caproyl, 溴乙酰胺己酰)- MMAF (monomethyl auristatin F) 抗体1F6-C4v2的总浓度, 采用抗1F6 ID的抗体捕获1F6抗体, 用抗MMAF的抗体偶联生物素/链霉亲和素偶联HRP作为检测试剂[45,46]。为测定大鼠血浆中抗STEAP1抗体- vc-MMAE ADC中抗体的总浓度, 采用抗ID的抗体5093或驴抗人Fc的抗体作为捕获试剂, 利用偶联有HRP的山羊抗人IgG或Fc的抗体作为检测试剂[37]。
近年来出现了亲和捕获LC-MS/MS检测总抗体的方法(图2A和表3), 其融合了ELISA和LC-MS/ MS的特点, 首先用捕获试剂(如蛋白A、重组抗原、抗ID抗体等) 来亲和富集抗体, 酶切水解后, 利用LC-MS/MS测定专属性肽段进行定量分析。类似的亲和捕获LC-MS/MS方法已经用于多种单克隆抗体药物的定量[47?51]。
无论利用ELISA方法还是利用LC-MS/MS方法测定总抗体浓度, 均需要保证体内各DAR值ADC均能被准确检测。DAR值高的ADC可能会由于小分子药物的立体位阻效应, 影响抗体与捕获试剂或检测试剂的结合。Stephan等[17]研究了不同ELISA方法对两种具有异质性的ADC[抗CD22抗体-MCC (succinimidyl-4-(N-maleimidomethly)cyclohexane-1- carboxylate, 琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物)-DM1和抗CD22抗体-MC (maleimido-caproyl, 马来酰亚胺己酰)-MMAF]中总抗体测定的影响。实验中平均DAR值不同的ADC分别用CD22 ECD或兔抗人IgG (Fc) 抗体作为捕获试剂, 用山羊抗人IgG (Fc)-HRP或抗人IgG F(ab')2-HRP作为检测试剂, 结果显示抗CD22抗体-MCC-DM1除通用型人IgG (Fc) ELISA形式外, 其他3种方法均对DAR 值敏感, 推测抗体上偶联的DM1数量增加可能会影响抗体与抗原或检测试剂抗人IgG F(ab')2-HRP的结合; 但是上述4种检测方式对于抗CD22抗体-MC- MMAF的DAR不敏感。
鉴于不同ADC对不同形式的ELISA方法敏感度不一样, 因此在方法开发阶段, 可以比较未结合的抗体、纯化或富集的DAR组分以及平均DAR ADC 对照品的回收率, 如果回收率的偏差在±20%之内, 则表示该方法可以用于PK样品分析, 因为20%的差异不会显著影响PK参数的计算[21,24,30]。Kozak 等[52]研究发现, 与传统的ELISA方法相比, 半均相(semihomogeneous assay, SHA) ELISA分析对DAR值最不敏感, 各DAR值ADC回收率偏差接近且均在20%之内。在SHA ELISA中, 将ADC样品添加至捕获试剂(如生物素化的ECD、抗ID的抗体或抗人IgG 抗体) 和检测试剂(抗人IgG-HRP) 的混合溶液中, 孵育一段时间后形成三明治结构, 转移部分孵育液至链霉亲和素或中性亲和素包被的板子中, 加入底物进行检测; 不同分析方式的回收率分别为通用型SHA>专属性SHA>通用型ELISA>专属性SHA[52]。但是不同的ADC可能会对不同的试剂和检测方式响应不同, 因此需要针对具体情况选择合适的试剂和检测方式。
2.3 结合型ADC测定
测定结合型ADC有两种方式: 测定结合型的抗体, 其DAR≥1; 或者测定结合型的小分子药物, 后者可以反映结合在抗体上的小分子药物的变化情况, 与总抗体的数据相结合, 可以用于评估体内基质中ADC平均DAR值的变化。Genentech公司的科学家认为在技术可行时, 优先选择测定结合型小分子药
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物。
2.3.1 结合型抗体测定结合型抗体即与小分子药物结合的抗体, 其DAR≥1。与总抗体相比, 其不包含未结合抗体。结合型抗体的测定多采用ELISA方法(图1B), 利用抗小分子药物的抗体作为捕获试剂, 用重组抗原、抗CDR mAb、抗人IgG抗体作为检测试剂[16,17,22,28,37,53,54]。如, 在T-DM1 PK分析中, Genentech公司的科学家用鼠源抗DM1的抗体作为捕获试剂, 用重组HER2 ECD-生物素/链霉亲和素- HRP作为检测试剂; 该方法对平均DAR在1.90～4.10内的ADC均能准确检测[16, 28]。Hu等[55]用抗DM1抗体作为捕获试剂, 用猴血清吸附后的羊抗人IgG- HRP作为检测试剂, 检测猕猴血清中T-DM1的含量。Xie和Kovtun等[22, 53]利用鼠源抗DM1的抗体作为捕获试剂, 用驴抗人IgG抗体-HPR作为检测试剂, 检测huC242-DM1。Advani等[54]利用兔抗卡奇霉素的多克隆抗体捕获CMC-544 ADC, 用生物素化的CD22-Fc/链霉亲和素-HRP作为检测试剂。
与通用型检测试剂(如抗人IgG抗体) 相比, 专属性检测试剂可以减少背景干扰, 但是有时候会低估结合型ADC浓度。如, Xu等[36]研究了利用工程化半胱氨酸产生的Tmab-MC-vc-PAB-MMAE (DAR4, Tmab重链和轻链上各有两个MMAE)在食蟹猴体内的总抗体和结合型抗体的PK。针对结合型抗体作者考察了通用型和专属性ELISA两种方式, 采用抗MMAE的抗体作为捕获试剂, 用山羊抗人IgG抗体(通用型) 或HER2 ECD (专属性) 作为检测试剂。结果显示, 通用型ELISA检测到的结合型抗体浓度与总抗体浓度相近, 而专属性ELISA测得的浓度比通用型低。利用亲和捕获LC-MS对血浆样品中的DAR 分布研究发现, 在后期时间段ADC以DAR3为主要存在形式, DAR0极少。由于DAR0代表了总抗体与结合型抗体之间的差异, 因此认为在本研究中通用型ELISA方法测定的数据更为准确。
理论上利用抗小分子药物的抗体作为捕获试剂的方法对DAR值不太敏感, 能够捕获至少连接一个小分子药物的ADC。但是实际中, 每个抗小分子药物抗体亲和力不同, 捕获低DAR值ADC的能力也不同, 有时会因为结合能力低而低估结合型抗体的浓度。Stephan等[17]利用抗DM1的抗体捕获抗CD22抗体-MCC-DM1, 用生物素化CD22-ECD/链霉亲和素-HRP或山羊抗人IgG (Fc) 抗体偶联HRP作为检测试剂, 每种检测方法对富集的不同DAR的ADC结果相近, 推测抗DM1的抗体对抗体载药量不敏感, 抗体上有一个DM1即可有效捕获。与抗CD22抗体- MCC-DM1相反, 用抗MMAF的抗体捕获抗CD22抗体-MC-MMAF后, 用生物素化CD22-ECD/链霉亲和素-HRP或山羊抗人IgG (Fc) 抗体偶联HRP作为检测试剂, 结果显示每种检测方法对富集的不同DAR 的ADC结果差异较大,推测实验中所用抗MMAF的抗体依靠亲和力来捕获MMAF ADC, DAR低的ADC 不容易被捕获。因此, 在方法建立时需要筛选合适的抗小分子药物的抗体, 保证该抗体捕获不同DAR (DAR≥1) 结合型抗体的能力相同。
目前尚未有利用亲和捕获LC-MS/MS测定结合型抗体的报道, 但是从理论上来说可行。与ELISA 一样, 首先用抗小分子药物的抗体亲和捕获结合型抗体, 随后经过酶切消化后利用LC-MS/MS检测特异性肽段(图2和表3)。无论选择ELISA方法还是选择亲和捕获LC-MS/MS方法, 均需要选择合适的抗小分子药物的抗体, 保证能够捕获所有DAR≥1的ADC, 且回收率偏差在±20%以内[24]。
