酶工程-06琼脂糖凝胶电泳

2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插 入适当的梳子，在室温下冷却凝固。
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII

琼脂糖凝胶电泳技术[目的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。

在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。

琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。

(2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。

DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。

(3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。

但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。

(5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。

(6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。

在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝 胶电泳分离DNA
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
限制性内切酶切割出目的DNA
了解琼脂糖凝胶电泳的原理
掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方 法
实验原理
利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位 点，定点切割环状质粒DNA。
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝 铂纸包装保存。 4. 10×DN切体系
调制酶切体系如下: (共 20μL)
无菌水 6μL，
质粒
10 μL
Buffer K 2μL,
EcoR I 1μL,
BamH I 1 μL
37℃酶切1.5小时。
琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电 泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓 度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查 有无气泡。
纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分 （DDT，BSA）等。
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。
10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。

琼脂糖凝胶电泳！相关知识原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。