二代测序质控各参数标准
一、引言
二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。本文将介绍二代测序质控各参数的标准。
二、样本质量评估
1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。
2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。
3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。
三、测序数据质量评估
1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。
2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。
3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。
4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。
四、质量控制标准
1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。
2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。
3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。
4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。
5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。
五、结论
二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。
二代测序质控各参数标准 一、引言 二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。本文将介绍二代测序质控各参数的标准。 二、样本质量评估 1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。 2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。 3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。 三、测序数据质量评估 1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。 2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。 3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。 4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。 四、质量控制标准
1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。 2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。 3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。 4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。 5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。 五、结论 二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。
二代测序技术及结果解读详解 二代测序技术（Next-Generation Sequencing，简称NGS）是一种高通量、高效、低成本的DNA测序技术，在过去的二十年里得到了极大的发展和广泛的应用。其主要优势包括快速高 效地获得大规模的DNA序列信息、能够同时检测多个样本和多个基因组区域、低成本且操作 简便，广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。 二代测序技术主要基于DNA复制和DNA合成原理，可以将复杂的DNA样本快速分析为短序 列片段，并使用计算方法将这些片段重新组装成完整的DNA序列信息。常用的二代测序平台 包括Illumina（Solexa）公司的SBS（Sequencing by Synthesis）技术、Ion Torrent公司的SBL （Sequencing by Ligation）技术和Pacific Biosciences公司的SMRT（Single Molecule Real-Time）技术。 在二代测序技术中，SBS是应用最广泛的一种。它基于DNA合成的原理，将DNA样本分为 小片段，然后通过循环的方式依次加入测序试剂，即四种碱基、DNA聚合酶和荧光酶。