2.3.2 结合型药物测定与结合型抗体不同, 结合型药物是从小分子药物的角度去衡量结合型ADC, 用于测定所有结合在抗体上的小分子药物的总浓度。这项分析能够直接提供抗体载药量的信息, 并对抗体载药量的变化高度敏感。结合型药物的测定可以选用ELISA方法, 也可以采用亲和捕获LC-MS/MS方法。ELISA方法测定结合型药物, 捕获试剂与检测试剂的选用恰好与结合型抗体ELISA方法相反: 结合型药物分析中选用抗ID抗体、抗原ECD或抗人IgG 抗体捕获ADC中的抗体部分, 用抗小分子药物的抗体作为检测试剂(图1C)[14,17,45,56,57]。Tolcher等[56]利用抗huC242抗体作为捕获试剂捕获huC242-DM1, 用生物素化抗DM1抗体/链霉亲和素-HRP检测huC242-DM1。Stephan等[17]用不同的捕获试剂如CD22 ECD、山羊抗人IgG (Fc) 或F(ab')2捕获抗CD22抗体-MCC-DM1或抗CD22抗体-MC-MMAF, 分别用抗DM1或抗MMAF的抗体进行检测, 研究发现信号与ADC中载药量呈正比。Sanderson等[57]用抗ID cAC10抗体作为捕获试剂, 用抗MMAE抗体作为检测试剂, 评价不同DAR值抗CD30 ADC的稳定性, 研究结果表明DAR2 ADC的信号比DAR4 ADC 信号低。
亲和捕获LC-MS/MS方法中首先需要用捕获试剂(如蛋白A、抗ID抗体、抗原等) 捕获结合型ADC, 随后切除连接臂, 进行LC-MS/MS分析(图2和表3)[21,58]。因为实验中需要切除连接臂, 因此该方法只
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适用于连接臂可通过酶切除或化学切除的ADC, 不适用于连接臂不可切除的ADC, 如T-DM1[21,28]。利用通用型试剂如蛋白A、蛋白酶等, 可以快速比较相同连接臂不同抗体组成的ADC[21]。Genentech公司的科学家报道了一例利用亲和捕获LC-MS/MS方法测定抗STEAP1 ADC中结合型小分子药物的案例, 数据显示在食蟹猴血浆中孵育96 h后结合型药物降低30%, 该结果与DAR分布变化相一致[21]。
与总抗体和结合型抗体分析类似, 结合型小分子药物分析方法的建立也需要考虑试剂和分析形式对DAR的敏感性, 保证小分子药物被准确测定[24]。
2.4 游离小分子药物测定
游离小分子药物是从抗体中解离下来的药物部分。游离小分子药物的测定可以采用竞争性ELISA方法(图1D)[22, 43, 53, 54, 56, 57]和LC-MS/MS方法[18, 25, 28, 37, 45, 58, 59]。竞争性ELISA方法可以用BSA-小分子药物包被板子[53, 56], 也可以用抗小分子药物抗体包被板子[57]。以游离DM1的测定为例, 样品首先利用乙腈沉淀去除蛋白, 含有游离DM1的上清液与生物素化鼠源抗DM1抗体混合, 随后转移至包被有BSA-DM1的板子中, 样品中DM1会与包被的BSA-DM1竞争性结合抗DM1抗体, 样品中DM1浓度越高, BSA-DM1结合的DM1抗体越少, 最后通过检测试剂链霉亲和素-HRP检测得到的信号越低[53]。Sanderson等[57]测定了cAC10-Val (valine, 缬氨酸)-Cit (citrulline, 瓜氨酸)-MMAE体内样品在组织蛋白酶B作用下水解得到的游离MMAE的浓度, 水解样品与HRP-MMAE 混合后, 转移至包被有抗MMAE抗体的96孔板, 样品中游离MMAE浓度与检测信号呈反比。
ADC中抗体部分的分解代谢一般不涉及CYP450酶, 但是小分子药物可能会在CYP450酶作用下产生代谢物。与ELISA方法相比, LC-MS/MS方法在检测小分子药物的同时, 可以监测代谢物的产生并对其定量。Boswell等[37]利用LC-MS/MS方法研究了抗STEAP1抗体-vc-MMAE(ADC)和巯基-抗STEAP1抗体-vc-MMAE (TDC)在大鼠体内游离MMAE的浓度, 样品采用蛋白沉淀方法, 内标选用MMAF, 结果表明ADC中游离MMAE的浓度比TDC高, 可以合理解释尽管两者总抗体结果相似, 但是ADC结合型抗体浓度比TDC结合型抗体浓度低的现象。LC-MS/MS 样品预处理过程可以采用蛋白沉淀和/或固相萃取(SPE)方法, 随后进行LC-MS/MS分析。有时根据待测物的结构性质添加合适的样品预处理步骤, 有助于准确定量分析。例如, T-DM1结构中DM1解离后含有游离巯基, 巯基可能会与自身或基质中含巯基的谷胱甘肽、白蛋白等结合形成二硫键, 影响检测分析。在DM1的样品预处理过程中, 首先采用3-(2-羧乙基) 膦还原样品中的二硫键, 随后用乙腈沉淀蛋白, 为防止自身产生二聚体, 取上清液用N-乙基马来酰亚胺衍生化, 衍生化样品进行SPE后即可进行LC-MS/MS分析[28]。实验中发现DM1的浓度在第一个给药时间点浓度最高, 与理论曲线不同, 推测可能是在还原过程中T-DM1中少量通过半胱氨酸残基或氧化硫醚连接的DM1从抗体部分解离, 高估了样品中游离DM1的浓度[28]。近期Genentech公司的科学家用离子排阻色谱协同反相HPLC进行在线二维色谱分析, 测试了ADC生物样品中的游离小分子和小分子相关杂质, 该方法不需要样品预处理过程[60]。
游离小分子药物不具有三级结构, 可能会对捕获试剂和检测试剂产生立体位阻, 建立针对小分子的ELISA方法相对困难[28]。在条件允许下, 建议使用LC-MS/MS方法测定ADC中游离小分子药物, 方法验证可以参考小分子化合物的LC-MS/MS方法指导原则。
2.5 ATA分析
同其他生物制品一样, ADC进入生物体内后也可能会引起免疫原性, 产生响应的抗体(ATA), 影响其安全性、PK和药效。A TA有多种研究平台, 包括桥连ELISA (bridging ELISA, 药物用于捕获, 标记的药物用于检测)[61?63]、电化学发光分析(electrochemilu-minescence, ECL, MSD)[25, 62, 64]、放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation, RIP)[65]、表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) 等[62], 每种方法都有自己的优缺点[66], 现在以桥连ELISA和ECL方法最为常用。目前FDA和工业界均发布了免疫原性研究的指导原则或白皮书[67?72], ADC药物的ATA分析方法验证可以遵从上述指导原则。在MSD应用中,通常将酸处理或稀释后的样品与两种标记的ADC (生物素标记的ADC和钌标记的ADC, 前者用于捕获ATA, 后者用于检测ATA) 孵育, 形成三明治结构, 转移孵育液至链霉亲和素包被的板子中, 通过链霉亲和素?生物素的相互作用, 样品中的A TA会被间接固定在板子上, 清洗板子后加入读取液(read buffer) 即可检测样品信号(图4A)。A TA可能会产生自ADC中的抗体部分、连接臂部分或小分子药物部分, 因此在ATA 分析中可能会需要多个阳性抗体作为阳性对照[73]。
A TA分析通常分为3步:首先是筛选分析(图4A), 实验允许有5%的假阳性结果存在, 如果样品响应高
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Figure 4 Bridging ELISA for immunogenicity assay. A: Screening assay; B: Specificity assay, excess unlabeled ADC competes with
labeled ADC for ATA leading to reduction of signal; C: Epitope characterization with competition method, excess unlabeled mAb or BSA-linker-drug competes with labeled ADC for ATA; D: Epitope characterization with detection method. BSA: Bovine serum albumin
