杏仁核电点燃大鼠认知功能及海马α7型神经烟碱胆碱能受体的表达

ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＡＴＯＭＹＶｏｌ－３５Ｎｏ．３２０１２解剖学杂志２０１２年第３５卷第３期杏仁核电点燃大鼠认知功能及海马ａ７型神经烟碱胆碱能受体的表达＋苗珍花１王峰２（宁夏医科大学，１人体解剖学与组织学胚胎学系；刘庆祝２孙涛２△

２宁夏颅脑重点实验室研究中心，银川７５００１４）

摘要目的：本研究旨在探讨杏仁核电点燃大鼠恐惧状况、学习记忆能力及海马区ａ７型神经烟碱胆碱能受体（ａ７ｎＡＣｈＲ）

表达变化。方法：随机将雄性ＳＤ大鼠分为手术对照１周组、２周组及电点燃１周组、２周组。实验结束后，用旷场实验检测大鼠的活动水平、探索能力及恐惧状况；Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力；免疫组织化学和免疫印迹检测大鼠海马区ａ７ｎＡＣｈＲ表达变化。结果：电点燃组大鼠点燃成功率为９１．７％。旷场实验检测结果显示，与手术对照组比较，点燃１周组和２周组大鼠活动的格子数（Ｆｌ。一２４．７７，Ｐｌ。一０．００；Ｆｚ。＝４２．８６，Ｐ２。一Ｏ．００）、站立次数（Ｆｌ。一５６．１８，Ｐｌ。一Ｏ．００；Ｆｚ。＝４２．２５，Ｐ２。一ｏ．ｏｏ）及排出粪便的颗粒数（Ｆ１。一１０．０８，Ｐ－。一０．０１，Ｆ２。一３１．２２；Ｐ２。一０．ｏｏ）有差异，具有统计学意义；Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫检测结果显示，与手术对照组比较，点燃１周和２周组大鼠搜寻平台的潜伏期（Ｆ。。一３。１３９，Ｐ１。一Ｏ．０９５；Ｆ２。一ｏ．８８４，Ｐ２。一ｏ．３６１）及在平台所在象限的搜寻时问百分比（Ｆ１。一１．９０７，Ｐ１。一０．１８５；Ｆ‰一ｏ．４４６，Ｐ：。一０．５１３），差异均无统计学意义；免疫组织化学及免疫印迹结果显示，与手术对照组比较，点燃１周组和２周组大鼠脑海马区ａ７ｎＡＣｈＲ表达均增高（Ｆ－。一１５．７０，Ｐ，。一ｏ．０２，Ｆ２。一２４．６１，Ｐｚ。＝０．０１）。结论：大鼠杏仁核电点燃１周和２周后，导致了其情感行为异常，增加了脑海马区ａ７ｎＡＣｈＲ的表达，但对其学习和记忆能力的影响不明显，可能与点燃部位、发作频率、发作强度及发作的持续时间有关。关键词杏仁核；电点燃；认知障碍；ａ７型神经烟碱胆碱能受体；大鼠

Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａ７ｎＡＣｈＲｉｎｔｈｅａｍｙｇｄａｌａｋｉｎｄｌｉｎｇｍｏｄｅｌｏｆｅｐｉｌｅｐｓｙ＋ＭｉａｏＺｈｅｎｈｕａｌ，Ｗａｎｇ

Ｆｅｎ９２，ＬｉｕＱｉｎｇｚｈｕ２，ＳｕｎＴａｏｚ△

（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎａｔｏｍｙａｎｄＨｉｓｔｏｌｏｇｙ；２．ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＮｉｎｇｘｉａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５００１４，Ｃｈｉｎａ）

ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｃｏｇｎｉｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｅｍｏｔｉｏｎａｌｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｔｈｅａｍｙｇｄａｌａｋｉｎｄｌｉｎｇｍｏｄｅｌｏｆｅｐｉｌｅｐｓｙａｎｄ

ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａ７ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ａ７ｎＡＣｈＲ）ｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ４０ｍａｌｅＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ１－ａｎｄ２－ｗｅｅｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ（Ｃ１ａｎｄＣ２ｇｒｏｕｐｓ，ｎ＝８）ａｎｄ１一ａｎｄ２－ｗｅｅｋｋｉｎｄｌｉｎｇｇｒｏｕｐｓ（Ｋ１ａｎｄＫ２ｇｒｏｕｐｓ，咒一１２）．Ｔｈｅｋｉｎｄｌｉｎｇｇｒｏｕｐｔｈａｔｈａｄｂｅｅｎｅｖｏｋｅｄｆｏｒ５ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｓｔａｇｅＶｓｅｉｚｕｒｅｓｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｔｈｅｅｌｅｃｔｒｉ—ｃａｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｆｕｌｌｙ－ｋｉｎｄｌｅｄａｍｙｇｄａｌａｓｅｉｚｕｒｅｓ．Ｔｈｅｎｅｍｏｔｉｏｎａｌｄｅｆｉｃｉｔｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔ，ｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙ

ａｂｉｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙＭｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆａ７ｎＡＣｈＲｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕ—

ｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｎｔｈｅｏｐｅｎ－ｆｉｅｌｄｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙｍａｚｅ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ

ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆ

ｇｒｉｄｓ（Ｆ１。一２４．７７，Ｐｌ。一０．００，Ｆ２。一４２．８６，Ｐ胁一０．ｏｏ）ａｎｄｓｔａｎｄｉｎｇｔｉｍｅ（Ｆｌ。一５６．１８，Ｐｌ。一

Ｏ．ＯＯ，Ｆ２。一４２．２５，Ｐ２。一Ｏ．００）ｏｆＫｌａｎｄＫ２ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅａ１１ｏｂｖｉｏｕｓｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｆｅｃｅｓ（Ｆｌ。一１０．０８，Ｐ１。一Ｏ．０１，Ｆｚ。一３１．２２，Ｐ２。一Ｏ．００）ｏｆＫ１ａｎｄＫ２ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｌａｎｄＣ２ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒ—

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ｒａｎｔ（Ｆ１。一１．９０７，Ｐ１。一０．１８５，Ｆａ。一０．４４６，Ｐ２。一Ｏ．５１３）ｏｆＫｌａｎｄＫ２ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃ【７ｎＡＣｈＲｏｆＫ１ａｎｄＫ２ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅａ１１ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｆ１。一１５．７０，Ｐ１。一０．０２，Ｆ２。一２４．６１，Ｐ细一０．０１）．Ｃｏｎｌｕｓｉｏｎ：Ｋｉｎ—

ｄｌｉｎｇｍｉｇｈｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｒｅｓｕｌｔｉｎｅｍｏｔｉｏｎａｌｄｅｆｉｃｉｔｓ，ａｎｄａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆａ７ｎＡＣｈＲｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ

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＋国家自然科学基金（８１０６００３４）；２０１１年９７３计划前期研究专项（２０１１ＣＢｌｌｌ５００）第１作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｉａｏｚｈｅｎｈｕａ２００３＠１６３．ｃｏｒｎ

△通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｔａｏ＠ｎｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ收稿日期：２０１１—０８—３０；修回日期：２０１２—０２—２２

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认知功能是指人们处理信息并作出适当反应和行为的能力，它涉及到解决问题、交流、记忆信息和集中注意力等方面。大量研究证实３０％～４０％癫痫患者存在不同程度的认知障碍。癫痫患者认知功能损害主要表现为对一般知识的注意力下降、对事物的感知能力、

