罗布麻总黄酮干预p38MAPK__省略_疗大鼠动脉粥样硬化作用及机制研究_张洋
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2 结果 2. 1 胸主动脉形态学观察： 正常对照组大鼠胸主动脉内膜、 中膜和外膜分界清楚。内膜中血管内皮细胞完整； 中膜可见 梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构清晰完整； 外膜为结缔组 织。模型对照组大鼠胸主动脉内膜局部增厚，出现炎性细胞 浸润及泡沫样细胞，弹力纤维发生变化、断裂和崩解，中膜萎 缩，局部出现钙化灶； 阳性药对照组及罗布麻叶总黄酮中、高 剂量组大鼠胸主动脉病理改变较模型对照组有所减轻，仅于 内膜下仅见少量炎细胞浸润及泡沫细胞的浸润，中膜钙灶明 显减少，而罗布麻叶总黄酮低剂量组改善不明显。结果见图 1。
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吉林医学 2016 年 5 月第 37 卷第 5 期
结束后，各组大鼠经水合氯醛麻醉后，眼球取血，置于离心管 中，4℃ 、3 000 r / min 离心 15 min，分离血清，放入 EP 管中，－ 70℃ 冻存。取大鼠胸主动脉，一部分放入 10% 福尔马林溶液 中固定，供病理学观察所用； 一部分放入 － 80℃ 冰箱中，供相 关蛋白检测之用。 1. 4 大鼠胸主动脉病理学观察： 取固定好的胸主动脉，制备 石蜡标本、切片，苏木精染色 10 min，流水稍洗，体积分数 1% 的盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，伊红染色 5 min，流水稍 洗，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片。于光镜下随机选择 10 个视野，观察各组大鼠胸主动脉的病理变化。 1. 5 大鼠血脂指标检测： 取冻存血清，室温下溶解，用直接法 测定血清中 HDL － C、LDL － C，GPO － PAP 酶法测定血清中 TG，COD － PAP 法测定血清中 TC，应用酶标仪在 510 nm 波长 下检测 TC、TG 的含量，在 546 nm 波长下检测 HDL － C、LDL － C 的含量。 1. 6 Elisa 法检测血清 hs － CＲP 的水平： 包被液稀释抗原，各 取 0. 3 ml 加入酶标板孔中，4℃ 过夜，次日移去包被液，每孔加 被检血清 0. 2 ml，37℃ 孵育 1 h，每孔加酶标检测抗体 0. 2 ml， 37℃ 孵育 1 h，每孔再加入 0. 2 ml ABC 液，加终止液，酶标仪在 450 nm 测定 OD 值，按照试剂盒的方法转换成浓度水平。 1. 7 Western － bloting 法检测相关蛋白： 取各组大鼠胸主动脉 组织，制备组织匀浆，每 20 mg 组织加入 160 μl 含 1 mmol / L
PMSF 的裂解 液，4℃ 、12 000 r / min 离 心 15 min，取 上 清，用 BCA 法测定蛋白浓度。50 μg 总蛋白上样量以浓度为 10% 的 凝胶电泳进行分离。冰浴下恒流（ 200 mA） 湿法转膜 2 h，体积 分数 5% 的脱脂奶粉封闭 1 h 后与相应一抗 4℃ 共孵育过夜。 TBST 洗液洗涤，与辣根过氧化物标记的二抗共孵育 1 h，TBST 洗液洗涤，用增强型化学发光试剂进行显影，并利用灰度分析 软件定量分析。 1. 8 统计学分析： 应用 SPSS19. 0 统计软件进行数据处理，数 据以均数 ± 标准差（ x ± s） 表示，组间差异比较采用方差分析 及 t 检验，以 P ＜ 0. 05 为差异具有统计学意义。
LDL － C 0. 615 ± 0. 071 3. 469 ± 0. 640① 1. 609 ± 0. 363①②
罗布麻叶总黄酮 低剂量组 中剂量组 高剂量组
0. 306 ± 0. 059①③ 0. 223 ± 0. 039①② 0. 219 ± 0. 043①②
