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油茶果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因(CoFBA4)的分子特征与表达分析

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第４９卷第１　１期　２　０　１　３年ｌ１月　

林　业　科　学　

ＳＣＩＥＮＴＩＡ　ＳＩＬＶＡＥ　ＳＩＮＩＣＡＥ　Ｖｏ１．４９，Ｎｏ．１１　

Ｎｏｖ．，２　０　１　３　

ｄｏｉ：１０．１　１７０７／ｊ．１００１—７４８８．２０１３１　１２３　

油茶果糖一１。６一二磷酸醛缩酶基因【ＣｏＦＢＡ４）的分子特征与表达分析　曾艳玲　谭晓风　蒋　瑶　（中南林业科技大学森林培养与保护教育部重点实验室　刘　敏　王建勇　周俊琴　经济林育种与栽培国家林业局重点实验室　长沙４１０００４）　关键词：　油茶；果糖一１，６一二磷酸醛缩酶；基因克隆；基因表达；亚细胞定位　中图分类号：ｓ７１８．４６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—７４８８（２０１３）１１一Ｏｌ６４—０７　

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－１，６－Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｇｅｎｅ（ＣＤＦ丑Ａ４）ｆｒｏｍ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｏｌｅｉｆｅｒａ　

Ｚｅｎｇ　Ｙａｎｌｉｎｇ　Ｔａｎ　Ｘｉａｏｆｅｎｇ　Ｊｉａｎｇ　Ｙａｏ　Ｌｉｕ　Ｍｉｎ　Ｗａｎｇ　Ｊｉａｎｙｏｎｇ　Ｚｈｏｕ　Ｊｕｎｑｉｎ　ｒＫｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏ，Ｎｏｎ—Ｗｏｏｄ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｔｒｅｅｓ　ｏｆＭｉｎ￣ｔｒｙ　ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＮｏｎ—Ｗｏｏｄ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｔａｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００４）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ一１，６－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ（ＦＢＡ）ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｓ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ　ｐａｔｈｗａｙ　ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｕｒｃｅ　ｆｏｒ　ｔｗｏ　ｋｅｙ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｏｉｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ａ　ｎｅｗ　ＦＢＡ　ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｏｌｅｉｆｅｒａ　ｓｅｅｄ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＲＡＣＥ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ＣｏＦＢＡ４（ＧｅｎＢａｎｋ　ｎｕｍｂｅｒ：ＪＸ９１４５９０）．ＣｏＦＢＡ４　ｈａｄ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｗｉｔｈ　１　１８５　ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　３９４　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＣｏＦＢＡ４　ｈａｄ　ｎｅａｒｅｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ＦＢＡ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，ａｎｄ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ａ．　ＣｏＦＢＡ４　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ一１，６－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｓｉｔｅ，ｂｕｔ　ｈａｄ　ｎｏ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ．　ＣｏＦＢＡ４　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＣｏＦＢＡ４　ａｃｔｅｄ　ｏｕｔ　ｏｆ　ｃｅｌ１．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ＣｏＦＢＡ４　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｏｉｌ　ｙｉｅｌｄ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｃｌｏｎｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍａｔｕｒｉｔｙ　ｐｅｒｉｏｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｏｌｅｉｆｅｒａ；ｆｒｕｃｔｏｓｅ一１，６－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｓｕｂｅｅｌｌｕｌａｒ　】ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　

果糖一１，６一二磷酸醛缩酶（ｆｒｕｃｔｏｓｅ一１，６一　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ，ＦＢＡ，ＥＣ４．１．２．１３），简称醛缩　酶，是糖酵解代谢途径中第４步关键酶，催化果糖一　１，６一二磷酸（Ｆｒｕ一１，６－ＢＰ）可逆地裂解为磷酸二羟　丙酮（ＤＨＡＰ）和３一磷酸甘油醛（Ｇ．３一Ｐ）（Ｒｕｔｔｅｒ，　１９６４）。其中，ＤＨＡＰ经甘油磷酸脱氢酶的催化，还　原生成３一磷酸甘油，然后在脂酰转移酶的作用下　生成磷脂酸，再经磷脂酸磷酸酶水解，形成油脂合成　必需的酯化甘油骨架（Ｖｉｇｅｏｌａｓ　ｅｔ　ａ１．，２００７）；Ｇ一３一Ｐ　则经过多步反应最终形成丙酮酸，产生乙酰辅酶Ａ，　经乙酰辅酶Ａ羧化酶作用形成脂肪酸合成的底物　丙二酸单酰辅酶Ａ，经过一系列聚合反应形成油脂　合成的另一必需元素脂肪酸（Ｔｈｅｌｅｎ　ｅｔ　ａ１．，２００２）。　油茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｏｌｅｉｆｅｒａ）是我国大力推广的优良　食用油料树种，但产油率低是制约油茶产业快速发　展的主要原因。为了从根本上提高油茶产油率，近　年来关于油茶油脂合成代谢途径调控基因的研究较　多（谭晓风等，２００８ａ；２００８ｂ；张党权等，２００８），但　是大部分都集中在脂肪酸方面，对于调控甘油三磷　酸的基因研究甚少。油茶果糖一１，６一二磷酸醛缩　酶不仅影响脂肪酸的合成，而且为油脂骨架的构建　提供原料。因此，本文根据本实验室构建的油茶种　仁转录组数字化文库分析，从油茶种仁中分离克隆　了ＣｏＦＢＡ４的全长ｃＤＮＡ，采用生物信息学方法对其　进行了较为系统的分析，并在此基础上开展了亚细　胞定位研究及表达差异检测。　