每一 轮循环中，DNA聚合酶选取与DNA模板互补的引物，合成DNA，并使用荧光酶标记每个碱 基的位置。通过检测荧光信号，可以推断出DNA序列。这种技术具有高度精确性和高度信号 强度的优点，能够进行大规模的并行测序。Illumina的HiSeq和MiSeq是最常用的SBS测序平台。 在二代测序获得的结果中，主要有原始数据、测序比对结果和变异分析结果这三类信息。原始数据是由测序仪器生成的离散碱基流程图，记录了每个碱基的荧光信号和碱基序列。测序比对结果是将测序得到的短片段与参考基因组序列进行比对，确定每个片段在基因组中的位置和碱基。变异分析结果涵盖了各种DNA变异信息，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）、小片段缺失或插入、拷贝数变异等。通过对这些结果的分析和解读，可以更深入地了解样本的基因组和转录组特征，发现和识别致病基因和突变等。 二代测序技术的应用非常广泛，包括但不限于以下几个方面： 1. 完整基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）：通过对个体的全部基因组进行测序，可以识别出个体的遗传变异信息，包括致病变异和多态性等。 2. 表达谱测序（RNA-Seq）：对转录组进行测序分析，可以了解基因的表达水平、新基因的发 现和剪接位点的识别等。 3. 甲基化谱测序（Methylation-Seq）：通过测序方法检测DNA上的甲基化修饰信息，可以了 解基因的表观遗传修饰状态和甲基化的动态变化。 4. 靶向测序（Targeted Sequencing）：通过选择特定的基因组区域或突变位点进行测序，可以 高效地检测致病变异或特定功能区域的变异。
送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及 解读 宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。 需送检mNGS情况 (1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者； (2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者； (3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时； (4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规
病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。 不建议送检 mNGS情况 (1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转； (2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效； (3) 无法获取优质标本。 mNGS 标本类型 在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。 mNGS 送检及保存要求 (1)下呼吸道标本：包括痰 (含诱导痰)、BALF、肺炎旁胸腔积液等，原则上应在采集后立即送检。若标本不能立即送检，标本采集时间与检测时间间隔≤24 h，可在 2—8 ℃保存。若标本采集时间与检测时间间隔 >24 h，DNA 测序标本保存时间≤2周时可储存在-20 ℃冰箱，保存时间超过 2 周则需储存在 -80 ℃冰箱；需要进行 RNA 测序的标本如果保存时间 > 24 h，均应保存在 -80 ℃冰箱。对于短期不做检测的液体样本，冻存前应分装保存在冻存管 (≥ 500 μL/管) 中。 (2)血标本：采集后 4 ℃保存不超过 8 h，如果需要长期保存，分离血浆后 4 ℃可保存 24 h，长期保存于 -80 ℃冰箱。 (3)组织标本：来自感染部位的穿刺或手术切除组织标本，应保
多发性骨髓瘤应用二代测序监测微小残留病的实验室标准化技术规范专家共识（2021年版） 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种细胞遗传学高度异质的克隆性浆细胞增殖性肿瘤，是血液系统的常见肿瘤[1]。近几年多种新型作用机制靶向药物的上市大大提高了MM患者治疗的缓解深度并延长了生存期。但由于大部分患者体内存在微小残留病（minimal residual disease，MRD），最终仍会复发。二代测序（next-generation sequencing，NGS）作为新的分子生物学技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，已成为MM患者MRD评估的主要研究方法之一。为实现检测结果标准化，专家组制订了在MM 患者中应用NGS监测MRD实验室标准化技术规范的中国专家共识。 一、背景 1．MRD监测意义： MRD可在低于传统形态学检测多个数量级下检测恶性肿瘤是否持续存在，是评估肿瘤负荷的常用指标，可反映患者对治疗的反应，也可作为评估患者未来复发风险的预后工具。