实验七动物组织中核酸的提取和鉴定
【原理】
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。
先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。
核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。
此三类化合物可用下列方法鉴定之。
1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。
H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O
H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5
2、嘌呤碱：能与苦
味酸作用形成针状结晶
3、戊糖：
(1)核糖：经与强酸
(盐酸与硫酸)共热生成
糠醛，后者可与3;5二羟
甲基苯缩合成绿色化合
物。
(2)脱氧核糖：在强
酸中加热，可生成ω—羟
基γ—酮基戊醛，后者再
与二苯胺作用生成一蓝
色化合物。
上述二反应如下
【操作】
(一)核酸提取
l、用酚提取法：
（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。
（2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。
（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。
（4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。
2、用三氯醋酸提取法
（1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。
（2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。
（3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心，
（4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。
取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。
(二)核酸的水解：
在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。
(三)鉴定：
l、嘌呤碱的鉴定：
取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。
2、脱氧核糖的鉴定：
摇匀，于沸水浴中加热15分钟后，观察二管颜色之变化。
3、核糖的鉴定：
摇匀，于沸水浴加热10分钟后观察色颜色之变化。
4、磷酸的鉴定
摇匀，于沸水浴中2～3分钟后，观察二管颜色之变化。
【试剂配法】
1、饱和苦味酸溶液：称取1.3克的苦味酸，溶于100ml的蒸馏水中，静置过夜。临用前倒取上层液。
2、钼酸试剂，称取钼酸铵5克，溶于100ml蒸馏水中，再加入浓硫硫15ml待冷却后加蒸馏水至1000ml，此试剂可置阴凉处保质一月。
3、拜耳（Bial）氏试剂：称取1.5克3，5一二羟甲苯，加入浓盐酸50ml。再加10％三氯化铁20—30滴，贮于冰箱。此试剂应在临用前配制。
4、二苯胺试剂：称取纯二苯胺lg溶于1000ml的冰醋酸中，加入浓硫酸2.75ml，贮于棕色瓶中，此试剂亦需临用前配制。
5、3％维生素C：称取维生素C 3克溶于5％三氯醋酸100ml中（已氧化变质的维生素C不能用）。
【注意事项】
1、在用饱和NaHCO3调节pH值时，一定用试纸测定，将pH调节在6.5以下。
2、肝匀浆一定要磨得较细，细胞彻底破坏。
【实验报告与思考题】
1、核酸提取、鉴定的原理如何？
2、在本实验的操作过程中应注意什么问题？
3、DNA和RNA在组成上有什么区别？如何鉴别？
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦 味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸 (盐酸与硫酸)共热生成 糠醛，后者可与3;5二羟 甲基苯缩合成绿色化合 物。 (2)脱氧核糖：在强 酸中加热，可生成ω—羟 基γ—酮基戊醛，后者再 与二苯胺作用生成一蓝 色化合物。 上述二反应如下 【操作】
(一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：
提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS
第一节实验动物的抓取固定方法 一、小鼠抓取固定方法 小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（见图2-1之一），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图2-1之二）。有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定（图2-2），先根据动物大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，固定筒盖即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作。 图2-1 小鼠的抓取固定方法 图2-2 小鼠尾静脉注射方法 二、大鼠的抓取固定方法 大鼠的抓取方法基本同小鼠，只不过大鼠比小鼠牙尖性猛，不易用袭击方式抓取，否则会被咬伤手指。抓取时为避免咬伤，可带上帆布手套。如果进行腹腔、肌肉皮下等注射和灌胃时，同样可采用左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手即可进行各种实验操作。也可伸开左手之虎口，敏捷地从后一把抓住。若做手术或解剖等，则需事先麻醉或处死，然后用细棉线绳活结缚腿，背卧位绑在大鼠固定