１材料与方法　１．１　材料油茶优良品种‘华硕’（‘ＨＳ’）（谭晓风　等，２０１１）采自湖南省长沙市望城县东城镇中南林　

收稿日期：２０１３—０４—０３；修回Ｆｔ期：２０１３—０６—２９。　基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７０６０３）；中南林业科技大学青年基金重点项目（ＱＪ２０ＩＩＯ０８Ａ）。　谭晓风为通讯作者　第１１期　曾艳玲等：油茶果糖一１，６一二磷酸醛缩酶基因（ＣｏＦＢＡ４）的分子特征与表达分析　１６５　业科技大学油茶基地，‘华鑫’（‘ＨＸ’）、‘华金’　（‘ＨＪ’）、‘衡东６５’（‘ＨＤ６５’）、‘衡东１７’　（‘ＨＤ１７’）、‘茶陵７８’（‘ＣＬ７８’）、‘茶陵二仙２６８’　（‘ＣＬＥＸ２６８’）、‘茶陵二仙３４３’（‘ＣＬＥＸ３４３’）等　品种采自株洲马家河油茶基地，采样后迅速存于　一８０℃超低温冰箱备用。本生烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、载体ｐＥＧＡＤ和农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＧＶ３１０３为湖南大学生物学院生物　能源与材料研究中心惠赠，大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５　为本实验室保藏。　１．２　酶与试剂ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ　ＦａｓｔＰｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　和ｐＥＡＳＹ．Ｂｌｕｎｔ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ购自北京全式金　生物技术有限公司，２×Ｔａｑ　ＰＣＲ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、质粒提　取试剂盒和ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自天根生化科　技（北京）有限公司，ＲＮＡ提取和反转录试剂盒购自　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ购　自ＱＩＡＧＥＮ公司。　１．３　方法　１）总ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ合成　取油　茶近成熟种仁，根据ＲＮＡ提取和反转录试剂盒说明　书提供的方法提取总ＲＮＡ，电泳检测之后，逆转录　成ｃＤＮＡ第１链，用ＲＮａｓｅＨ消化ｃＤＮＡ产物。　２）全长ｃＤＮＡ克隆根据本实验室构建的‘华　硕’油茶转录组数据库得到的ＣｏＦＢＡ４基因序列设　计特异引物，分别为ＣｏＦＢＡ４Ｆ：ＧＴｃＣＴｃｃＴｃＣＴＧＣ　ＣＧＡＴＴＣＧＣＣＡＣＴ：ＣｏＦＢＡ４Ｒ：ＡＡＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡ　ＧＧＡＣＧＡＴＣＣＡＧ，由北京华大生物技术有限公司合　成。ＰＣＲ反应体系（５Ｏ　ＩｘＬ）为５’×Ｔｒａｎｓ　Ｓｔａｒｔ　Ｆａｓｔ　Ｐｆｕ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ“ｐｌｕｓ）１０．０　Ｌ，２．５　ｍｍｏｌ・Ｌ　ｄＮＴＰｓ　５．０　ＩｘＬ，ｃＤＮＡ　１．０　ｌｘＬ，Ｔｒａｎｓ　Ｓｔａｒｔ　Ｆａｓｔ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１．０　Ｌ，ＣｏＦＢＡ４Ｆ（１０　ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ　）　１　ｐ，Ｌ，ＣｏＦＢＡ４Ｒ（１０　ｔｘｍｏｌ・Ｌ　）１　ｌｘＬ，超纯水３１．０　ＩｘＬ。ＰＣＲ扩增条件为９５℃预变性５　ｍｉｎ；９５℃变　性３０　Ｓ，５５　ｏＣ退火３０　Ｓ，７２　ｏＣ延伸１　ｍｉｎ，３５个循　环；７２℃延伸８　ｍｉｎ；４℃保温。采用１．２％的琼脂　糖凝胶电泳，根据试剂盒说明进行回收连接，转化大　肠杆菌ＤＨ　５　０Ｌ菌株，抗生素筛选后提取阳性克隆质　粒，委托上海博尚生物技术有限公司测序。　３）序列生物信息学分析　利用ＮＣＢＩ的　ＢＬＡＳＴ功能（ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／　ＢＬＡＳＴ）搜索同源的核苷酸序列及氨基酸序列；利　用ＭＥＧＡ　４．