国际骨髓瘤工作组（International Myeloma Working Group，IMWG）在2016年更新了MM治疗应答标准，在原有传统疗效评估标准之外增加了MRD 疗效标准，主要包括二代流式细胞术和NGS两种监测方法[2,3]。2020年版中国MM诊治指南也推荐将NGS纳入MM患者的MRD评估标准。国内外文献也证实NGS检测的MRD状态可作为MM的主要预后因素之一，是MM患者疗效评价的重要标准[4,5,6]。 2．MRD目标基因： 目前应用NGS监测MM患者MRD，主要检测的目标基因是IG 基因克隆性重排。需要先确定初诊MM患者全骨髓细胞中肿瘤浆细胞IG克隆性重排，包括IGH和（或）IGK基因克隆性重排的类型和序列[7]。在患者后续的随访标本中，以诊断时检测到的克隆性重排序列作为分子标志进行MRD监测[8]。 二、实验流程
基因测序的质量控制与评估 近年来，随着高通量测序技术的不断发展及应用，基因测序已 经成为基因组学、生物学、医学等领域内不可或缺的重要工具。 然而，在进行基因测序时，数据的质量控制与评估是不可缺少的 一环，对保障测序数据的准确性和可靠性具有重要意义。那么， 在进行基因测序时，我们该如何进行质量控制和评估呢？ 一、数据质量控制 数据质量控制是基因测序过程中非常重要的一环，主要目的是 在获取样本数据的同时，避免测序产生错误和杂质，保证所得数 据的可靠性和准确性。数据质量控制主要包括以下方面的内容。 1.读长 读长是指测序数据中DNA荧光信号的稳定程度，也是判断数 据可靠性的一个重要指标。过短的读长可能导致序列相似度差， 过长的读长有可能导致数据无法对齐或引起测序器特定的偏差。 因此，需要对测序数据的读长进行对比和筛选，来保证数据质量。
质量分数是衡量测序品质的指标之一，可用于检测数据中预测错误和杂质。在测序中产生的碱基质量分数，可以反映出测序片段的准确度。一般而言，基质量分数越高，代表此测序片段的准确性越高，数据质量也越高。因此，需要对质量分数进行筛选，以确保测序数据尽可能质量优良。 3.测序深度 测序深度是指测序过程中，DNA序列被覆盖的深度统计量，即每个碱基被重复测序的次数。一般来说，测序深度越高，数据的可靠性就越高。因此，对于测序过程中的测序深度随时监测、计算和调整，也非常有必要。 二、数据质量评估 数据质量评估是对测序数据质量进行综合评估，以确定其可靠性和应用的可行性。数据质量评估主要从以下方面进行。
质量分析是对样本进行基础统计分析，目的是评估数据质量是 否良好。在质量分析中，我们可以评估样本中数据的均衡性、分 析GC流分布等相关指标，以评估数据的可靠性。 2.序列一致性 序列一致性是评估片段是否与测序所得标准序列一致的指标。 在测序过程中，替代碱基的出现可能导致序列之间的变异。因此，对于基因测序数据均需要进行序列比对，以评估序列一致性和错 误率等信息。 3.杂质和冗余 杂质和冗余对数据的分析和应用都会造成影响，因此需要进行 数据清理和过滤。杂质主要指样本中存在的污染物和外源DNA， 冗余主要指样本中重复出现的部分DNA序列。需要通过比对、过 滤等方法进行清理，以保证数据的质量。
二代测序报告放行标准 一、测序质量 测序质量是评估二代测序数据质量的重要指标。高质量的测序数据对于后续的变异检测和分析至关重要。在放行标准中，要求测序数据的质量得分大于Q30，以确保变异检测的准确性。 二、样本完整性 样本完整性是指测序得到的DNA序列与原始样本DNA的一致性。在二代测序中，由于PCR扩增和建库等操作可能导致DNA序列的偏移和丢失，因此需要评估样本的完整性。在放行标准中，要求样本完整性大于90%，以避免由于序列偏移或丢失导致变异检测的误差。 三、测序深度 测序深度是指测序得到的总碱基数与参考基因组的碱基总数的比值。足够的测序深度是确保变异检测灵敏度和特异性的前提。在放行标准中，要求测序深度大于10X，以满足大多数变异检测的需求。 四、测序覆盖率
测序覆盖率是指测序得到的碱基序列与参考基因组的碱基序列的比值。在放行标准中，要求基因组覆盖率大于95%，以确保变异检测的全面性和准确性。 五、检测变异 检测变异是二代测序的主要目的之一。在放行标准中，要求准确检测到已知的变异位点，并且变异位点的检测灵敏度和特异性均大于99%。同时，要求对未知变异进行合理注释和解读。 六、数据分析 数据分析是二代测序报告的重要组成部分。在放行标准中，要求数据分析过程符合科学和规范的要求，并且分析结果准确可靠。同时，要求对数据进行合理的解读和解释。 七、可重复性 可重复性是指实验结果的稳定性和可靠性。在二代测序中，由于操作复杂和数据量大等因素，实验结果的可重复性可能受到影响。在放行标准中，要求实验结果具有较好的可重复性，以确保数据的可靠性和
准确性。 八、生物信息学分析 生物信息学分析是二代测序数据处理的重要环节。在放行标准中，要求生物信息学分析过程符合规范和标准的要求，并且分析结果准确可靠。同时，要求对生物信息学分析结果进行合理的解读和解释。 九、报告格式 报告格式是二代测序报告的重要组成部分。在放行标准中，要求报告格式规范、清晰、易于理解，并且包括必要的实验和数据分析过程、结果和结论等信息。同时，要求报告中的数据和图表准确、完整、一致，并且符合出版物的规范和标准。