板上；尾静脉注射时的固定同小鼠（只需将固定架改为大鼠固定盒）。 三、蛙类的抓取固定方法 蛙类抓取方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前肢、右手进行操作（见图2-3）。 图2-3 蛙、蟾蜍抓取固定方法 在抓取蟾蜍时，注意勿挤压其两则耳部突起之毒腺，以免毒液射进眼中。 实验如需长时间观察，可破坏其脑脊髓（观察神经系统反应时不应破坏脑脊髓）或麻醉后用大头针固定在蛙板上。依实验需要采取俯卧位或仰卧位固定。 四、兔的抓取固定方法 （一）抓取实验家兔多数饲养在笼内，所以抓取较为方便。一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其臀部或腹部，让其体重重量的大部分集中在左手上（图2-4），这样就避免了抓取过程中的动物损伤。不能采用抓双耳或抓提背部。 （二）固定一般将家兔的固定分为盒式、台式和马蹄形三种。盒式固定，适用于兔耳采血、耳血管注射等情况；若做血压测量、呼吸等实验和手术时，则需将兔固定在兔台上，四肢用粗棉绳活结绑住，拉直四肢，将绳绑在兔台四周的固定木块上，头以固定夹固定或用一根粗棉绳挑过兔门齿绑在兔台铁柱上；马蹄形固定多用于腰背部，尤其是颅脑部位的实验，固定时先剪去两侧眼眶下部的毛皮，暴露颧骨突起，调节固定器两端钉形金属棒。使其正好嵌在突起下方的凹处，然后在适当的高度固定金属榛。用马蹄形固定器可使兔取用背卧位和腹卧位，所以是研究中常采用的固定方法。 图2-4 家兔抓取方法
目录 1.目的 (2) 2.范围 (2) 3.引言、定义和缩略语 (2) 4.程序 (2) 4.1大鼠的捉持 (2) 4.2小鼠的捉持 (3) 4.3豚鼠的捉持 (3) 4.4兔的捉持 (3) 4.5犬的捉持 (4) 5.登记和归档 (5) 5.1登记 (5) 5.2归档 (5) 6.职责 (5) 7.培训 (5)
1. 目的 本条SOP的目的是建立并规范实验动物的捉持及固定方法，使操作程序标准化。 2. 范围 本条SOP适用于所有参加动物试验的操作人员。 3. 引言、定义和缩略语 实验动物的捉持分为：大鼠的捉持、小鼠的捉持、豚鼠的捉持、兔的捉持、犬的捉持。 4. 程序 4.1大鼠的捉持 1)包身法：操作者一只手提鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙表面上，向后 方轻拉鼠尾，使大鼠前肢固定在粗糙表面上，另一只手用拇指和另外4指从动物背部分别绕到动物的两侧腋下，将大鼠抓起（熟练者可不提鼠尾，直接将其抓住）。 2)提尾法：操作者用单手拇指和食指抓住动物尾根部提起。（图1） 图1 提尾法图2 固头法 3)固头法：操作者用单手拇指和食指抓住大鼠颈背部皮毛，使其头部固 定。（图2） 4)注意事项：不宜快速或突然抓取动物。对于有症状的大鼠，抓取时注
意避开其伤痛部位，避免增加动物痛苦。 4.2小鼠的捉持 1)双手法：操作者一只手提鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙表面上，向后 方轻拉鼠尾，使小鼠前肢固定在粗糙表面上（图4）。迅速用另一只手的拇指和食指捏其双耳间颈背部皮肤，无名指、小指及掌心夹其背部皮肤和尾部，便可将小鼠牢固捉持（图3）（图5）。 图3小鼠双手捉持法图4小鼠单手捉持法图5 小鼠单手捉持法 2)单手法：小鼠置于笼盖上，先用食指和拇指抓住鼠尾后，手掌尺侧和 小指夹住鼠尾，然后拇指与食指捏住颈部皮肤（图5） 3)提尾法：用单手拇指和食指捉持尾根部。此法适用于从小群体中或单 一个体中操作小鼠。 4)固头法：操作者一只手拇指和食指抓住动物尾部，另一只手拇指和食 指抓住动物颈背部皮毛，使动物头部被固定。 4.3豚鼠的捉持 豚鼠性情温和，不易咬人，用手轻轻握住身体即可抓起（图6）。 图6 豚鼠的捉持 4.4兔的捉持 操作者一只手抓住兔颈背部皮肤，将兔轻轻提起，另一只手托住臀部，
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月
第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打， 或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保 存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复 冻融。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
实验酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定 【课前预习】 1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．如何从酵母中提取到较纯的RNA? 3．干扰RNA的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。 4．干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？ 【目的要求】 1. 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。 2. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 3. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 【基本原理】 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2. 67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克