０（ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．ｂｉｏ．ｓｏｆｔ．ｎｅｔ）程序的　ＵＰＧＭＡ算法构建ＦＢＡ蛋白的系统进化树；利用软　件ＡｎｔｈｅＰｒｏ　５．０（ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．ｂｉｏ。ｓｏｆｔ．ｎｅｔ）进行蛋白　跨膜结构预测，ｈｔｔｐ：∥ｃｅｌｌｏ．１ｉｆｅ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ在线进　行亚细胞定位；ｈｔｔｐ：∥ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．　ｈｔｍｌ在线分析蛋白亲疏水性；ｈｔｔｐｓ：／／ＷＷＷ．　ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ在线分析蛋白二级结构。　４）不同无性系特异表达与出油率检测　取不　同无性系油茶种仁提取ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ，采用　实时荧光ＰＣＲ技术确定ＣｏＦＢＡ４基因的相对表达　量，每样做３个平行重复检测。ＰＣＲ引物分别为　ｑＣｏＦＢＡ４Ｆ：ＧＡＧＡＴＴＣＴｒＣＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴ；　ｑＣｏＦＢ　Ａ４Ｒ：ＣＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＡＴＴＴＧＧｃ。ＰＣＲ反应体　系为２×ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　１２．５　Ｌ，ｑＣｏＦＢＡ４Ｆ（１０　Ｉｘｍｏｌ・Ｌ　）０．５　Ｌ，　ｑＣｏＦＢＡ４Ｒ（１０　Ｉｘｍｏｌ・Ｌ　）０．５　ＩｘＬ，ｃＤＮＡ　１．０　ＩｘＬ，超　纯水９．５　ＩｘＬ。ＰＣＲ扩增条件为９５℃预变性５　ｍｉｎ；　９５℃变性１０　Ｓ，５５℃退火３０　Ｓ，共４０个循环。油脂　提取采用索氏提取法（谢鹏等，２０１０），出油率＝　（提取油茶种仁的油脂质量／油茶种仁干粉质量）×　１００％。利用软件ＳＰＳＳ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　１７．０（ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．　ｓｔａｔｈｏｍｅ．ｃｎ）进行统计学分析。　５）表达载体构建根据载体ｐＥＧＡＤ多克隆位　点设计５　端添加ＥｃｏＲ　Ｉ酶切位点的上游引物　ＣｏＦＢＡ４ＺＦ：５　一ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＴＧＴＹＣＧＡＧ　ＴＴ－　３　；５　端添加Ｓａｍ　Ｉ酶切位点的下游引物　ＣｏＦＢＡ４ＺＲ：５　一ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＴＡＧＴＡＧＧＴＡＴＡ　ＧＣＣ－　３　。以阳性质粒为模板ＰＣＲ扩增，回收连接至　ｐＥＡＳＹ—Ｂｌｕｎｔ载体上，经测序正确后采用ＥｃｏＲ　Ｉ和　Ｓａｍ　Ｉ双酶切连接至载体ｐＥＧＡＤ多克隆位点，构建　包含ＣｏＦＢＡ４和ｅＧＦＰ融合植物表达载体。　６）亚细胞定位观察　将融合植物载体转化农　杆菌，挑取阳性克隆单菌落接种于３　ｍＬ含有利福平　（Ｒｉｆ，５０　Ｉ．Ｌｇ・ｍＬ　）和卡那霉素（Ｋａｎ，１００　ｔｘｇ・　ｍＬ　）的ＬＢ液体培养基中，２８　ｏＣ，１８０　ｒ・ｍｉｎ　培　养ｌ６～２４　ｈ。取１　ｍＬ活化后菌液于５０　ｍＬ同样的　ＬＢ培养基中，２８℃，２００　ｒ・ｍｉｎ　培养至ＯＤ㈣为　０．８—１．０。３　０００　ｒ・ｍｉｎ～，离心２０　ｍｉｎ，收集菌体　细胞，用终浓度为１０　ｍｍｏｌ・Ｌ～ＭｇＣ１２、１０　ｍｍｏｌ・Ｌ　ＭＥＳ（调节ｐＨ至５．７）、２００　Ｉ．Ｌｍｏｌ・Ｌ　乙酰丁香酮的　无菌水溶液重悬至ＯＤ　为１．０。室温放置３　ｈ后，　用去掉针头的无菌１　ｍＬ针筒浸润生长１个月左右　烟草植株中部完全伸长的３个叶片。接种后的烟草　植株置于２８℃、光／暗周期（１６　ｈ／８　ｈ）培养３６　ｈ，将　浸润部位剪成０．５～１．０　ｃｍ　小块，叶背面朝上，在激　光共聚焦显微镜下观察ｅＧＦＰ的荧光信号，分析　ＣｏＦＢＡ４蛋白的亚细胞定位。同时，采用基因枪法　将重组质粒转化洋葱（Ａｌｌｉｕｍ　ｃｅｐａ）表皮细胞，观察　ｅＧＦＰ的荧光信号（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａ１．，１９９４）。