于筛选阈值 (screening cut point), 样品可能含有A TA, 需进行下一步的验证分析。在验证实验中, 采用竞争性ELISA 方法 (图4B), 将筛选出来的样品与过量的ADC 药物预孵育一段时间, 如果样品响应降低百分比高于验证阈值 (confirmatory cut point), 表明该样品为阳性样品, 含有ATA, 需要鉴定ATA 的效价 (titer) 和ATA 产生部位。在ATA 效价分析中, 将阳性样品稀释成一系列浓度, 当稀释后样品响应等于筛选阈值时, 此稀释倍数即为效价。ATA 产生部位鉴定实验可以分为两种: 一种采用竞争性ELISA 方法 (图4C), 样品和两种标记的ADC 与未标记的抗体或BSA-连接臂?小分子药物预孵一段时间, 若未标记抗体孵育后的样品响应降低百分比高于方法验证中的验证阈值, 则表明ATA 产生自抗体, 同样的情况适用于连接臂?小分子药物[25,
61]; 另一种方法采用检测方法
(图4D), 即样品和生物素标记的ADC 与钌标记的抗体或者钌标记的BSA-连接臂?小分子药物孵育, 如果钌标记抗体孵育样品的响应高于方法验证中的筛选阈值, 则提示其产生自抗体部分, 同样的情况适用于连接臂?小分子药物[25]。Genentech 公司的科学家发现, 食蟹猴血清样品中ATA 效价高 (效价4) 的ADC 浓度远低于ATA 效价低 (效价0?2) 的样品浓度, 提示ATA 会影响ADC 的PK 特性[61]。T-DM1临床试验中鉴定得到44个产生ATA 的患者, 竞争性ELISA 实验表明其中37个患者的ATA 不会与Tmab 竞争, 提示样本中的ATA 可能产生自连接臂?小分子药物部分或者T-DM1中抗体与Tmab 存在差异的部位[61]。Amgen 公司的科学家发现样本中同时存在抗小分子药物抗体和抗mAb 的抗体时, 竞争性ELISA 会出现假阴性结果, 而检测性ELISA 则会准确鉴定抗体结果, 后者被认为方法更好[25]。因此, 在ATA 分析方法开发时, 需要选择合适的试剂和分析方法准确鉴定样本中的ATA 。
值得注意的是, 由于不同种属产生抗体的免疫机制不同, 在临床前种属中发现的A TA 并不能代表人体内会出现ATA, 但是临床前样本ATA 分析有助于了解ADC 的PK 和安全性。 3 结论与展望
由于ADC 自身结构的复杂性以及体内动态变化特性, 使得其生物分析面临多重挑战。目前临床数据有限, 难以判断哪一种待测物决定或影响了ADC 的ER 关系, 因此在ADC 研发过程中一般会从多个角度考察ADC 的体内过程, 包括总抗体分析、结合型ADC 、游离小分子药物和免疫原性分析。本文总结了利用ELISA 方法和亲和捕获LC-MS/MS 方法测定ADC 中总抗体、结合型抗体、结合型小分子药物、游离小分子药物以及免疫原性ATA 的方法, 以及利用亲和捕获LC-MS 和HIC 测定体内外样品中DAR 分布的研究。ELISA 方法和亲和捕获LC-MS/MS 方法开发过程中均需要考察关键试剂 (如捕获试剂和检测试剂) 和检测形式 (如通用型、专属性) 对DAR 值的敏感度, 可以利用未结合的抗体、纯化后单一DAR 值的ADC 或是富集之后平均DAR 值不同的ADC 进行比较, 选择合适的试剂和检测形式, 确保各DAR 值能被准确检测。目前对利用ELISA 和亲和捕获LC-MS/MS 方法测定ADC 尚没有相关法规, 可以借鉴配体结合分析和小分子LC-MS/MS 的法规进
行科学完整的方法学验证。尽管现有的文献中多用ELISA 方法进行抗体分析, 但亲和捕获LC-MS/MS 由于其自身的特点 (如开发时间短, 可以同时检测多个待测物等) 将会被广泛利用。
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思考题 *生物药物的特点？ 答：组成结构复杂，具有严格的空间构像，以维持其特定的生理功能。要测定分子量（组分相同的、分子质量不同、活性不同）要测定生物活性（和药效相关）要效价测定（除含量测定，要效价测定或酶活力测定表明有效成分含量）要确定结构（如氨基酸序列分析） *生物制品的质量检定包括哪些方面？ 答：理化测定.安全检定效力检定 *生物药物常用的定量方法有哪些？ 答：酶法电泳法理化测定生物检定法 *什么是电泳？如何对其分类，分别有哪些？ 答：电泳是指带电粒子在电场力的作用下与自身所带相反的电荷方向移动 分类。按支持物可分为：纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。按凝胶形状可分为：水平平板电泳，圆盘柱状电泳，垂直平板电泳。 *影响电泳迁移率的因素包括？ 答：，带电粒子的性质，电子带静电荷越多，越接近球形，电泳速度快 ，电场强度，越强速度越快溶液的值，对于蛋白质来说，当接近等电点，速度越快，溶液离子强度，离子强度越小，速度越快电渗作用 *血清蛋白常用什么电泳技术分离？核酸常用什么电泳技术分离？ 答：血清蛋白：常用醋酸纤维素薄膜电泳；核酸：琼脂糖电泳 *为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用最广泛的凝胶电泳技术？ 答：聚丙烯酰胺聚合物分子解离基因量很少，故电渗作用小，对样品吸附作用小，容易制备，并可在吸收机械性较好，孔隙可以调节凝胶比重实现可调，具有可拉性分析筛效应，一定范围对热稳定，无色透明，容易观察，丙烯酰胺较纯，可精制，污染小聚丙烯酰胺凝胶在没有吸收利于样品蛋白质电泳后的扫描检测。 *电泳用于测定？其中的作用是什么？ 答：主要是用来测定蛋白质的分子量，其中作用有两个：，消除不同蛋白表面表面电荷效应，引起蛋白构象改变，消除蛋白质的结构效应. *核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于哪三个因素？ 答：琼脂糖浓度，核酸分子的大小，核酸的形状 *分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有什么效应与什么效应？ 答：分子筛效应和电荷效应 *聚丙烯酰胺凝胶电泳包括连续系统和不连续电泳，其定义和区别分别是什么？ 答：.连续系统：缓冲液的离子成分、、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 .不连续系统：缓冲液离子成分、、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 区别：不连续系统能使稀样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分离条带清晰度以及分辨率。 *什么是分子筛效应？ 答：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的