实验动物的选择和动物实验的设计 第一节实验动物选择基本原则 一、根据课题研究的目的、内容、水平选用相匹配的标准化动物 一切动物实验都是为科学研究服务的，选择实验动物首要的就是要根据研究的内容来选择实验动物。 蛙的大脑不发达，不可作高级神经活动的实验。但蛙的脊髓具有最简单的发射中枢，做神经反射弧实验，简单、直观、明确、容易分析。 二、必要的预试验有助于选择与本课题相适应的实验动物 动物预试验的作用在于： 1.初步观察动物是否适宜于本项目的研究 2.熟悉动物的生物学特性及饲养管理 3.检查与动物实验配套的实验条件、方法是否初步到位 三、充分利用与人具有某种相似性的实验动物 绝大多数生物学与医学研究的最终目的是要为人类服务的。因此在实际可能的情况下尽量选择那些生物学特征及解剖生理特点等与人类类似的实验动物。 一般来说，实验动物愈高等，进化程度愈高、其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈接近人类。 猴、拂拂、猩猩、长臂猿等灵长目动物是最近似于人类的理想动物。 1.结构功能的相似性 2.时象或年龄状态的相似性 3.群体分布的相似性 在以群体为对象的研究课题，有时要考虑到选择与人群基因型及表现型分布类型相似的动物类别。主要是一些封闭群动物，如:KM小鼠，Wistar大鼠，毕格犬等。 4.生态或健康状况的相似性 在正常生命过程的研究中，找到与人类生态情况相似的替代模型非常重要。现有的不同微生物学质量级别的普通动物、清洁动物、SPF动物、无菌及悉生动物分别代表着不同的微生态模式并具有不同特点，适用于不同研究目的。 5.疾病特点的相似性
实验动物有许多自发或诱发性疾病能局部或全部地反映与人类类似的疾病过程及特点，可用于研究相关的人类疾病。 6.操作实感的相似性 外科手术性的操作模型中或教学示教中，常选择体型较大的动物。犬为首选。 四、除利用与人具有的相似性以外的实验动物选择原则 1.特殊性原则 由于物种之差异，各种动物之间存在基因型、组织型、代谢型、易感性等方面的差别，这种差异有时可作为研究课题所需的一种指标或特殊条件。 2. 易化原则 进化程度高或结构机能复杂的动物有时会给实验条件的控制和实验结果的获得带来难以预料的困难。应依据易化原则选择那些结构功能简单而又反映研究指标特质的动物。 例如：在遗传研究中，用寿命短、繁殖快的果蝇取得了丰硕的成果，而同样方法若改用灵长目动物其难度是很难设想的。 有时为了删除系统作用背景对某器官或某功能进行研究，可用离体方法进行。3.相容或匹配原则 所谓“相容”或“匹配”是指所用动物的标准化品质应与实验设计、技术条件、实验方法等条件相适应。在设计实验时不但要了解实验仪器精度和灵敏性能。了解试剂的品质、性能以及试剂和仪器之间的匹配性能，也要了解动物或动物模型对实验手段的反应能力。 4.易获性原则 易获性是理想的实验动物条件之一。 虽然猫、狗、猪及灵长动物居于较高进化水平，各有其研究价值，尤其是灵长类动物在许多方面有不可替代的优越性。然而这些大动物则往往由于其较长生殖周期，低繁殖率、低产仔率等弱点而影响其易获性，因而亦影响其被选用，故通常不作首选。 5.重现性、均一性原则 重现性和均一性为实验结果质量品质所在。若实验结果不能再现或不稳定，则该
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定 【目的】 验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。 RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 1.磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 CHO C H C H C H CH 2OH OH OH OH O CHO O H CH 3 C O CH 3 O C H 3OH -H 2O 核糖 3，5-二羟甲苯 糠醛 绿色化合物 脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 CHO C H C H C 2OH H H O -H 2O 浓酸脱氧核糖 蓝色化合物 CHO C H C H C H CH 2OH H OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛 二苯胺 【器材】 剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1.生理盐水。
优选精品资源欢迎下载选用 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
教案与讲稿 一、教案 2005级医学心理，2005级临床动物组织中核酸的 课程名称授课专业和班级本科9班，2005级临床本科6提取与组分的鉴定 班，2005级药学专科授课学 授课内容纸层析鉴定转氨作用4学时时 2006.11.27， 6、7、 8、9节， 6、 2006.11.30， 7、8、9节， 1、2、授课地点分析实验室日期节次 2006.12.1， 3、4节， 1、2、 3、 2006.12.284节 教学目的熟悉苯酚法提取动物组织中核酸的原理和操作方法；了解核酸的组成，掌握核酸组分的鉴定方法。 教学重点动物组织中核酸提取的原理和操作方法；核酸组分的鉴定