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油茶果实形态学性状、生理特性与炭疽病的关系

油茶果实形态学性状、生理特性与炭疽病的关系

油茶果实形态学性状、生理特性与炭疽病的关系沈雅飞;段文军;曹志华;胡娟娟;吴炜;汪玲;束庆龙【摘要】于油茶炭疽病发生盛期,在没有进行任何防治的油茶纯林中,选取每个果实类型的植株20棵,在每样株树冠外围中上部,从东、南、西、北4个方向分别抽查果实25个,统计病果数,计算其发病率,并采集每样株未感病的果实30个,测定其形态学性状和生理生化指标,研究油茶果实形态学性状和生理特性与炭疽病发病率的关系.结果表明:(1)发病率与果实颜色和pH呈显著正相关(相关系数分别为0.7056和0.0170),与相对电导率呈极显著正相关(相关系数为0.8370),与花青素含量和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性呈负相关,且达到极显著水平(相关系数分别为-0.0764和-0.6466).(2)果实颜色、相对电导率、PAL活性、pH和花青素含量对发病率的贡献值较大,对发病率的决定系数分别为0.2821、0.9730、0.4181、0.3670和0.0584.油茶抗病性较稳定的果实形态学特征是:较大(果径为34.44-40.52 am)的紫红球、栗红球和纯青球;果皮生理特性是:较小的相对电导率和pH,较高的PAL活性和花青素含量.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(044)004【总页数】6页(P373-378)【关键词】油茶果实;炭疽病;形态学性状;生理特性;相关性分析;通径分析【作者】沈雅飞;段文军;曹志华;胡娟娟;吴炜;汪玲;束庆龙【作者单位】中国林业科学研究院,北京100091;中国林业科学研究院,北京100091;安徽省林业科学研究院,安徽合肥230036;安徽农业大学林学与园林学院,安徽合肥230036;安徽农业大学林学与园林学院,安徽合肥230036;宿州学院特色种植业苗种生产工程技术研究中心,安徽宿州234000;安徽农业大学林学与园林学院,安徽合肥230036【正文语种】中文【中图分类】S794.4炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)是我国油茶(Camellia oleifera)的主要病害，会造成大量花蕾、果实和叶片脱落及枝梢干枯，严重降低了油茶的经济效益[1].所幸的是在油茶的自然群体中存在多种抗病高产类型，选育油茶抗病良种是从根本上预防或降低炭疽病危害的有效途径.随着对炭疽病发病机理研究的不断深入，对其抗病因子的筛选也逐步完善[2].李春玲[3]研究发现，芒果感染炭疽病后，会在一定程度上诱导超氧化物歧化酶和多酚氧化酶这两种防御酶的合成，从而提高果实对炭疽病的抗性.Park et al[4]研究显示，辣椒果实感染炭疽菌后，会诱导一系列相关基因的表达，在果皮组织中产生并积累大量的酚类化合物，从而表现出抗病性.长期以来，油茶炭疽病与果皮酶活性和内含物的关系一直受到研究者的广泛关注.曹志华[5]研究发现，过氧化物酶的活性与酚类化合物的合成密切相关，其含量的增多可提高油茶的抗病性.还有研究发现，果皮中还原性糖含量低的油茶品种表现为感病[6]，但目前尚未见油茶果实形态学性状(如果实的形状和大小)与炭疽病发病率关系的研究.相关性与通径分析是研究多个相关变量与炭疽病的关系更为有效的方法，故本试验选择不同果实类型的油茶植株，调查统计不同类型果实炭疽病的发病率，测定其果实形态学性状和果皮的生理生化指标，运用相关性和通径分析方法，研究其与炭疽病发病率的关系，旨在从中筛选出抗病性较稳定的相关性状，为提高油茶群体的育种效率提供理论依据.1.1 试验地概况试验地位于安徽省舒城县河棚镇，东经116°26′-117°15′，北纬31°01′-31°34′，海拔220.3 m，地处于大别山余脉，属于亚热带湿润季风气候区，年均气温15.6 ℃，年均日照时数1969.2 h，年均降雨量1100 mm，无霜期224 d，土壤为砾质壤土，厚度30-60 cm，pH为4.5-6.5，养分含量丰富，阳光充足，雨水丰富，为油茶适宜分布区.试验林为油茶种植园，平地，四周环山，常年湿度较大，是炭疽病易发生区.