PacBio HiFi测序质控标准 随着基因组学研究的深入发展，测序技术也不断更新迭代，为科学研究和医学诊断提供了更加精准和可靠的数据支持。PacBio HiFi测序作为一种新兴的第三代测序技术，具有单分子长读长优势，能够克服二代测序的错配率高和重复序列区域难以解析等问题，受到了广泛的关注和应用。然而，为了确保PacBio HiFi测序结果的准确性和可靠性，需要建立严格的质控标准，以保证测序数据的高质量和可靠性。 一、测序样本质控 1. 样本DNA纯度 在进行PacBio HiFi测序之前，首先要对样本DNA进行质控。样本DNA的纯度对测序结果影响极大，在质控时需要检测DNA的纯度和浓度，确保DNA的质量符合要求。 2. DNA片段长度 PacBio HiFi测序对DNA的片段长度也有要求，需要进行片段长度的检测和筛选，确保符合测序的要求。过长或者过短的DNA片段都会影响测序结果的准确性。 二、测序实验质控
1. 质控库制备 在进行PacBio HiFi测序之前，需要进行质控库制备。对于样本DNA 进行质控，检测DNA的纯度和片段长度，制备适当的质控库，确保测序实验的准确性。要严格控制实验过程中的环境和操作，防止外源污染导致测序结果的偏差。 2. 实验评台质控 PacBio HiFi测序实验需要严格控制测序评台的质量，包括光学系统、荧光标记和测序反应等。确保测序评台的稳定性和准确性，对于测序数据的可靠性至关重要。 三、数据分析质控 1. 数据质量评估 在PacBio HiFi测序完成后，需要进行数据质量的评估。通过测序数据的质量评估和分析，对测序结果进行筛选和修剪，提高数据的准确性和可靠性。 2. 数据比对和拼接 PacBio HiFi测序数据的比对和拼接是非常重要的一环。需要对测序数据进行全基因组比对和拼接，确保数据的完整性和准确性。还需要进行异质单倍型的识别和分析，提高数据的分析深度和全面性。
二代测序DNA样本纯度 什么是二代测序DNA样本纯度 二代测序DNA样本纯度是指DNA样本中所含的目标DNA的比例。在进行二代测序之前，需要对DNA样本进行纯化和测定，以确保所测序的结果准确可靠。 DNA样本纯度的高低直接影响到后续测序的质量和可靠性。高纯度的DNA样本能够减少杂质和污染物对测序结果的影响，提高测序数据的准确性；而低纯度的DNA样本则可能导致测序数据的偏差和错误。 为什么需要测定DNA样本纯度 在进行二代测序之前，需要对DNA样本进行纯化和测定，主要有以下几个原因： 1. 确保测序结果的准确性 DNA样本中可能存在各种杂质和污染物，如RNA、蛋白质和化学试剂残留等。这些杂质和污染物会干扰测序反应，导致测序结果的偏差和错误。通过测定DNA样本的纯度，可以排除这些杂质和污染物的影响，提高测序结果的准确性。 2. 提高测序数据的可靠性 DNA样本的纯度越高，测序数据的可靠性越高。高纯度的DNA样本能够减少测序过程中的偏差和错误，提高测序数据的一致性和可比性。同时，高纯度的DNA样本还能够提高测序反应的效率，减少重复测序的次数，节约测序成本。 3. 保证实验的可重复性 DNA样本的纯度是实验的重要参数之一。在进行科学研究和临床诊断等领域的实验中，需要保证实验的可重复性和结果的可靠性。通过测定DNA样本的纯度，可以确保实验的一致性和可比性，提高实验结果的可重复性。 如何测定DNA样本纯度 1. 比色法 比色法是一种常用的测定DNA样本纯度的方法。该方法通过测定DNA样本在特定波长下的吸光度来估算DNA的浓度和纯度。常用的波长有260nm和280nm，其中 260nm波长对应DNA的吸光度峰值，280nm波长对应DNA和蛋白质的吸光度峰值。通过计算260nm和280nm的比值（A260/A280），可以得到DNA样本的纯度。
测序原始数据参数 测序原始数据（Raw Data）通常指的是测序仪器直接产生的未经处理的数据。这些数据通常以fastq文件格式存储，记录了测序样本的碱基序列信息以及与之相关的质量评分。在处理这些原始数据时，通常会涉及一些参数设置，以下是一些常见的参数及其说明： 1. 测序平台与试剂：不同的测序平台（如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等）和试剂会影响数据的质量和产出。因此，了解所使用的测序平台和试剂对于数据解读至关重要。 2. 测序深度：测序深度指的是测序覆盖的基因组区域的倍数。较高的测序深度可以提高数据的准确性和可靠性，但也会增加成本和计算负担。 3. 质量评分系统：测序数据中的每个碱基通常都会有一个与之相关的质量评分，用于表示该碱基的测序可靠性。不同的测序平台和软件可能使用不同的质量评分系统，如Illumina的ASCII编码或Sanger 的Phred编码。 4. 数据过滤：在原始数据中，可能存在一些低质量的序列或碱基，这些数据在后续分析中可能会产生干扰。因此，通常需要对原始数据进行过滤，去除低质量的序列或碱基。过滤的标准可能包括序列长度、平均质量评分等。 5. 数据拆分与合并：对于双端测序（Paired-End Sequencing）产生的数据，需要将两个端的数据进行拆分和合并。拆分时需要根据测