抗体偶联药物研发中的生物分析 李秀立, 陈笑艳, 钟大放* (中国科学院上海药物研究所, 上海药物代谢研究中心, 上海201203) 摘要: 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂共价偶联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 可以提高抗肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用。ADCs结构具有异质性并且其药物?抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在体内呈动态变化, 其生物分析面临着巨大的挑战, 常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应(ELISA)和液相色谱?质谱分析(LC-MS)。ADCs同其他生物制品一样, 在体内可能会产生抗药抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), 影响其药效、药动学及安全性, 因此有必要评价其免疫原性。本文综述了在ADC研发过程中常见的基于ELISA和LC-MS方法的待测物分析, 包括DAR分布、总抗体、结合型抗体、结合型药物、游离药物以及ATA分析, 可为我国的ADCs研发提供参考。 关键词: 抗体偶联药物; 药物?抗体比值; 免疫原性; 酶联免疫吸附反应; 液相色谱?串联质谱 中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2016) 04-0517-12 Bioanalysis in the development of antibody-drug conjugates LI Xiu-li, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang* (Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China) Abstract: Antibody-drug conjugates (ADCs) are complex molecules with cytotoxic small molecular drugs covalently bound to monoclonal antibodies via a linker and can improve the targeted drug delivery with minimizing the systemic toxicity. ADCs are heterogeneous mixtures with different drug-to-antibody ratios (DARs) and the DAR distribution is dynamically changing in vivo, therefore the bioanalysis of the ADCs is challenging. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and LC-MS have been widely used in the ADCs bioanalytical assays. Just like other biotherapeutics, ADCs may elicit the host immune response and produce the anti-therapeutic antibody (ATA), which could affect its efficacy, pharmacokinetics, and safety. It is thereby important to investigate its immunogenicity in the ADC development. In this review, we summarized the ELISA- and LC-MS-based bioanalysis strategies for the development of ADCs, including DAR distribution, the determination of total antibody, conjugated antibody, conjugated drug, free drug, and ATA, with the expectation of providing insights and reference for the ADC development in China. Key words: antibody-drug conjugate; drug-to-antibody ratio; immunogenicity; enzyme-linked immunosorbent assay; LC-MS 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂(linker) 共价偶 收稿日期: 2015-09-08; 修回日期: 2015-10-11. *通讯作者 Tel / Fax: 86-21-50800738, E-mail: dfzhong@https://www.doczj.com/doc/1211489926.html, DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0792联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 用于治疗恶性肿瘤。单克隆抗体可以靶向结合肿瘤细胞表面的抗原, 通过细胞内化作用进入细胞。进入细胞后, 其结构中的小分子药物在溶酶体低pH环境或蛋白酶作用下释放出来, 发挥细胞毒作用。由于单克隆抗体的靶向性, 正常组织细胞内药物浓度较低。因此与传统
题库一 1、什么是药物？ 药物是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理功能并规定有适应证和用法、用量的物质。 2、药物的学科包括哪些？ 药物分析(pharmacenticalanalysis)、药理学(pharmacology)、药剂学(pharmaceutics)、药物化学(pharmacentical chemistry) 3、什么是生物药物？ 生物药物是利用生物体，生物组织或组成生物体的各种成分，综合应用多门学科的原理和方法，特别是采用现代生物技术，进行加工、制造而形成的一大类用于预防、治疗和诊断的药物。广义的生物药物包括：(1)从动植物和微生物中直接提取的各种天然生理活性物质；（2）人工合成或半合成的天然物质类似物。 4、生物药物的性质(Properties of biological) (1)结构相近；(2)药理有效；(3)医疗效果好；(4)浓度低，杂质高；(5)大分子稳定；(6)有一定的敏感性（对热、重金属、酸碱和ph变化等敏感） 5、药典的定义？药典的简称、版本、三部和内容？ （1）定义：记载着各种药品标准和规格的国家法典，是国家管理药品生产与质量的依据，一般由一个国家的卫生行政部门主持编写、实施颁布。 （2）简称：Ch.P （3）版本：1953、1963、1977、1985、1990、1995、2000、2005、2010 （4）三部：中药、化学药、生物制品。 （5）内容：凡例，正文，附录，索引。6、什么是ADME？各代表什么单词？ ADME:药代动力学；A:吸收(absorption);D:分布(distribution);M:代谢(metabolism);E:排泄(excretion) 题库二 1、标准物质的定义 标准物质是一种或多种确定了高稳定度的物理、化学和计量学特性，并经正式批准，可作为标准使用，用来校准测量器具、评价分析方法或给材料赋值的物质或材料。包括化学成分分析标准物质、物理性质与物理化学特性测量标准物质，工程技术特性测量标准物质。 2、精密度控制图及准确度控制图的上下警告限及 上下控制限是怎样定义的？ （1）精密控制图，即均值控制图。以测定结果的平均值X为控制图的中心线，并计算出测量值的标准偏差S，以X ±2S作为上下警告限，用虚线表示；X±3S作为上下控制限绘成。(上警告限：UWL，下警告限：LWL，上控制限：UCL，下控制限：LCL) （2）准确控制图，也称回收率控制图，向不同浓度的样品中加入不同的已知量的标准物，积累测得的回收率数据，计算百分平均回收率品p及其标准偏差sp，以p±2sp为上下警告限，p±3sp为上下控制限。 3、计量、认证、标准化及质量管理的英文 计量：measurement认证：accreditation 标准化：standardization 质量管理：Quality Management QM 4、药物分析论文的发表包括那几个项目?