试验林于1997年春营造，油茶品种均为普通油茶，造林面积10 hm2，株行距为2 m×3 m，造林后按照常规方法进行抚育管理，没有进行病虫害防治.1.2 材料试验材料均来源于安徽省德昌苗木有限公司，为油茶种植园中普通油茶品种的不同果实类型的植株.1.3 研究方法在2010-2012年9月下旬病害发生盛期，全面踏查没有任何防治的油茶试验林，同时对照文献[7]中关于油茶果实的照片和描述，记录不同的果实类型并做标记.在基本保证各种果实类型都有采集的前提下，选取每个果实类型的植株20棵，采集每样株树冠外围中上部且未感病的果实30个，重复3次，装入封口袋后，做好记录和编号，带回实验室立即处理和分析.1.4 样品处理及指标测定1.4.1 炭疽病的调查每个油茶的果实类型随机选择植株20株，连续3 a(2010-2012年)在每株树冠外围中上部于东、西、南、北4个方向分别抽查果实25个，统计病果数，并计算发病率，重复3次.1.4.2 果实形态学性状的测定将每个油茶果实类型的果皮擦干净，用游标卡尺测量所有果实的横纵直径和果皮厚度，并计算果实大小[(横径+纵径)/2].记录不同果实的形状(球形、桃形和卵形)和颜色(紫红色、栗红色、纯青色、青红、青黄色和麻青色).1.4.3 果皮生理生化指标的测定将采集的油茶果实用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次，采用健康的果皮来测定生理生化指标.相对电导率采用电导仪法[8]测定；pH采用 PHS-25C 型pH测试仪测定；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)的提取与活性测定参照文献[9]的方法，用紫外可见分光光度计测定D290 nm变化0.01为1个酶活性单位；花青素含量参照文献[10-11]的方法测定，在520 nm波长处测定果皮浸提液(1.00 g果皮用刀片切成约1 mm的厚度于磨口瓶中，加入pH为3.0的25 mL盐酸甲醇，放入水浴恒温振荡器中于恒温30 ℃震荡18-24 h，以果皮圆片变白色为准)的D520 nm，然后计算其含量；单宁含量参照Terrill et al[12]的方法测定；可溶性糖含量参照蒽酮比色法[13]测定.以上每个指标均重复测定3次，结果取平均值.1.5 数据处理采用Microsoft Excel 2003、DPSV 7.05和SPSS 16.0软件进行数据处理分析和图表制作.其中，果实形状和颜色采用赋值法[14]按球形、桃形和卵形的顺序依次赋自然数1、2和3量化，紫红色、栗红色、纯青色、青红色、青黄色和麻青色赋自然数1、2、3、4、5和6量化，进行相关性及通径分析.2.1 油茶果实类型的形态学性状及其炭疽病发病率由油茶果实的主要形态学性状及其炭疽病发病率(表1)可知，果实可分为9种类型，发病率为1.2%-90.3%，麻青球发病率最高，其次为青黄卵，最低的是紫红球.果实大小和果皮厚度的变异范围分别为28.62-40.52 mm和2.76-4.83 mm.2.2 油茶果实的形态学性状与炭疽病发病率的相关性炭疽病发病率与油茶果实主要的形态学性状之间的相关分析结果(表2)表明，发病率与果实形状、颜色和果皮厚度呈正相关，相关系数分别为0.1684、0.7626和0.1511，与果实大小呈负相关(相关系数为-0.6451).其中，发病率与果实形状和果皮厚度相关性较弱，果实颜色与发病率呈显著正相关，相关系数为0.7626.说明果实颜色和大小与发病率联系较密切，紫红、栗红、纯青、青红、青黄和麻青色果实的发病率依次显著升高，果实越大，发病率有降低的趋势.2.3 油茶果实形态学性状与炭疽病发病率的通径系数从表3可以看出，油茶果实的大小、果皮厚度和形状对炭疽病发病率的直接作用呈负效应，直接通径系数分别为-0.4914、-0.1161和-0.3312，果实颜色对发病率的直接通径系数为0.5311.依据表3的直接通径系数计算决定系数(直接通径系数的平方)得出，各性状对发病率的作用效应大小为：颜色(0.2821)>大小(0.2415)>形状(0.1097)>果皮厚度(0.0135).