序引物的序列和位置信息来确定每个端的数据范围；合并时则需要将两个端的数据按照基因组的位置信息进行拼接。 6. 数据压缩与存储：由于原始数据通常较大，为了方便存储和传输，可能需要对数据进行压缩。常用的压缩格式包括gzip（.gz）和bzip2（.bz2）等。 了解这些参数对于正确处理和解读测序原始数据至关重要。在实际操作中，建议根据具体的测序平台、试剂和实验需求来选择合适的参数设置。
quality score 二代测序-回复 Quality Score 二代测序：理解与应用 引言： 随着基因组学领域的发展，高通量测序（Next-Generation Sequencing，NGS）技术被广泛应用于基础科学研究、医学诊断以及生物技术产业等方面。在NGS技术中，quality score（质量分数）是一个重要的参数，它用于评估测序数据的可靠性。本文将介绍quality score的概念、计算方法和应用，以及质量分数对二代测序的影响。 一、quality score的定义： Quality score是一个衡量测序数据质量的数值指标，它代表了一个碱基被测序正确的概率。一般而言，quality score的范围是从0到40，数值越高表示测序结果越可靠。在实际应用中，quality score常以ASCII码表示，其中质量分数为Q表示的ASCII码计算公式为： Q = -10*log10（P） 其中，P是碱基被测序错误的概率。 二、quality score的计算方法： quality score的计算依赖于测序仪器产生的原始测序数据以及质控工具。常见的测序技术包括Illumina、Ion Torrent和PacBio等。在这些平台上，
基于原始测序信号通过软件解析而获得碱基的质量分数。 以Illumina测序平台为例，质量分数的计算使用了Phred算法。具体而言，通过测序仪器读取到的原始测序信号会转化为碱基的质量信息。常见的质量信息包括测序碱基质量、测序碱基质量得分和序列质量得分。 测序碱基质量：它表示测序仪器对某个测序碱基信号的强度的测量值。测序碱基质量得分：它表示测序仪器对测序碱基质量评估的数值，一般以ASCII码表示。 序列质量得分：它表示序列中诸多测序碱基质量得分的平均值，用来代表整个序列质量。 三、quality score的应用： quality score作为评估测序数据质量的指标，对于后续的数据处理和分析有重要的影响。 1. 过滤低质量数据： 在进行数据分析前，常常需要将质量较低的数据进行过滤。低质量的数据可能来自于低质量的碱基调制，或者是由于测序过程中的技术问题。通过设置质量分数的阈值，可以将质量分数低于阈值的测序结果排除。这有助于提高后续分析的准确性和可靠性。 2. 确定变异位点： 在进行基因变异分析时，quality score可用于确定可能发生变异的位点。
簇通过率簇密度二代测序 一、引言 二代测序技术的快速发展和广泛应用，对于研究基因组学和生物信息学领域起到了革命性的作用。在二代测序中，簇通过率和簇密度是两个重要的衡量指标。本文将深入探讨簇通过率、簇密度以及二代测序技术的相关概念、方法和应用。 二、簇通过率 2.1 定义 簇通过率是指在二代测序过程中，原始数据中经过质量控制（QC）筛选后，能够通过后续数据分析流程的比例。簇通过率越高，说明数据中的质量越好，得到的测序结果也更加可靠。 2.2 影响因素 簇通过率受多个因素影响，包括测序仪器的性能、样品的质量和实验操作等。测序仪器的性能包括测序通量、误配率和测序质量等。样品的质量涉及DNA浓度、纯度和片段大小等因素。实验操作方面包括分子生物学实验过程中的操作规范和仪器参数的设置等。 2.3 提高簇通过率的方法 为了提高簇通过率，可以采取以下措施： - 选择合适的测序仪器和测序平台，根 据实验需求进行选择； - 控制样品的质量，确保样品中的DNA浓度适宜，纯度高，片段大小合适； - 优化实验操作，严格按照操作规范进行实验，减少实验误差； - 调整仪器参数，根据实验需求进行优化。
三、簇密度 3.1 定义 簇密度是指测序片段在测序流程中的相对富集程度。簇密度越高，说明测序片段在反应中的相对浓度越高且测序数据质量更好。 3.2 影响因素 簇密度的影响因素与簇通过率类似，与测序仪器性能、样品质量和实验操作等有关。测序仪器的通量决定了每次测序反应中能够容纳的片段数量。样品的质量会影响测序片段的富集程度，质量较好的样品可以获得较高的簇密度。实验操作的规范和仪器参数的设置也会对簇密度产生影响。 3.3 提高簇密度的方法 为了提高簇密度，可以采取以下方法： - 选择合适的测序仪器和测序平台，根据 实验需求选择适合的通量； - 确保样品的质量，提高DNA的浓度并尽量避免污染；- 优化实验操作，减少实验误差，确保测序片段的富集； - 根据实验需求调整仪 器参数，优化测序反应条件。 四、二代测序技术 4.1 定义 二代测序技术是指通过高通量测序仪器获得大量的序列数据，并通过计算机技术进行处理和分析的一种基因组学方法。二代测序技术在基因组学研究、疾病诊断和药物研发等领域有着广泛的应用。 4.2 常用的二代测序技术 常用的二代测序技术包括 Illumina、Ion Torrent 和 PacBio 等。这些技术都具 有高通量、快速和成本低廉的特点，适用于大规模基因组测序、转录组测序和甲基化测序等多个领域。