万方数据抽象概括能力、计划判断能力，阅读、学习和词汇表达能力的减退。有３大因素，即癫痫本身、治疗因素和社会心理因素影响癫痫患者的认知功能。颞叶癫痫是临床上最常见的难治性癫痫，可影响患者认知功能，但发生机制尚不清楚。如何控制癫痫发作，并改善患者认知情况，是目前癫痫研究的一个热点。ａ７型神经烟碱胆碱能受体（ａ７ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａ７ｎＡＣｈＲ）是一种与认知和记忆密切相关的蛋白，在海马及部分皮质大量分布［１１，但目前尚不明确其与颞叶癫痫认知障碍之间的关系。本实验选择杏仁核电刺激点燃癫痫动物模型，观察ａ７ｎＡＣｈＲ在海马中的表达变化，探讨颞叶癫痫认知功能障碍可能的发病机制，并为认知功能研究提供新的线索及思路。ｌ材料和方法１．１实验动物及分组健康成年雄性ＳＤ大鼠４５只，体质量２８０ｇ±２０ｇ，由宁夏医科大学实验动物中心提供，自由饮食，室温２２℃～２５℃，每日光照１２ｈ。实验开始前，将每只大鼠放＾Ｍｏｒｉｓｓ水迷宫中自由游泳２ｍｉｎ，筛选出４０只游泳姿势和游泳速度合格大鼠，随机分为手术对照１周、２周组，每组８只和杏仁核电点燃ｌ周组和２周组，每组１２只。１．２实验仪器Ａｌｐｈａ—Ｌａｂ多通道生理记录仪（ＡＬ－ＡＢｏ００１５３，Ｉｓ—ｒａｅｌ）；脑立体定位仪（ＳＲ－５Ｒ，Ｊａｐａｎ）；生物电子刺激器（ＡＭ２１００，ＵＳＡ）；羊抗兔ａ７多克隆抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司），Ｓ－Ｐ试剂盒（福州迈新生物工程有限公司）；Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅ，ＭＷＭ）和微机生物机能系统（成都泰盟科技有限公司）。１．３模型的建立各组实验大鼠水合氯醛（４００ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射）麻醉，固定大鼠头部于脑立体定向仪，消毒并于正中切口约１ｃｍ处，剪除部分皮肤、皮下组织和骨膜，暴露颅骨及前后囟，创面止血。将双极电极安放于杏仁核，作为刺激电极，由３孔接插件引出，用牙科水泥将接插件固定在颅骨表面，并在枕顶骨区、额骨区安放４～５个加固螺钉。杏仁核电极靶点坐标：前囟后２．８ｍｍ，旁开４．８ｍｍ，硬膜下８．０ｍｍ。术后观察大鼠呼吸、心率、体温、血压和肤色，各项指标正常后，将鼠单笼饲养，并连续３ｄ每天腹腔注射青霉素钠５万Ｕ。术后恢复１周，电点燃组大鼠进行点燃，先测１周组和２周组大鼠杏仁核的后放电阈值，用Ａ－ＭＳＹＳ—ＴＥＭＳ２１００刺激器给大鼠持续电流刺激，脉冲为双向方波，波宽１．０ｍｓ，频率６０Ｈｚ，持续１Ｓ。杏仁核刺激强度开始为４０弘Ａ，以后每隔９０Ｓ增加１０弘Ａ，直到脑电图（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ，ＥＥＧ）记录到≥３Ｓ后发放电，为该大鼠的后放阈（ａｆｔｅｒｄｉｓｃｈａｒｇｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，ＡＤＴ）。从测定ＡＤＴ的第１天起，每天按ＡＤＴ１．５倍强度刺激１次，直至出现５次Ｖ级发作，视为点燃成功，对照１周和２周组每天不通电刺激２Ｓ。发作强度按Ｒａｃｉｎｅ分级评分，工级：不动、闭眼，面肌轻微痉挛；Ⅱ级：点头；Ⅲ级：单侧前肢阵挛；１Ｖ级：双前肢阵挛；Ｖ级：全身阵挛发作。点燃成功后，对照１周组和电点燃１周组正常喂养１周、对照２周组和电点燃２周组正常喂养２周后进行行为学检测。１．４旷场活动实验（ｏｐｅｎ