果实颜色的决定值最大，其通过大小、形状和果皮厚度的间接通径系数分别为0.3377、-0.1033和-0.0028，说明果实颜色的直接作用也是超过其他因素的，尽管形状和果皮厚度能够降低它的直接作用，但是降低的效应小，说明果实颜色对发病率的贡献值是由直接效应提供，在研究与发病率的关系中可作为首选形态学性状.2.4 油茶果皮的生理生化指标由油茶果皮主要生理生化指标(表4)可知：青黄球果皮的pH最大,为4.84，其次为青黄卵(4.72)，紫红球最低,为4.49，变化差异不明显；紫红球和青红卵果皮的相对电导率均为26%，麻青球的相对电导率最大，超出紫红球和青红卵38.46%；果皮的花青素含量差异较大，为14.72 -21.75 mg·g-1，紫红球超出麻青球47.76%；青黄球果皮的可溶性糖含量最低，青红球最高，含量为0.73%-2.37%；单宁含量为0.31%-3.75%；栗红球果皮的PAL活性最强，为48.33 U·g-1·min-1，其次为紫红球(41.67 U·g-1·min-1)，最弱的为青黄卵(12.00 U·g-1·min-1).2.5 油茶果皮生理生化指标与炭疽病发病率的相关性相关分析结果(表5)表明：油茶炭疽病发病率与果皮相对电导率呈极显著正相关(相关系数为0.8370)，与pH呈显著正相关(相关系数为0.7065)，与花青素含量和PAL活性呈极显著负相关(相关系数分别为-0.8202和-0.8251)，与单宁含量和可溶性糖含量的相关性较弱，相关系数分别为-0.1468和-0.3223.因此，在油茶抗病选育中，可依据果皮具有较小的相对电导率和pH，较高的花青素含量和PAL活性来初步筛选抗病品系.2.6 油茶果皮生理生化指标与炭疽病发病率的通径系数为了进一步明确油茶果皮各生理生化特性对炭疽病发病率的作用大小和途径，进行生理生化指标与发病率的通径分析.结果(表6)表明：各生理生化特性以相对电导率对发病率的正效应最大(0.9864)，其次为pH，通径系数为0.6058，通过其他特性的间接通径系数均较小，说明相对电导率和pH对发病率的贡献值主要由直接效应提供；单宁含量、花青素含量和PAL 活性的直接通径系数均为负值(-0.0525、-0.0764和-0.6466)，且花青素含量通过pH、相对电导率和PAL活性的间接通径系数较大，分别达到0.4500、-0.7516和-0.5067，对发病率的贡献值主要是由间接作用提供；单宁含量通过其他特性的间接通径系数均较小，说明单宁对发病率的贡献值主要是由直接作用提供.各指标对发病率的决定系数大小为：相对电导率(0.9730)>PAL活性(0.4181)>pH(0.3670)>花青素含量(0.0584)>可溶性糖含量(0.0505)>单宁含量(0.0028).油茶经过长期的自然和人工选择形成众多不同的果实形态类型，这为优良品种选育提供了巨大的选择空间.本试验结果表明：纯青色、紫红色和栗红色果实几乎不发病，而青黄色和麻青色果实炭疽病发病率分别高达64.5%和90.3%，青红相间的发病率介于两者之间，这与段琳等[15]的研究结果(红果抗病，青果感病，杂色果介于中间)大体一致，但本试验也发现青果之间的差异也很大，如纯青果抗病性极强，青黄和麻青果极度感病；在果实形状和大小方面，球形、果大的较抗病，桃形的感病较重，这与陈守常等[16]的调查结果(球形或桃形，果小的果实类型发病率低)不完全相符.以上研究更加丰富了油茶果实形态学性状与抗病性的关系.本试验相关分析显示，油茶炭疽病发病率与果实颜色和pH呈显著正相关 (相关系数分别为0.0170和0.7065) ，与相对电导率呈极显著正相关 (相关系数为0.8370)，与花青素含量和PAL活性呈极显著负相关性(相关系数分别为-0.8202和-0.8251).通径分析表明，果实颜色、相对电导率、PAL活性、pH和花青素含量对发病率的决定系数较大，分别为0.2821、0.9730、0.4181、0.3670和0.0584.这可能是因为植物组织的相对电导率越低，细胞质电解液外渗的就越少，细胞受伤害越小，抗病性越强[17]；pH较大利于炭疽菌生长，其机理有待进一步研究；PAL是是苯丙烷类代谢途径的限速酶，是次生代谢的关键性酶，代谢过程中能生成植保素等抗病物质[5]；花青素是一种酚类化合物，当植物遭遇病菌侵入时可迅速合成和积累，有效抑制病菌侵入，保护细胞的完整性[18].植物的抗病性是植物在形态结构和生理特性等方面综合表现的结果[19]，这也决定了抗病机制的复杂性.因此，在良种选育工作上可先通过果实形态学性状进行表型筛选，再对初选材料进行生理生化指标测定，以提高油茶抗病良种的选育效率.由本试验结果可推断油茶抗病比较稳定的果实特征是：较大(果径为34.44-40.52 mm)的紫红球、栗红球和纯青球；果皮生理特性为：较小的相对电导率和pH、较强的PAL活性和较高的花青素含量等.【相关文献】[1] 靳爱仙,周国英,李河,等.油茶炭疽病的研究现状、问题与方向[J].中国森林病虫,2009,28(2):27-31.[2] CLINE S, NEELY D. 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油茶自交不亲和性的解剖特征