二代测序数据质控qc-简书 摘要： 1.二代测序数据质控的重要性 2.FastQC工具的安装与使用 3.质控结果的解读与应用 正文： 随着基因测序技术的不断发展，二代测序数据在生命科学研究中的应用越来越广泛。然而，在分析这些数据之前，进行严格的质量控制（QC）至关重要。本文将介绍一种常用的二代测序数据质控工具——FastQC，以及如何安装、使用和解读其质控结果。 一、二代测序数据质控的重要性 二代测序数据质控的主要目的是确保数据的可靠性和准确性。在测序过程中，可能会引入许多噪声和错误，如原始数据中的污染、测序深度不足、读取长度不一致等。这些问题会影响后续数据分析的准确性，甚至导致错误的科研结论。因此，对二代测序数据进行严格的质控是十分必要的。 二、FastQC工具的安装与使用 1.安装FastQC FastQC是一款在Linux系统下运行的免费开源软件，可以用于评估测序数据的质量。为确保顺利安装，请遵循FastQC官方手册的步骤。在Ubuntu 或其他Linux系统中，可以通过以下命令安装： ```bash
conda install -c bioconda fastqc ``` 2.使用FastQC 安装完成后，在命令行中直接运行以下命令进行数据质控： ```bash fastqc [-o output_dir] [--(no)extract] ``` 其中，`output_dir`表示质控结果的输出目录，`--(no)extract`选项用于是否提取原始数据。 3.FastQC结果解读 FastQC会生成一份详细的质控报告，包括以下几个方面： （1）数据概述：提供数据的基本信息，如测序深度、碱基质量等。 （2）质量分布：展示每个碱基质量的分布情况，以便评估测序质量。 （3）序列长度分布：观察序列长度的分布，以确保测序深度足够。 （4）质量评分：评估整个测序数据的质量，可作为筛选cutoff的依据。 （5）污染评估：检测样本中是否存在污染，如测序过程中可能引入的痕量污染物。 三、质控结果的应用 完成质控后，可以根据质控结果对数据进行筛选和优化。常见的质控标准包括： 1.过滤低质量测序读段：根据质量评分、测序深度等因素，设置合适的阈值，剔除低质量测序读段。
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识 近年二代基因测序（next-generation sequencing,NGS)技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用。中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范NGS在分子病理领域的应用。 临床分子病理实验室NGS样本可采用甲醛固定石蜡包埋组织(formalin—fixedparaffin-embedded，FFPE)、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。本共识特色是基于病理评估的组织样本(FFPE、新鲜）的规范。测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重在于目标区域测序（panel）分析的实践。随着技术的更新和应用的成熟,本共识将持续更新以满足临床需求。 一、实验室总体要求 NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、
《测序技术的个体化医学检测应用技术指南(试行）》进行。1。NGS检测人员的资质要求:NGS检测技术人员应具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历,并经过NGS 技术的理论与技能培训合格。数据分析人员应具有临床医学或分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（医学博士学位或高级职称）审核。 2。NGS检测实验室的区域设置要求:原则上NGS实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域(第一扩增区)、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区.各工作区空气及人员流向需要严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本应与组织样本分开。 3。NGS检测试剂及项目要求：试剂和测序平台均应选择中国食品药品监督管理总局（CFDA）认可产品。涉及到实验室自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程(SOP），需经过临床实验室自建项目（LDT）验证合格才可使用。每个NGS检测项目在验证时需要根据建库方法、测序平台和分析工具以及不同的突变类型包括，单碱基突变single
