过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)

实验33 过氧化氢酶的活性测定目的意义过氧化氢酶（catalase ，CAT ）普遍存在于植物所有的组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系，故常加以测定。

本实验的目的在于掌握过氧化氢酶活性测定的方法、原理及操作技术。

一、高锰酸钾滴定法（一）原理过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂，因此，可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的H 2O 2溶液，经酶促反应后，用标准KMnO 4溶液（在酸性条件下）滴定多余的H 2O 2，即可求出消耗的H 2O 2的量。

5H 2O 2 + 2KMn04 + 4H 2SO 4 ──→ 502 + 2KHS04 + 8H 20 + 2MnS04（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：小麦叶片。

2. 仪器：恒温水浴、研钵、三角瓶、酸式滴定管、容量瓶等。

3. 试剂：（1）10％ H 2SO 4（2）0.2mol ·L -1 pH 7.8磷酸缓冲液（3）0.lmol ·L -1 KMnO 4标准液：称取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL ，再用0.lmol ·L -1草酸溶液标定。

（4）0.lmol ·L -1 H 2O 2：市售30％ H 2O 2大约等于17.6 mol ·L -1，取30％ H 2O 2溶液5.68mL ，稀释至1000mL ，用标准0.l mol ·L -1 KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定。

（5）0.lmol ·L -1草酸：称取优级纯H 2C 2O 4·2H 2O 12.607g ，用蒸馏水溶解后，定容至1000mL 。

（三）操作步骤1. 酶液提取：称取小麦叶片2.5g 加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容至刻度，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

ICS13.080.30B10团体标准T/NAIA XXXX—2020土壤过氧化氢酶活性的测定（高锰酸钾滴定法）2020-XX-XX发布2020-XX-XX实施宁夏化学分析测试协会发布前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》规定编写。

本标准由宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）提出。

本标准由宁夏化学分析测试协会归口。

本标准起草单位：宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）、宁夏大学、宁夏农林科学院荒漠所、银川能源学院、宁夏化学分析测试协会。

本标准主要起草人：任亚丽、白玲、张亮亮、卜姣姣、杨洁、季波、鲁静、张小飞、刘娜娜。

本标准于2020年XX月XX日首次发布。

土壤过氧化氢酶的测定（高锰酸钾滴定法）1范围本标准规定了土壤过氧化氢酶的测定方法（高锰酸钾滴定法）。

本标准适用于各类土壤过氧化氢酶的测定（高锰酸钾滴定法）。

2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T 1121.1土壤检测第一部分：土壤样品的采集、处理和贮存3原理在4℃条件下，土壤过氧化氢酶酶促分解过氧化氢，用高锰酸钾标准溶液滴定反应剩余过氧化氢，所消耗的高锰酸钾标准溶液体积数来表示过氧化氢酶的活性。

4试剂和溶液除非另有说明外，本方法均使用符合国家标准的分析纯试剂，分析用水为GB/T 6682规定的三级水。

4.1甲苯（C 7H 8）。

4.2浓硫酸（H 2SO 4）。

4.3过氧化氢（H 2O 2）。

4.4高锰酸钾（K 2MnO 4）。

4.5硫酸溶液（0.2mol/L）准确移取5.43mL 浓硫酸，缓缓注入400mL 水中，冷却后用水定容至500mL。

置于4℃冰箱贮存。

4.6高锰酸钾标准溶液c（1/5K 2MnO 4）=0.1mol/L称取3.3g（精确至0.0001g）高锰酸钾，溶于1050mL 水中，缓缓煮沸15min，冷却，于暗处放置两周，过滤。

高锰酸钾滴定法之勘阻及广创作1. 试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：①（1：100 30%的H2O2和水）②2O2+49.5ml蒸馏水）③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）4+100ml蒸馏水）2.高锰酸钾的标定：准确称取约0.2 g在110℃干燥至恒量的基准草酸钠.加入250 mL 新煮沸过的冷水、10 mL硫酸, 搅拌使之溶解.将草酸钠溶液加热到75℃~ 85℃ (即开始冒蒸气时的温度), 趁热用待标KMnO4溶液进行滴定.开始滴按时反应速度很慢, 待溶液中发生M n2+后, 反应速度加快, 但滴按时仍必需是逐滴加入, 至溶液呈粉红色, 半分钟内不褪色即为终点.注意滴定结束时的温度不应低于60℃. 2MnO4- + 5C2O42- + 16H+ 75~ 85℃ Mn 2+ +10CO2 + 8H2O.参考：《高锰酸钾标准溶液标定方法的改进及注意事项》王继莲3. 测定：准确称取2 g风干土置100 mL锥形瓶→加入40 mL蒸馏水和5 mL0.3%过氧化氢（现配）, 另设对比 (40 mL蒸馏水和 5 mL0.3%过氧化氢)→在往复式振荡机上振荡20 min→加入 5 mL3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤, →4．结果计算土壤的过氧化氢酶活性, 以单元土重的0.1N KMnO4毫升数(对比与试验测定的差) 暗示.备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活.此法根据H2O2与土壤相互作用时, 未分解的H2O2的数量用容量法（经常使用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2 KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的迫害作用.。

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积.H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。

过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。

因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。

本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性.一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定.在一定范围内,其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系.【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

【试剂】100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30％分析纯H2O257μl,溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5％（W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水.【方法】1。

制作标准曲线：取10ml离心管7支,顺序编号，并按表40—1加入试剂.待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色.2.样品提取和测定：（1）称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。

(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35—1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。

沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。

(3）向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。

3.结果计算:植物组织中H2O2含量（μmol/g Fw）=式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）;V t—样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积（ml）；FW-植物组织鲜重(g）。