油茶自交不亲和性的解剖特征

第51卷第2期2015年2月林业科学SCIENTIASILVAESINICAEVol.51，No.2Feb．，2015doi :10．11707/j．1001-7488．20150208收稿日期:2014－04－21;修回日期:2014－06－10。

基金项目:国家自然科学基金项目“油茶自交败育机制研究”(31170639);湖南省研究生科研创新项目(CX2013A014);中南林业科技大学研究生科技创新基金资助项目(CX2013A01)。

*袁德义为通讯作者。

油茶自交不亲和性的解剖特征*高超袁德义杨亚王碧芳刘冬明邹锋谭晓风(中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室经济林育种与栽培国家林业局重点实验室长沙410004)摘要:【目的】比较研究油茶自交与异交授粉后花粉管在雌蕊中生长行为的差异，探明油茶自交不亲和性的类型及特征，进一步认识油茶生殖特性的同时丰富、完善其生殖生物学研究资料，为促进油茶增产提供理论依据和研究基础。

【方法】根据花粉管荧光显微观察的试验原理并有针对性地结合油茶雌蕊的特点，综合运用荧光显微镜结合经过改良的荧光压片法、荧光切片法和常规石蜡切片法观察油茶雌蕊结构特征和花粉管在雌蕊中的生长情况，运用扫描电镜重点观察油茶自交花粉管发生的不亲和反应特征，对油茶自交不亲和性进行解剖学方面的研究。

【结果】油茶为开放型花柱，两边贴合的中空花柱道是花粉管生长通道，由一层特化的内表皮细胞构成，多根花柱在基部合生进而形成子房中的空心中轴胎座。

自交与异交授粉后，花粉管在柱头、花柱中部的生长情况无明显差异。

到达花柱基部时，自交花粉管生长减缓，大部分生长停滞，只有少数能够长入子房，但最终也在子房中停滞而未能达到胚珠。

生长停滞的花粉管末端荧光异常明亮，并伴随出现膨大、分叉、卷曲、折叠、波浪状等形状，呈现出不亲和反应。

扫描电镜观察这些异常现象是由于花粉管壁局部加厚。

自交花粉管的不亲和反应伴随花柱道内表皮细胞从花柱基部到子房的逐渐紧贴而出现。

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1634)

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1634)

某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. 胆固醇是生物膜的主要成分，可调节膜的流动性，原理是胆固醇是两性分子。