教学难点核酸提取的操作；核酸组分的鉴定 教具黑板、粉笔、实验材料、实验仪器等。 教学方法小班讲课 动物组织中核酸提取的原理和操作方法10分钟 教学过程核酸组分的鉴定10分钟 学生实验操作130分钟实验结果观察及讨论分析10分钟 （1）刘粤梅朱怀荣主编《生物化学实验教程》（人民卫生出版社） （2）张文峰黄林邦主编《分析与实验检测技术》（江西高校出版社）思考题 课后总结影响本次实验的因素？ 参考书籍 二、讲稿 （一）实验原理： 核酸由磷酸、戊糖、含氮碱基化合物组成，根据戊糖的不同可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。由于它们在组织细胞中大部分与蛋白质结合成核蛋白，因此，提取核酸时必须使核酸与蛋白质分离开并去掉蛋白质。核蛋白可用水从动物组织（实验中用肝）中提取，再用水饱和的酚去蛋白，释放出核酸，最后用乙醇沉淀出核酸。 核酸可被硫酸水解得到磷酸、戊糖、含氮碱基化合物，根据这三种物质的性质特点可用不同的方法加以鉴定： 1．磷酸： 可与钼酸试剂作用产生磷钼酸，后者在还原剂（如维生素C或氨基萘酚磺酸等）作用下可立即被还原成蓝色的钼蓝，其颜色的深浅与磷的含量成正比。
实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
蛋白提取实验步骤: 1、细胞总蛋白提取 A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高 蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B对于贴壁细胞： a用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。 4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加
入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
二、实验动物的抓取固定方法 正确的抓取固定动物，是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。抓取固定动物的方法依实验内容和动物类而定。抓取固定动物前，必须对各种动物的一般习性有所了解，抓取固定时既要小心仔细，不能粗暴，又要大胆敏捷，确实达到正确抓取固定动物的目的。 （一）小鼠抓取固定方法 小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（见图11-1之一），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图11-1之二）。人经验者直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定（图11-2），先根据动物大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，固定筒盖即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作。 图11-1小鼠的抓取固定方法
图11-2 小鼠尾静脉注射方法 （二）大鼠的抓取固定方法 大鼠的抓取斯基本同小鼠，只不过大鼠比小鼠牙尖性猛，不易用袭击方式抓取，否则会被咬伤手指，抓取时为避免咬伤，可带上帆布手套。如果进行腹腔、肌肉皮下等注射和灌胃时，同样可采用左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手即可进行各种实验操作。也可伸开左手之虎口，敏捷地从后，一把抓住。若做手术或解剖等，则需事先麻醉或处死，然后用细棉线绳活缚腿，背卧位绑在大鼠固定板上；尾静脉注射时的固定同小鼠（只需将固定架改为大鼠固定盒即可）。 （三）蛙类的抓取固定方法 蛙类抓取方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前肢、右手进行操作（图11-3）。 图11-3 蛙、蟾蜍抓取固定方法
[键入文字] 教学秘书 教研室主任 教学院长 制表日期 2015-2016学年第二学期 2013级临床医学八年制《基因工程实验技术》教学日历 教室安排:8号楼三楼 分子生物学实验室 （27学时） 116人 第一实验室: 喻红/杜芬 (39); 第二实验室: 张百芳/汪敏(39); 第三实验室: 苗丽霞/范成鹏(38) 2016年 课 程 内 容 学时 4月17日 周日 1. 概述基因工程基本流程及在医学中的应用（目的基因的获取；质粒载体在基因工程中的应用；重组体的连接(重 点：质粒PCR 定点突变及TA 克隆)、转化；筛选转化子的方法；原核表达体系及真核表达体系，外源基因的 表达和产物分离纯化；亚克隆；基因工程与医学实践的结合; PAGE 电泳和层析技术的介绍）； 2. 提供细菌A 液提取的质粒DNA 经PCR 定点诱变后的产物纯化溶液；提供T 载体Kit ，进行连接反应； 3. 制备含Amp 的LB 固体培养平皿； 4. 提供感受态DH5a ，将重组连接后的DNA 溶液转化、Amp 平板铺菌，培养过夜（<18h,下午开始做）（周一课 间来观察转化结果：Amp 筛选平板上的单菌落，或-4度密封保存平板至下周六） 5. 提供小量液体培养过夜的细菌B 液；转新锥形瓶，液体培养3-4h 后加IPTG 1mM 诱导表达（5h ），收集诱导 后的菌体沉淀（诱前0.5ml 两管，诱后1ml 两管和3-4ml 的若干管，用于目标蛋白的纯化） 6. 重组质粒DNA 的质粒提取及限制性内切酶双酶切图谱的鉴定（周日下午做，过夜，周一转存-20度冰箱）； 9 4月23日 周六 1. 原核表达体系中GST 融合蛋白的诱导表达及鉴定：先进行SDS-PAGE 的灌制凝胶；再将诱导前后的菌体蛋白， 进行SDS-PAGE 检测外源蛋白的诱导表达水平； 2. Western Blotting 鉴定特异蛋白的表达水平（SDS-PAGE （第一块胶）、转膜、封闭、I 抗（抗GST-Ab ）孵育过夜）； 3. 外源GST 融合蛋白的分离纯化（介绍层析技术；上午开始做）：诱导后的细菌沉淀采用溶菌酶法裂解细菌（>1h ）， Glu-Agarose beads 亲和层析法分离纯化GST 融合蛋白（提供50 ul beads ，Ep 管离心洗涤法，每班共10组）， 4. SDS-PAGE 鉴定GST 融合蛋白纯化（下午跑第二块胶，考马斯亮蓝染色>0.5h ，漂洗脱色过夜） 9 4月24日 周日 1. 酶切目的DNA 片段的非变性PAGE 鉴定 2. Western blotting （续）：洗膜、II 抗孵育1~2 h ，漂洗、DAB 显色。 3. SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色后的脱色结果观察 4. 实验报告与总结，结果分析及讨论：（真核基因在原核生物中的表达策略） 9