3. 889 ± 0. 619①②③ 3. 427 ± 0. 848①② 2. 839 ± 0. 739①②
基金 项 目： 吉 林 省 科 学 技 术 厅 重 点 科 技 攻 关 项 目 ［项 目 编 号： 20150204015YY］ 通讯作者： 任立群
片购自杭州默沙东制药有限公司； 胆酸钠、胆固醇购自美国 Sigma 公司； p38MAPK、p － p38MAPK、NF － κBp65 抗体购自美 国 Santa Cruz 公司； IL － 6 抗体购自美国 AB clone 公司； hs － CＲP 试剂盒购自上海美欣生物工程有限公司。 1. 2 罗布麻叶总黄酮的提取分离、纯化及含量测定： 将干燥 的罗布麻叶粉碎过 20 ～ 50 目筛成药粉，用 10 倍量的浓度为 75% 的乙醇加热回流 2 h，提取 2 次，合并提取液，滤过，回收 乙醇，浓缩，得到浓缩液； 将浓缩液用 D101 大孔树脂进行纯 化，先用水洗，再用 50% 乙醇洗脱，滤液合并、浓缩即得罗布麻 叶总黄酮［4］。分光光度法检测提取物总黄酮质量分数（ 以芦 丁计） ≥72% ，HPLC 法对其中黄酮类物质进行测定，金丝桃苷 为 4. 59% 、芦丁 9. 86% 、槲皮素 0. 12% 。
［收稿日期： 2015 － 05 － 04 编校： 李晓飞］
罗布麻总黄酮干预 p38MAPK / NF － κB 信号通路治疗 大鼠动脉粥样硬化作用及机制研究
张 洋，俞博毅，高婷婷，姬璐静，陈 健，任立群 （ 吉林大学药学院，吉林 长春 130021）
［摘 要］ 目的： 观察罗布麻叶总黄酮对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉中 p38MAPK / NF － κB 信号通路相关蛋白表 达的影响，探讨罗布麻叶总黄酮干预 AS 的作用及其可能的作用机制。方法： 72 只雄性 Wistar 大鼠随机分为正常对照 组、模型对照组、阳性药对照组及罗布麻叶总黄酮低、中、高剂量组。除正常对照组外，其他各组连续 3 天注射维生素 D3 后喂饲高脂饲料 9 周，进行造模，造模结束后各组分别给药 4 周。实验结束后，取大鼠胸主动脉，常规制备石蜡标本，HE 染色，光镜下观察大鼠胸主动脉的病变情况； 分光光度法检测血清 TC、TG、LDL － C、HDL － C 水平； Western － bloting 法检 测 p38MAPK、p － p38MAPK、NF － κB、IL － 6 蛋白的表达。结果： 罗布麻叶总黄酮中、高剂量组能显著改善胸主动脉壁病 变，减少胸主动脉内皮下泡沫细胞及脂质空泡，并可降低大鼠血清中 LDL － C、TC、TG 水平以及 hs － CＲP 的含量，提高 HDL － C； 同时发现罗布麻叶总黄酮中、高剂量组可以抑制 p38MAPK 的磷酸化，降低 NF － κB、IL － 6 蛋白的表达。结论： 罗布麻叶总黄酮对大鼠动脉粥样硬化具有明显的治疗作用，其抗 AS 的作用可能是通过干预 p38MAPK / NF － κb 信号通 路下调相关蛋白来实现的。
1. 3 实验动物分组、AS 模型制备及取材： 72 只 Wistar 大鼠适 应性饲养 1 周后，随机分为 6 组（ 每组 12 只） ，分别为： 正常对 照组，模型对照 组，阳 性 药 对 照 组，罗 布 麻 叶 总 黄 酮 低、中、高 剂量组。除正常对照组外其他各组连续注射 Vit D3 3 d（ 共 70 U / kg） ，然后喂饲高脂饲料（ 高脂饲料组成： 80. 8% 基础饲 料，3. 5% 胆固醇、10% 猪油、0. 2% 丙硫氧嘧啶、0. 5% 胆酸钠、 5% 白砂糖） 9 周。第 10 周开始罗布麻叶总黄酮低、中、高剂量 组每日分别灌胃罗布麻叶总黄酮 25 mg / kg、50 mg / kg、100 mg / kg，阳性药对照组灌胃辛伐他丁 4 mg / kg，正常对照组及模型 对照组给予同体积的生理盐水，1 次 / d，连续给药 4 周。实验