抗体偶联药物（ADC的涅槃重生 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC ）是将抗体与细胞毒性药物连接起来，通过抗体的靶向作用将细胞毒药物靶向肿瘤，进而降低化疗中常见的 药物非特异性的全身毒性。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC ）的研究可以追溯到1980s，，但是直到2000年，首个抗体偶联药物gemtuzumaboz ogamicin （商品名Mylotarg，Pfizer研发）才被FDA B准用于治疗急性粒细胞白血病，但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定，导致致死性毒性的产生，于2010年撤市。这使得本就不明朗的ADC药物研究，更蒙上了一层阴影。 但是随着Takeda/Seattle Genetics 通过对原有技术的改进，利用自己的 新型抗体偶联技术开发了brentuximabvedotin （SGN-35商品名Adcetris ，） 新型抗体偶联药物，并与2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。2013年抗体偶联药物再次取得突破，Ge nen tech/Immu noGen 联合开发的Ado-trastuzumabemtansine （T-DM1,商品名Kadcyla ）被FDA批准用于HER2阳性乳腺癌，这是首个针对实体瘤的抗体偶联药物。随着这两个药物的研发成功，ADC药物再次以火热的状态进入人们的研究视野。 1、进入临床阶段ADC药物 截至目前大概有30多种ADC药物进入临床开发阶段（表1），统计表中30 种药物针对适应症发现，其中仅有4种药物针对实体瘤。主要原因：抗体难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙到达实体瘤的深部。而使用抗体片段，如Fab,制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量。因此“抗体的小型化或适度的小型化将会是研制ADC药物 的重要途径”。同时我们还能看到ImmunoGe、Seattle Genetics 在现有ADC 药物研发中占有绝对的统治地位，这得力于他们成熟的抗体偶联技术一一利用天然抗体自身的赖氨酸和半胱氨酸中的巯基偶联药物（non-specific ）。 2、如何才能成功开发出一种ADC药物？
单克隆抗体药物关键技术分析 1.高通量的动物细胞表达技术 一方面，从表达体系来看，近年来，人们不断发展和完善了许多抗体分子的表达体系，如：细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞表达系统和体外翻译系统等。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等重要优点，已成为抗体等生物技术产品最重要的系统。2007年销售额排名前列的6类生物技术药物中，有5类是由动物细胞表达生产（肿瘤治疗抗体类、抗TNF-α抗体类、EPO 类、β干扰素类、凝血因子类），仅胰岛素类药物是由大肠杆菌和酵母表达的。欧美国家哺乳动物细胞表达产品种类占60%-70%，市场份额占65%以上。 另一方面，从抗体制备规模、速度和功能来看，高通量抗体制备技术的发展十分重要。哺乳动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术是生物医药产品主要的生产方式和关键“瓶颈”技术。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10,000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为0.5-2g/L；我国在该技术领域
起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破。 2.人源化抗体的构建及优化技术 随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始用于抗体的改造。抗体药物已经进入基因工程抗体时代。基因工程抗体具有以下优点：①降低人体对异种抗体的排斥反应；②减小抗体的分子量，利于其穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据需要，制备新型抗体；④采用多种表达方式，大量表达抗体分子，降低生产成本。 (1)表面重塑抗体 对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。我国也已经开始这方面工作的尝试。 (2)重构抗体
广州创亚企业管理顾问有限公司 创新医药抗体偶联药物发展分析
已获FDA批准上市的ADC药物（截至2019.11）抗体偶联药物（Antibody–Drug Conjugates，ADCs）已经成为当前全球抗体药 物研发的热门方向。截至2019.11，FDA共批准 了6款ADC药物上市，包括Seattle的Adcetris、 Genentech的Kadcyla和Polivy、Wyeth的 Besponsa和Mylotarg，其中的代表产品——抗 CD30的Adcetris在2018年实现销售收入4.77 亿美元（+55%），抗HER2的Kadcyla则实现销 售收入9.79亿瑞士法郎（+8%）。 该类药物的优点是能够将抗体的高特异性 与细胞毒药物的高杀伤力相结合，对部分肿瘤 展现出优秀的疗效，具有独特的临床价值。
ADC类药物结构示意图抗体偶联药物的设计思路是将抗体 与细胞毒药物进行偶联，从而同时发挥 抗体高特异性与细胞毒小分子的高毒性， 利用抗体-抗原的高度靶向结合将药物 输送至肿瘤部位，将细胞毒药物强大的 细胞杀伤能力集中于肿瘤细胞，降低正 常组织的毒副作用。
ADC药物作用机制 上世纪60年代便已经有了在动物模型中试 验ADC的尝试，80年代推进了临床，首个获批的 ADC是由Wyeth研发的Mylotarg（Gemtuzumab Ozogamicin），于2000年被FDA批准上市。但是 该药物在上市后的临床研究中联用化疗未能延 长生存期且增加了毒性，因此2010年由企业主 动撤市。Mylotarg上市后的10余年间未再有新 的ADC获批。
国内抗体药物研发现状分析 一、在研总数与企业构成 中投顾问《2017-2021年中国抗体药物市场投资分析及前景预测报告》中数据指出，至2017年2月17日，我国共有82家研制单位正在CDE进行171个抗体药物的注册研究，较2016年同期增加企业11家，新增抗体32个。年度新增企业数屡创新高，2016年高达17家；加之以前进行过临床注册或已有产品获批但现无注册申报的6家企业，国内涉及抗体药物研制的单位共计88家。现有注册申报的82家单位分布在17个省/直辖市，最多的为上海市，有20家，其次为江苏省17家。 图表2000-2017年抗体药研制企业年度新增数 单位：家 数据来源：中投顾问产业研究中心（至2017年2月） 图表2000-2017年抗体药研制企业年度累计数 单位：家 数据来源：中投顾问产业研究中心（至2017年2月） 中投顾问·让投资更安全经营更稳健
中投顾问·让投资更安全 经营更稳健 第2页 二、创新程度与开发热点 在前述申报的171个产品中，以“1类新药”申报的有48个，占比28%。然而许多产品虽然以1类新药申报但国外已经有了相同或相似产品上市，非真正意义上的“国内外尚无产品上市”的1类新药。因可获得的产品确切信息有限，粗略估判国内申报的产品中的85%可归类为抗体类似药或抗体仿创药。其中仅抢仿7大热门“重磅炸弹”抗体的申报数就高达91个，Bevacizumab 、Adalimumab 、Rituximab 、Trastuzumab 、Cetuximab 、Etanercept 、Infliximab 的抢仿厂家数分别为23家、21家、15家、10家、9家、8家和5家，合计起来的总占比虽然有降低趋势，但仍达到了注册抗体的一半以上（91/171=53%），如果这些抗体类似药都能够顺利进入市场，可以预见未来市场竞争态势将会异常惨烈。 中投顾问在《2017-2021年中国抗体药物市场投资分析及前景预测报告》中指出，就开发热点而言，国内企业已有了抗PD-1单抗、ADC 药物、去岩澡糖化抗CD20抗体、抗PD-L1抗体、抗PCSK-9抗体、双特异性抗体的申报。