（）答案：正确解析：2. NADH脱氢酶是以NAD＋为辅酶的脱氢酶的总称。

（）答案：错误解析：NADH脱氢酶是一种以FMN为辅基的黄素蛋白。

3. 柠檬酸是乙酰CoA羧化酶的激活剂，长链脂酰CoA则为其抑制剂。

（）答案：正确解析：4. 抗脂解激素有胰高血糖素、肾上腺素和甲状腺素。

（）答案：错误解析：脂肪细胞内甘油三酯脂肪酶是脂肪动员关键酶。

肾上腺素、胰高血糖素等均能促进脂肪动员，因而称脂解激素；胰岛素、前列腺素E2等可抑制脂肪动员，因而称抗脂解激素。

5. β氧化在线粒体基质进行，每4步一个循环，生成一个乙酰CoA。

（）[中山大学2018研]答案：正确解析：6. ATP在高能化合物中占有特殊的地位，起着共同中间体的作用。

（）答案：正确解析：7. ATP是果糖磷酸激酶（PFK）的别构抑制剂。

（）答案：正确解析：ATP是果糖磷酸激酶（PFK）的底物，也是别构抑制剂。

在PFK上有两个ATP结合位点：底物结合位点和调节位点。

在ATP浓度高时，ATP除了与位点1结合外，还可以与位点2结合，使酶构象发生改变，降低酶活力。

8. 遗传信息只存在于DNA分子中，一条双链DNA含有许许多多基因，他们是相互不重叠的。

（）[山东大学2016研]答案：错误解析：遗传信息主要存在于DNA分子中，还有少数病毒的遗传信息是存在于RNA分子中，而且一条双链DNA上的基因是可以重叠的，称为重叠基因。

9. 在氨基酸分解代谢中，氨基的载体是吡哆醛磷酸。

（）答案：正确解析：10. 哺乳动物体内，胞嘧啶的水解脱氨生成尿嘧啶的反应发生在核苷酸水平上。

2023年重庆市高考生物二诊试卷+答案解析(附后)

2023年重庆市高考生物二诊试卷+答案解析(附后)

2023年重庆市高考生物二诊试卷1. 《黄帝内经》是我国最早的医学典籍，书中提出“五谷为养、五畜为益、五菜为充、五果为助”的膳食搭配理论，能保证用膳者必需的热能和各种营养素的供给。

下列说法错误的是（ ）A. “五谷”是人体生命活动能源物质的主要来源B. “五畜”富含的蛋白质更有利于补充人体所需的必需氨基酸C. “五菜”中的纤维素被科学家称为人类的“第七营养素”D. “五果”富含葡萄糖、淀粉和果糖等还原糖2. 房颤（心房颤动）是临床上危害严重且最常见的心律失常疾病，最新研究表明，其致病机制是核孔复合体的运输障碍。

下列叙述错误的是（ ）A. 核质之间的物质通过自由扩散的方式进出核孔B. 房颤可能是某些RNA输出细胞核障碍所致C. 代谢越旺盛的细胞单位核膜面积的核孔数目越多D. 核孔是核质间物质交换和信息交流的通道3. 生物兴趣小组的同学进行了H2O2分解的实验，两组实验结果如图。

第2组曲线是在pH=7.0、20℃条件下，向5mL1%的H2O2溶液中加入0.5mL新鲜猪肝研磨液。

与第2组相比，第1组实验只做了一个改变。

第一组实验可能降低了（ ）A. 反应体系的pHB. H2O2的浓度C. 反应体系的温度D. 反应体系的酶量4. 某些植物有如图所示CO2浓缩机制。

在叶肉细胞中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）可将转化为有机物，该有机物经过一系列的变化，最终进入相邻的维管束鞘细胞释放CO2，提高了Rubisco（固定CO2的酶）附近的CO2浓度。

下列叙述错误的是（ ）A. 推测PEPC与无机碳的亲和力高于RubiscoB. 具有图示CO2浓缩机制的植物具有较低的CO2补偿点C. 为卡尔文循环提供能量的是腺苷三磷酸D. 具有图示CO2浓缩机制的植物抵抗干旱胁迫能力更强5. 长时间处于过度紧张焦虑状态，会导致机体出现食欲不振，消化不良等症状，引起这些症状的原因可能是（ ）A. 交感神经活动占据优势促进胃肠蠕动和消化液的分泌B. 副交感神经活动占据优势抑制胃肠蠕动和消化液的分泌C. 交感神经活动占据优势抑制胃肠蠕动和消化液的分泌D. 副交感神经活动占据优势促进胃肠蠕动和消化液的分泌6. 人体在不同生理状态下，体内的水分和血钠丢失量不同。