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and criteria for its diagnosis［J］. J Clin Invest，1946，25（ 1） ： 30. ［6］ Belliard A，Sottejeau Y，Duan Q，et al. Modulation of cardiac Na + － K + － ATPase cell surface abundance by simulated ischemia － reperfusion and ouabain preconditioning［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，304（ 1） ： H94. ［7］ McNutt NS，Weinstein ＲS. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions ［J］. Prog Biophys Mol Biol，
1973，26（ 26） ： 45. ［8］ Wang N，De Vuyst E，Ponsaerts Ｒ，et al. Selective inhibition of Cx43 hemichannels by Gap19 and its impact on myocardial ischemia / reperfusion injury［J］. Basic Ｒes Cardiol，2013，108 （ 1） ： 309.
0. 203 ± 0. 031①②③ 0. 269 ± 0. 054①② 0. 对照组比较，模型对照组大鼠血 清 TG、TC、LDL － C 含量均明显升高，而 HDL － C 含量则降低。 与模型对照组相比，阳性药对照组及罗布麻叶总黄酮各组均 可不同程度的降低大鼠血清 TG、TC、LDL － C 水平，提高 HDL － C 水平，其中罗布麻叶总黄酮中、高剂量组及阳性药对照组 上述指标的改善与模型对照组差异具有统计学意义 （ P ＜ 0. 05） 。各治疗组中以高剂量组改善各项指标为最佳，与阳性 药对照组比较无明显差异，而罗布麻叶总黄酮低剂量组的变 化与模型对照组相比，不具有统计学意义。结果见表 1。
表 1 罗布麻叶总黄酮对各组大鼠血脂的影响（ n = 12，x ± s，mol / L）
组别 正常对照组 模型对照组 阳性药对照组
TG 0. 111 ± 0. 018 0. 329 ± 0. 028① 0. 212 ± 0. 034①②
TC 1. 485 ± 0. 176 5. 000 ± 0. 658① 3. 203 ± 0. 205①②
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结束后，各组大鼠经水合氯醛麻醉后，眼球取血，置于离心管 中，4℃ 、3 000 r / min 离心 15 min，分离血清，放入 EP 管中，－ 70℃ 冻存。取大鼠胸主动脉，一部分放入 10% 福尔马林溶液 中固定，供病理学观察所用； 一部分放入 － 80℃ 冰箱中，供相 关蛋白检测之用。 1. 4 大鼠胸主动脉病理学观察： 取固定好的胸主动脉，制备 石蜡标本、切片，苏木精染色 10 min，流水稍洗，体积分数 1% 的盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，伊红染色 5 min，流水稍 洗，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片。于光镜下随机选择 10 个视野，观察各组大鼠胸主动脉的病理变化。 1. 5 大鼠血脂指标检测： 取冻存血清，室温下溶解，用直接法 测定血清中 HDL － C、LDL － C，GPO － PAP 酶法测定血清中 TG，COD － PAP 法测定血清中 TC，应用酶标仪在 510 nm 波长 下检测 TC、TG 的含量，在 546 nm 波长下检测 HDL － C、LDL － C 的含量。 1. 6 Elisa 法检测血清 hs － CＲP 的水平： 包被液稀释抗原，各 取 0. 3 ml 加入酶标板孔中，4℃ 过夜，次日移去包被液，每孔加 被检血清 0. 2 ml，37℃ 孵育 1 h，每孔加酶标检测抗体 0. 2 ml， 37℃ 孵育 1 h，每孔再加入 0. 2 ml ABC 液，加终止液，酶标仪在 450 nm 测定 OD 值，按照试剂盒的方法转换成浓度水平。 1. 7 Western － bloting 法检测相关蛋白： 取各组大鼠胸主动脉 组织，制备组织匀浆，每 20 mg 组织加入 160 μl 含 1 mmol / L