干货抗体偶联药物（adc）深度研究报告 目录一、行业背景 针对病症 历史沿革基本原理介绍二、核心技术抗体部分（1）靶点选 择（2）抗体选择（3）抗体修饰（4）抗体内吞连接物部分 （1）连接物（Linker）选择（2）连接方式及DAR（3）新技术Abzena的ThioBridge毒素部分核心专利-连接物与毒素排序三、效果对比：Kadcyla对比Herceptin四、核心公司竞 争情况1.领先公司（1）Seattle Genetics （2）ImmunoGen （3）Immunomedics 2.规模较大公司 （1）Abzena （2）Agensys （3）Celldex （4）Progenics Pharmaceuticals （5）Genmab （6）Sorrento旗下Concortis 3.大型药企在ADC领域的布局（1）Abbvie 及其旗下Stemcentrx （2）Roche旗下Genetech的情况（3）武田旗下Takeda Oncology （4）辉瑞ADC 产品Mylotarg （5） 复星、药明、浙江医药与Ambrx （6）三生制药及三生国健（7）丽珠医药集团旗下丽珠单抗 （8）
江苏恒瑞医药（9）四川恒康旗下上海美雅珂生物 （10）其他药企五、行业市场规模六、ADC成功要素分 析独家技术优秀团队研发方向 一、行业背景抗体偶联药物Antibody-drug Conjugate (ADC)是拥有强细胞毒性的化疗药物通过连接物与单抗偶联形成的，兼具小分子药物强大的杀伤力和纯单抗高度的靶向性，因而成为肿瘤靶向治疗的研究和发展热点。但是，ADC 本身并非在各方面强于纯单抗。其疗效的显著提升是通过牺牲药品的均一性与稳定性实现的。现在比较成熟的两种偶联技术分别侧重均一性与稳定性，有一些新式偶联技术能够在两方面同时改善。1、针对病症ADC药物被用于癌症治疗，其针对病症由其中抗体所针对的靶点决定，能够对将该靶点高表达的肿瘤细胞进行针对性DNA破坏或抑制微管。由于 其针对性很高，其可以使用化疗中不能使用或剂量不能提高的高毒性药物［1］。ADC药物相对于化疗药的治疗安全窗口therapeutic window会更大，相对更加安全［2］。下表为可供使用的各种靶点及其针对的癌症种类。其中，目前已经上市的两款药物中，Kadcyla使用HER2靶点，针对HER2阳性的肺癌；Adcetris使用CD30靶点，针对CD30阳性的霍奇金淋巴瘤Hodgkin Lymphoma (HL)与间变性大细胞淋巴瘤anaplastic large cell lymphoma (ALCL) ［3］。靶向药物中不同抗原及其针对癌症种类，以及相应在研的ADC药物数量抗
单克隆抗体药物行业分析报告(寡人独见，免责声明) (2010-05-02 13:30:22) 医药行业 鲁延迅 单抗 目录 1 克隆抗体药物简介 1.1 单克隆抗体 1.2 单抗技术 1.3 单抗药物 2 两大单抗生产技术壁垒 2.1 上游技术——哺乳动物细胞大规模培养 2.1.1 国际上游工业化技术 2.1.2 国上游工业化技术 2.2 下游技术——单抗药物分离纯化 2.2.1 小规模制备或实验室中纯化单抗的方法 2.2.2 国际工业化纯化技术 2.2.3 国工业化纯化技术 3 单抗市场迅速发展 3.1 国际单抗药物市场处于高速增长期
3.2国单抗药物市场处于起步期 4单抗药物的市场特点 4.1单抗药物市场求大于供，国与国际需求对比 4.2单抗药物研发周期长 4.3单抗药物行业在风险中成长，需历经多次在技术和资本层面的合作4.4帕累托原理在单抗市场表现明显 4.5单抗药物是利润最高的药物之一 5.1全人源化为单抗药物发展趋势 5.2单抗领域研发依然活跃，已上市单抗药物适应症不断扩大 5.3罗氏（含基因泰克）领跑全球单抗药市场 6国单抗药市场竞争格局 6.1国建600826——领跑中国单抗 6.2百泰生物（未上市）单抗领域次席 6.3华神集团000790——苦尽甘来 6.4海正药业600267——拭目以待 6.5万乐药业（未上市）――即将跻身单抗领域 6.6宏远逸士生物技术药业000573——预期平平 1单克隆抗体药物简介
1.1 单克隆抗体抗体是由B 淋巴细胞分化形成的浆细胞合成和分泌的。每一个B 淋巴细胞在成熟的过程过随机重排只产生识别一个抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B 淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B 淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B 细胞。被激活的B 细胞分裂增殖形成效应B 细胞（浆细胞）和记忆B 细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。而单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 1.2 单抗技术 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B 淋巴细胞，但这种B 淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B 淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 资料来源：百度百科 1.3 单抗药物 单抗药物一般分为：治疗型抗肿瘤单抗药物、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗三类。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。单抗药物治疗主要是利用其靶向性，来干预肿瘤发生发展过程中的各个通路，或是激活宿主对肿瘤的免疫等。随着生物医学的不断发展，一定会出现具有更高靶向性的单抗和药效更强的“弹头”。 2 两大单抗生产技术壁垒 2.1 上游技术哺乳动物细胞大规模培养 2.1.1 国际上游工业化技术国际上，动物细胞培养表达生产生物药物产品的工艺已经开始采用万升级的工业大规模间歇式生物反应器，甚至悬浮连续式；培养介质也发展到先进的无动物蛋白培养液。对生物反应器的控制已达到目前的现代计算机二级控制，正朝着人工智能以及细胞生化代分子水平的工业化控制迅速发展。 美国Genetech 公司在搅拌式生物反应器方面占有领先地位。Genzyme,Bayer 公司等则都采用连续管流工艺。国外用于生产的动物细胞反应器产品已趋于大型化、多参数与高度自动化的计算机控制系统，以及适应动物细胞对大型环境因子高敏感性的反应器。 在发达国家，抗体表达往往达到g/L 水平，使用2000-10000L ，甚至是15000L 的发酵罐生产。 2.1.2 国上游工业化技术
第七章芳香胺类药物的分析 第一节芳胺类药物的分析 1、基本结构与化学性质： （一）盐酸普鲁卡因： 1、芳伯氨基特征：重氮化偶合反应 2、酯键易水解：光、热、碱， 3、产物为对氨基苯甲酸（PABA）。 4、游离碱难溶水且碱性弱：非水滴定法， 5、亚硝酸钠法测定含量。 （二）对乙酰氨基酚： 1、水解产物呈芳伯氨基特性：酸性中易水解 2、水解产物易酯化：水解后产生醋酸 3、与三氯化铁呈色：紫外、红外、均可 2、鉴别试验： 1、重氮化偶合反应：盐酸普鲁卡因、对乙酰氨基酚（水解成对氨基酚） 2、三氯化铁反应：对乙酰氨基酚水液加三氯化铁显蓝紫色。 3、水解产物的反应： 4、红外吸收光谱 3、对乙酰氨基酚的杂质检查： 1、乙醇溶液的澄清度与颜色：检查中间体对氨基酚的有色氧化产物。 2、有关物质：药典用薄层色谱法检查对氯乙酰苯胺。 3、对氨基酚：中间体或水解产物， 4、毒性大。有芳胺反应，而 5、对乙酰氨基酚没有。 4、盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的检查：药典规定检查水解产物对氨基苯甲酸小于1.2%. 5、含量测定： （一）亚硝酸钠滴定法：有芳伯氨基的药物（普）以及水解后有芳伯氨基的药物（对）均可测定。 测定条件：1、加入溴化钾（2g）：加速反应。 2、加入强酸加速反应：反应加快、重氮盐酸性中稳定、防偶氮氨基化合物生成。 3、室温10——30 C 温度太高，亚硝酸逸出 4、滴定管尖端插入液面下滴定：避免滴定过程中亚硝酸挥发和分解。 （二）紫外分分光度法：对乙酰氨基酚 第二节苯乙胺类药物的分析 1、基本结构与典型药物：肾上腺素 2、鉴别试验： 1、三氯化铁反应： 2、氧化反应：盐酸异丙肾上腺素偏酸性下与碘迅速氧化。 3、甲醛——硫酸反应： 4、紫外特征吸收与红外吸收谱： 3、酮体检查：四种都需检查酮体， 4、酮体在310nm处有最大吸收， 5、小于0.06% . 6、含量测定： （一）非水溶液滴定法：冰醋酸为溶剂，醋酸汞消除氢卤酸干扰，结晶紫指示终点。三种（6）溴量法：盐酸去氧肾上腺素及注射液用此法。 要点：防游离溴及碘逸出，溴过量2%，空白试验。