Western blot 实验 1）蛋白裂解液的配制: Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。 我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒 2）蛋白样品制备 （1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液； （2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。 （3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次； （4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。 3）蛋白浓度测定（Bradford法） 试剂配制： 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。 牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml 步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。 管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液 0 0 200 μl 1 ml 1 5 195 μl 1 ml 2 10 190 μl 1 ml 3 15 185 μl 1 ml 4 20 180 μl 1 ml 5 25 175 μl 1 ml 我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。 4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） （1）凝胶制备： 30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，
实验四 肝组织中核酸的提取与鉴定 【目的】 验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白,先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质,再用1、7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐,然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。 RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖(RNA 为核糖,DNA 为脱氧核糖)。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 1、磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸,磷钼酸中的钼在有还原剂(硫酸亚铁)存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2、嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3、戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛,后者能与3,5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 CHO C H C H C H 2OH OH OH OH O CHO O H CH 3 C O CH 3 O C H 3OH -H 2O 核糖 3，5-二羟甲苯 糠醛 绿色化合物 脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛,它与二苯胺作用生成蓝色化合物。 CHO C H C H C 2OH H H O -H 2O 脱氧核糖 蓝色化合物 CHO C H C H C H CH 2OH H OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛 【器材】 剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1、生理盐水。
2、 0、12 mol/L三氯醋酸溶液。 3、 95% 乙醇。 4、 10% NaCl溶液 NaCl 10g溶于蒸馏水中,加至100ml。 5、 0、92 mol/L H2SO4 取浓H2SO4(比重1、84,含量98%)5ml加入蒸馏水中,加水至100ml 。 6、钼酸铵试剂 钼酸铵3g,溶于70ml蒸馏水中,逐渐加入浓 H2SO4 14ml ,冷却后再加至100ml,混匀备用。 7、硫酸亚铁试剂 硫酸亚铁10、6g,硫脲5g,加蒸馏水溶解并加水至500ml,冰箱内保存备用。 8、浓氨水。 9、 0、29mol/L AgNO3 取AgNO3 5g加蒸馏水溶解并稀释至100ml,于棕色瓶避光保存。 10、 3,5二羟甲苯试剂 取浓盐酸100ml,加入FeCl3·6H2O 100mg 及二羟甲苯100mg混匀溶解后,置于棕色瓶中。临用前配制,冰箱保存。(市售3,5二羟甲苯不能直接使用,必须用苯重结晶1～2次,并用活性碳脱色后方可使用)。 11、二苯胺试剂 取1g纯的二苯胺溶于100ml冰乙酸中,加入2、75ml浓硫酸,盛于棕色瓶中,临用前配制。 【操作】 1、核酸的提取与分离: (1)将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中,加入等量的生理盐水,制成匀浆。 (2)将5ml肝匀浆置于离心管内,立即加入0、12mol/L三氯醋酸5ml,用玻棒搅匀,静置8分钟后离心。 (3)倾去上清液,加95% 乙醇5ml,用玻棒搅匀,再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口,在水浴中煮沸2分钟,冷却后离心。 (4)将离心管倒置于滤纸上,使滤纸吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl溶液4ml,置于沸水浴中加热8分钟,并用玻棒不断搅拌,取出冷却后再离心。 (5)将上清液倾入另一离心管内,再离心一次,去除可能存在的微量残渣。将上清液倒
植物全蛋白提取方法： TCA丙酮沉淀法、Tris-HC1法、Trizol沉淀法提取法。 1 TCA丙酮沉淀法 基于蛋白在酸或疏水条件下变性使蛋白浓缩并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用于小麦蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。 具有降低次生代物质的干扰、减少蛋白降解等优点。 TCA能有效地抑制蛋白酶对蛋白质的水解作用，保证在制样过程中蛋白质不被降解；丙酮溶液能除去样品中的酚类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速离心办法能较好地去除多糖的影响。然而该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白，导致2-DE图谱上有明显的横纵条纹。 在研磨样品时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)用来吸附样品中富含的酚、醌类物质。它们能通过疏水键与酚类形成复合物，离心可以去除该复合物。然而，TCA丙酮沉淀法中与蛋白共沉淀的污染物在随后的有机溶剂清洗步骤常难以去除，可以通过振荡和延长蛋白沉淀在裂解缓冲液中温育时间的方法来增加蛋白的溶解能力。在提取的过程中同时加入了 TCA、β-巯基乙醇及 DTT 3 种药剂可以更好的抑制蛋白质的水解及去除干扰物质。 TCA丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，对更为复杂的植物组织该方法并非最佳选择。但该方法还是在植物蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的样品应用该方法效果很好，如鹅掌楸叶片、巴东木莲的雌蕊柱头、槟榔叶片、银杏叶片及枝条、茶树叶片及芽、红豆杉的愈伤组织、石斛叶片等。草本植物中的大豆叶片、生菜叶片、黄瓜叶片、番茄子叶、龙胆花芽、灰木相思叶片等应用该方法都获得了较清晰的2-DE图谱。 TCA protein precipitation protocol Stock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA) recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT. Precipitation Protocol: 1. Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample. i.e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250μl TCA to 1.0ml sample. 2. Incubate 10 min at 4°C. 3. Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min. 4. Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt. 5. Wash pellet with 200μl cold acetone. 6. Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min. 7. Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes. 8. Dry pellet by placing tube in 95°C heat block for 5-10 min to drive off acetone. 9. For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for 10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel. 2 Trizol沉淀法 与 TCA 丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白质的方法可有效地除去色素、酚类等干扰电泳的化学物质，特别是对植物样品中高丰度蛋白——Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO）。采用此方法能够减少高丰度蛋白对2-DE结果的干扰。植物样品中高丰度蛋白（如Rubisco）