第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则 一、前言 本指导原则主要针对第二代测序（next generation sequencing，NGS）技术检测试剂（以下简称“NGS检测试剂”）产品质量提出指导性要求，涉及基本原则、主要原材料、检测流程及性能评价等方面。 本指导原则是对企业和检验人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于基于NGS技术的检测试剂的质量评价。NGS检测试剂的预期用途包括但不限于以下内容：肿瘤相关基因异常、遗传疾病相关基因异常、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。此类检测试剂涉及的NGS技术包括靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜在生物体的基因组进行测序。原则上不建议企业应用全基因组测序进行检测，如果企业应用全基因组测序技术，应进行充分的技术适用性验证并提交报告。 待测样本可以是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等），检测对象可以是脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或两者的混合物。 本指导原则尽可能覆盖所有的NGS技术原理和测序平台，所讨论和描述的
2015-04-23自由度 本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。 释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988：美国临 床实验室改进修正法规’88 。这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范，中国的临床行业很多项目的指标都参考过CLIA’88 中的内容。 College of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。 相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。 基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。 CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。 二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。 CAP依据NGS实验操作部分和生物信息分析部分分别建立了独立执行标 准和检测事项：实验操作部分检测条目包括标准操作流程文件的建立、流程验证、质量管理体系、数据可靠性验证、异常情况记录及维护更新；生物信息分析部分检测条目包括：变异结果描述、附带结果的报道、数据储存、版本可追溯性及数据传输安全性。
2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应 用专家共识（完整版） 病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomics next generation sequencing,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体。本专家共识就二代测序的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。 一、证据强度和证据质量的分级定义 证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。 二、二代测序的临床需求与应用范围 (一)背景及概述 推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。 推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。
二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA 或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。 二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。另外，二代测序也被报道可用于"排除"检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来[1]。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测，但这些应用通常需要极高的覆盖深度[9]。 从传统培养转向分子生物学诊断需要临床医师及临床微生物学家的思维转变。传统的微生物学是建立在体外分离培养的基础上，而实际上许多环境中或人体的致病微生物难以被培养，或许只能通过二代测序才能被发现[4]。所以临床医师及临床微生物学家很有必要熟悉这个新工具，知晓其优势和局限性。 目前，尚鲜见针对二代测序结果解读的规范，包括序列数阈值，以及灵敏性、特异性评估的统一临床标准等。就像所有其他新技术，在解释数据和报告数据方面仍有很大的困难与挑战[10]。如能进一步规范二代测序在临床感染性疾病中的应用，就可给予临床实践非常重要的线索和信息，协助临床诊断。