生物药物分析与检验 生物药物分析与检验的特点： 1.需要进行相对分子质量的测定、 2.需要检查生物活性 3.需做安全性检查 4.需做效价测定 5.要用生化法确证结构 终点测定法的条件： 1.必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品； 2.能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件； 3.反应中底物的减少、产物的增加、辅酶物质的改变等可以借助简便的方法进行测定 高效液相色谱法的定性分析 1.利用已知物质定性的方法 ①利用保留特性 ②利用不同柱比较 2.色谱法与其他方法结合定性 ①利用化学反应定性 ②利用选择性检测器定性 ③液相色谱-质谱联用技术、液相色谱-核磁共振联用技术 生物检定的范围: 1.药物的效价测定 2.体内微量生物活性物质的测定 3.中药质量的控制 4.某些有害杂质的限度检查 基因工程药物的特点： 1.分泌量极低而生理、药理活性极高 2.具有细胞和组织特异性 3.多数细胞生长因子具有多功能性 4.细胞因子间存在复杂的相互作用 5.具有低免疫原性 特殊杂质检查方法：物理化学区分方法 一、物理法“1. 臭味及挥发性的差异 2. 颜色上的差异 3. 溶解行为上的差异 二、化学分析法 1. 酸碱反应 2. 呈色或沉淀反应 3. 产生气体 4.氧化还原反应
免疫电泳技术：将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，即利用电场作用下带电蛋白质在琼脂凝胶中具有不同的迁移率，以及相同的蛋白质具有完整的抗原性的特点，用于分析抗原或抗体性质的一种技术。 电泳：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 终点测定法：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量 生物检定：利用生物体（整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 质反应：当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反应的某一程度出现与否，只有质的变化。 量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者。 杂志：指药物中存在的无治疗作用、或影响药物稳定性和疗效、甚至对人体健康有害的物质 药典主要包括凡例、正文、附录和索引四部分组成 生物药物常用的定量分析法：酶法、电泳法、免疫分析法、理化测定法、生物检定法 酶分析法包括酶法分析和酶活力测定 酶联免疫吸附分析法包括直接法和夹心法 电泳法分为自由界面电泳、区带电泳和高效毛细管电泳。 指示液：溴酚蓝用于指示电泳终点；甘油比重大，使样品下沉 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应：分子筛效应、浓缩效应、电荷效应 高效液相色谱法的优点：速度快、分辨率高、灵敏度高、柱子可反复使用、样品容易回收 要获得较好色谱分离有两个途径：一是最大峰间的距离要大，二是色谱峰要窄 常用的脱气方法：真空脱气法、煮沸脱气法、溶剂的滤过 微生物检定法测定抗生素效价：稀释法，浊度法，管碟法。其中我国是管碟法。 氯化物检查法：用硝酸，硝酸银 硫酸盐检查法：用盐酸，氯化钡，标准对照液：标准硫酸钾溶液 铁盐检查法：中国药典和美国药典采用硫氰酸盐，英国药典采用巯基醋酸法 重金属检查常用的显色剂：硫代乙酰胺、硫化钠 澄清：不超过0.5号浊度标准液的浊度时；几乎澄清：介于0.5号至1号浊度标准液之间
抗体偶联药物（ADC）的涅槃重生 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC）是将抗体与细胞毒性药物连接起来，通过抗体的靶向作用将细胞毒药物靶向肿瘤，进而降低化疗中常见的药物非特异性的全身毒性。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC）的研究可以追溯到1980s，，但是直到2000年，首个抗体偶联药物gemtuzumab o zogamicin（商品名Mylotarg，Pfizer研发）才被FDA批准用于治疗急性粒细胞白血病，但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定，导致致死性毒性的产生，于2010年撤市。这使得本就不明朗的ADC药物研究，更蒙上了一层阴影。 但是随着Takeda/Seattle Genetics 通过对原有技术的改进，利用自己的新型抗体偶联技术开发了brentuximab vedotin（SGN-35，商品名Adcetris，）新型抗体偶联药物，并与2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。2013年抗体偶联药物再次取得突破，Genentech/ImmunoGen 联合开发的Ado-trastuzumab emtansine（T-DM1，商品名Kadcyla）被FDA批准用于HER2阳性乳腺癌，这是首个针对实体瘤的抗体偶联药物。随着这两个药物的研发成功，ADC药物再次以火热的状态进入人们的研究视野。 1、进入临床阶段ADC药物 截至目前大概有30多种ADC药物进入临床开发阶段（表1），统计表中30种药物针对适应症发现，其中仅有4种药物针对实体瘤。主要原因：抗体难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙到达实体瘤的深部。而使用抗体片段，如Fab，制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量。因此“抗体的小型化或适度的小型化将会是研制ADC药物的重要途径”。同时我们还能看到ImmunoGen、Seattle Genetics在现有ADC 药物研发中占有绝对的统治地位，这得力于他们成熟的抗体偶联技术——利用天然抗体自身的赖氨酸和半胱氨酸中的巯基偶联药物（non-specific）。 2、如何才能成功开发出一种ADC药物？
质谱技术在抗体药物分析中的应用 摘要：质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物 的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理，主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。一级结构的分析包括：精确 分子量的测定、抗体药物偶联比、肽指纹图谱等，高级结构的分析包括：氢/氘交换质谱、二硫键的分析等。质谱法相对于其他分析方法可以提供更为准确的数据，并可以得到多水平的分析结果。 关键词：抗体药物质谱一级结构高级结构 单克隆抗体药物的发展起源于1975年，Kohler 和Milstein 创立杂交瘤技术， 为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件，开创了大规模制备单克隆抗体时代。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，可以和靶抗原特异性结合，并且更 加安全有效，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植 排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物。 [1] 1.抗体药物发展新趋势 在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，2015年全球销售排名 前10 位的药物中有6 个为抗体药物，分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin。抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。鼠源单克隆抗体是第一代的抗体药物，经过不 断改造过渡到全人源单抗。目前，FDA 批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和 全人源单抗数量已占据72%[2] 1.1抗体药物偶联物（ADC） 抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成，小分子 化合物通常是毒性很强的抗肿瘤小分子药物。通过抗体的靶向作用，ADC 的抗体 部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分 子化合物一起带进肿瘤细胞内部，并在细胞内部发生水解反应，释放出小分子化 合物，从而杀死肿瘤细胞。[3]这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向 结合的作用。已经上市的两个ADC是Kadyla和Adcetris。 1.2双特异性抗体（BsAb） 双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶 细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为 抗体工程领域的热点。由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种 类型[4]，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联 单链抗体(串联scFv) 、DVD-Ig 等多种形式。2014年第一个双特异性抗体Blinatumomab获FDA批准，靶向位点是CD19和CD3。 2.质谱技术 近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介 质辅助的激光解吸/离子化(matrix-assisted laser desorption/ionization.MALDI) [5]技术。另一种是电喷雾离子化（Electrospray ionization，ESI）[6]技术。由于这两种 电离技术的出现，使原本只能检测小分支的质谱技术，可以运用于检测生物大分子。 MALDI和ESI两种离子化方法都是软性离子化法，能够使生物大分子在离子 化过程中的保持完整性，分析灵敏度都极高，对低浓度的生物大分子样本也有很
第3弹：在研抗体偶联药物及市场分析 1.上市抗体偶联药物 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC）的研究可以追溯到1980s，将抗体与细胞毒药物偶联产生协同作用，同时通过抗体将药物直接输送到靶细胞。然而早期产品的临床效果并不尽如人意，由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定。偶联技术的发展以及诸多靶标的发现催生了第二代抗体偶联药物，它们在血液中的稳定性有了很大提高，足以将细胞毒药物输送到靶细胞。 抗体偶联药物取得突破性进展是在2011年，FDA批准了CD30 特异性的Adcetris (brentuximab vedotin, SGN-35)用于治疗霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（systemic anaplastic large cell lymphoma）。该药由三部分构成：嵌合IgG1 抗体cAC10+微管聚合抑制剂MMAE (Monomethyl auristatin E)+可被蛋白酶裂解的连接子，cAC10能够特异性识别CD30，MMAE则起到杀死肿瘤细胞的作用。该药由Millennium (The Takeda Oncology Group)和Seattle Genetics共同研发，享有专利保护的连接子和偶联技术（cytotoxic platform technology）出自Seattle Genetics公司。由于病人数量相对较少，该药在美国的年销售额（2011-10至2012-09）为1.36亿美元。 2013年2月，Genentech研发的Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine, T-DM1)获得FDA批准，用于治疗HER-2阳性转移性乳腺癌，III临床研究显示Kadcyla优于拉帕替尼+卡培他滨。Kadcyla也是由三部分构成：曲妥珠单抗+微管聚集抑制剂DM1+连接子，曲妥珠单抗靶向HER2，本身也已被批准治疗乳腺癌，DM1是天然产物Maytansine衍生物，能够与微管花位点结合，产生细胞毒作用。DM1的细胞毒作用比标准化疗高100-10000倍，由于曲妥珠单抗对肿瘤细胞具有选择性，该药的毒性比单纯使用DM1低。该药的连接子及偶联技术（Targeted Antibody Payload ADC technology）出自ImmunoGen公司，Genentech 获得了其专利许可。 2.在研抗体偶联药物 抗体偶联药物的核心是偶联子及偶联技术（ADC platform technology），而主导这项技术的两家公司是Seattle Genetics和ImmunoGen，各大公司的在研项目多与在这两家公司的合作下展开，Genentech和Pfizer自己也在投资做前期研究。在研抗体偶联药物： 3.市场分析 两种利益驱动着抗体偶联药物的研发，一是通过这种方式产生新的专利，二是抗体药
干货抗体偶联药物（adc)深度研究报告 目录一、行业背景 针对病症 历史沿革基本原理介绍二、核心技术抗体部分（1）靶点选择（2）抗体选择（3）抗体修饰（4）抗体内吞连接物部分（1）连接物（Linker）选择（2）连接方式及DAR（3）新技术Abzena的ThioBridge毒素部分核心专利-连接物与毒素排序三、效果对比：Kadcyla对比Herceptin四、核心公司竞争情况 1. 领先公司（1）Seattle Genetics （2）ImmunoGen （3）Immunomedics 2. 规模较大公司 （1）Abzena （2）Agensys （3）Celldex （4）Progenics Pharmaceuticals （5）Genmab （6）Sorrento旗下Concortis 3. 大型药企在ADC领域的布局（1）Abbvie及其旗下Stemcentrx （2）Roche旗下Genetech的情况（3）武田旗下Takeda Oncology （4）辉瑞ADC产品Mylotarg （5）复星、药明、浙江医药与Ambrx （6）三生制药及三生国健（7）丽珠医药集团旗下丽珠单抗（8）江苏恒瑞医药（9）四川恒康旗下上海美雅珂生物（10）其他药企五、行业市场规模六、ADC成功要素分析独家技术优秀团队研发方向
一、行业背景抗体偶联药物Antibody-drug Conjugate (ADC) 是拥有强细胞毒性的化疗药物通过连接物与单抗偶联形成的，兼具小分子药物强大的杀伤力和纯单抗高度的靶向性，因而成为肿瘤靶向治疗的研究和发展热点。但是，ADC 本身并非在各方面强于纯单抗。其疗效的显著提升是通过牺牲药品的均一性与稳定性实现的。现在比较成熟的两种偶联技术分别侧重均一性与稳定性，有一些新式偶联技术能够在两方面同时改善。1、针对病症ADC药物被用于癌症治疗，其针对病症由其中抗体所针对的靶点决定，能够对将该靶点高表达的肿瘤细胞进行针对性DNA破坏或抑制微管。由于其针对性很高，其可以使用化疗中不能使用或剂量不能提高的高毒性药物[1]。ADC药物相对于化疗药的治疗安全窗口therapeutic window会更大，相对更加安全[2]。下表为可供使用的各种靶点及其针对的癌症种类。其中，目前已经上市的两款药物中，Kadcyla使用HER2靶点，针对HER2阳性的肺癌；Adcetris使用CD30靶点，针对CD30阳性的霍奇金淋巴瘤Hodgkin Lymphoma (HL)与间变性大细胞淋巴瘤anaplastic large cell lymphoma (ALCL) [3]。靶向药物中不同抗原及其针对癌症种类，以及相应在研的ADC药物数量抗原对应在研ADC数量主要针对适应症在肿瘤细胞表面表达的靶向抗原GPNMB1乳腺癌及黑素瘤CD561小细胞肺癌（SCLC）TACSTD2