PMSF 的裂解 液，4℃ 、12 000 r / min 离 心 15 min，取 上 清，用 BCA 法测定蛋白浓度。50 μg 总蛋白上样量以浓度为 10% 的 凝胶电泳进行分离。冰浴下恒流（ 200 mA） 湿法转膜 2 h，体积 分数 5% 的脱脂奶粉封闭 1 h 后与相应一抗 4℃ 共孵育过夜。 TBST 洗液洗涤，与辣根过氧化物标记的二抗共孵育 1 h，TBST 洗液洗涤，用增强型化学发光试剂进行显影，并利用灰度分析 软件定量分析。 1. 8 统计学分析： 应用 SPSS19. 0 统计软件进行数据处理，数 据以均数 ± 标准差（ x ± s） 表示，组间差异比较采用方差分析 及 t 检验，以 P ＜ 0. 05 为差异具有统计学意义。
LDL － C 0. 615 ± 0. 071 3. 469 ± 0. 640① 1. 609 ± 0. 363①②
罗布麻叶总黄酮 低剂量组 中剂量组 高剂量组
0. 306 ± 0. 059①③ 0. 223 ± 0. 039①② 0. 219 ± 0. 043①②
3. 889 ± 0. 619①②③ 3. 427 ± 0. 848①② 2. 839 ± 0. 739①②
基金 项 目： 吉 林 省 科 学 技 术 厅 重 点 科 技 攻 关 项 目 ［项 目 编 号： 20150204015YY］ 通讯作者： 任立群
片购自杭州默沙东制药有限公司； 胆酸钠、胆固醇购自美国 Sigma 公司； p38MAPK、p － p38MAPK、NF － κBp65 抗体购自美 国 Santa Cruz 公司； IL － 6 抗体购自美国 AB clone 公司； hs － CＲP 试剂盒购自上海美欣生物工程有限公司。 1. 2 罗布麻叶总黄酮的提取分离、纯化及含量测定： 将干燥 的罗布麻叶粉碎过 20 ～ 50 目筛成药粉，用 10 倍量的浓度为 75% 的乙醇加热回流 2 h，提取 2 次，合并提取液，滤过，回收 乙醇，浓缩，得到浓缩液； 将浓缩液用 D101 大孔树脂进行纯 化，先用水洗，再用 50% 乙醇洗脱，滤液合并、浓缩即得罗布麻 叶总黄酮［4］。分光光度法检测提取物总黄酮质量分数（ 以芦 丁计） ≥72% ，HPLC 法对其中黄酮类物质进行测定，金丝桃苷 为 4. 59% 、芦丁 9. 86% 、槲皮素 0. 12% 。
［收稿日期： 2015 － 05 － 04 编校： 李晓飞］
罗布麻总黄酮干预 p38MAPK / NF － κB 信号通路治疗 大鼠动脉粥样硬化作用及机制研究
张 洋，俞博毅，高婷婷，姬璐静，陈 健，任立群 （ 吉林大学药学院，吉林 长春 130021）
［摘 要］ 目的： 观察罗布麻叶总黄酮对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉中 p38MAPK / NF － κB 信号通路相关蛋白表 达的影响，探讨罗布麻叶总黄酮干预 AS 的作用及其可能的作用机制。方法： 72 只雄性 Wistar 大鼠随机分为正常对照 组、模型对照组、阳性药对照组及罗布麻叶总黄酮低、中、高剂量组。除正常对照组外，其他各组连续 3 天注射维生素 D3 后喂饲高脂饲料 9 周，进行造模，造模结束后各组分别给药 4 周。实验结束后，取大鼠胸主动脉，常规制备石蜡标本，HE 染色，光镜下观察大鼠胸主动脉的病变情况； 分光光度法检测血清 TC、TG、LDL － C、HDL － C 水平； Western － bloting 法检 测 p38MAPK、p － p38MAPK、NF － κB、IL － 6 蛋白的表达。结果： 罗布麻叶总黄酮中、高剂量组能显著改善胸主动脉壁病 变，减少胸主动脉内皮下泡沫细胞及脂质空泡，并可降低大鼠血清中 LDL － C、TC、TG 水平以及 hs － CＲP 的含量，提高 HDL － C； 同时发现罗布麻叶总黄酮中、高剂量组可以抑制 p38MAPK 的磷酸化，降低 NF － κB、IL － 6 蛋白的表达。结论： 罗布麻叶总黄酮对大鼠动脉粥样硬化具有明显的治疗作用，其抗 AS 的作用可能是通过干预 p38MAPK / NF － κb 信号通 路下调相关蛋白来实现的。
1. 3 实验动物分组、AS 模型制备及取材： 72 只 Wistar 大鼠适 应性饲养 1 周后，随机分为 6 组（ 每组 12 只） ，分别为： 正常对 照组，模型对照 组，阳 性 药 对 照 组，罗 布 麻 叶 总 黄 酮 低、中、高 剂量组。除正常对照组外其他各组连续注射 Vit D3 3 d（ 共 70 U / kg） ，然后喂饲高脂饲料（ 高脂饲料组成： 80. 8% 基础饲 料，3. 5% 胆固醇、10% 猪油、0. 2% 丙硫氧嘧啶、0. 5% 胆酸钠、 5% 白砂糖） 9 周。第 10 周开始罗布麻叶总黄酮低、中、高剂量 组每日分别灌胃罗布麻叶总黄酮 25 mg / kg、50 mg / kg、100 mg / kg，阳性药对照组灌胃辛伐他丁 4 mg / kg，正常对照组及模型 对照组给予同体积的生理盐水，1 次 / d，连续给药 4 周。实验
吉林医学 2016 年 5 月第 37 卷第 5 期
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and criteria for its diagnosis［J］. J Clin Invest，1946，25（ 1） ： 30. ［6］ Belliard A，Sottejeau Y，Duan Q，et al. Modulation of cardiac Na + － K + － ATPase cell surface abundance by simulated ischemia － reperfusion and ouabain preconditioning［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，304（ 1） ： H94. ［7］ McNutt NS，Weinstein ＲS. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions ［J］. Prog Biophys Mol Biol，
1973，26（ 26） ： 45. ［8］ Wang N，De Vuyst E，Ponsaerts Ｒ，et al. Selective inhibition of Cx43 hemichannels by Gap19 and its impact on myocardial ischemia / reperfusion injury［J］. Basic Ｒes Cardiol，2013，108 （ 1） ： 309.
0. 203 ± 0. 031①②③ 0. 269 ± 0. 054①② 0. 对照组比较，模型对照组大鼠血 清 TG、TC、LDL － C 含量均明显升高，而 HDL － C 含量则降低。 与模型对照组相比，阳性药对照组及罗布麻叶总黄酮各组均 可不同程度的降低大鼠血清 TG、TC、LDL － C 水平，提高 HDL － C 水平，其中罗布麻叶总黄酮中、高剂量组及阳性药对照组 上述指标的改善与模型对照组差异具有统计学意义 （ P ＜ 0. 05） 。各治疗组中以高剂量组改善各项指标为最佳，与阳性 药对照组比较无明显差异，而罗布麻叶总黄酮低剂量组的变 化与模型对照组相比，不具有统计学意义。结果见表 1。
表 1 罗布麻叶总黄酮对各组大鼠血脂的影响（ n = 12，x ± s，mol / L）
组别 正常对照组 模型对照组 阳性药对照组
TG 0. 111 ± 0. 018 0. 329 ± 0. 028① 0. 212 ± 0. 034①②
TC 1. 485 ± 0. 176 5. 000 ± 0. 658① 3. 203 ± 0. 205①②
