2016级细胞模型实验报告

广西医科大学

实 验 报 告

科目： 细胞模型实验

年级： 研究生院2016级

组别： A组

学号： *************

姓名： ********

实验二 MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用

实验原理：?

ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。?

实验步骤：

1：贴壁细胞消化和吹打?：加1ml0.5%胰蛋白酶并轻摇使其遍布所有细胞表面至镜下观察发现胞质回缩、间隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培养液,反复吹打至瓶壁上无贴壁细胞为止。

2：计数与分板?：取20ul细胞悬液于计数板计数,用1640培养液调整使其细胞数约为5×104个/ml,在96孔培养板中加入细胞悬液每孔100ul,共18个,培养箱孵育12h。

3：加药与孵育于培养板中分别加入浓度为0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml环磷酰胺注射液各100ul,每组重复3孔,设空白对照组3孔各100ul,孵育24小时。

4：MTT显色每孔加MTT20ul，3小时候弃上清，每孔加DMSO100ul。

5：酶标仪测定：490nm处测其吸光度?

实验结果及讨论:?

1.不同浓度药物的生长抑制率如下?

浓度（ug/ml） 平均吸光度（x±s） 抑制率（%） 存活率（%）

1600 -0.15367 -18.98% 118.98%

800 -0.01133 -1.40% 101.40%

400 0.254333 31.42% 68.58%

200 0.075667 9.35% 90.65%

100 0.121667 15.03% 84.97%

0 0.32 39.53%

60.47%

2.浓度与抑制率关系图

注：横坐标为浓度对数值、纵坐标为抑制率

3.?讨论：?

1.?本次实验出现错误较多，OD值出现负值和其中还有400ug/ml组加悬液过量，致使数据有所偏离。?

2.?加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔间颜色较均匀，随浓度梯度变化相对明显，能够体现出抑制作用。?????

3.实验数据过少不能够完全判定药物的抑制作用，另因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。 实验三?HE染色法观察药物作用细胞后的形态学变化?

实验原理：?

HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰显示出细胞图像,染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。?

实验步骤：?

1. 样品制备:胰酶消化贴壁生长细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次。

2.?样品固定:?95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。?

3.?染细胞核:?苏木精染色5-10min后自来水水洗。?

4.?染细胞质:?伊红染色1-2min后自来水水洗。?

5.?脱水、透明:?70%，95%，100%乙醇逐级脱水,二甲苯透明,吹干。?

6.?封片:在载玻片上滴加甘油，将有细胞的一片的盖玻片向下封固于载玻片上。

?实验结果及分析:

染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。如图所示染色的结果随药物浓度变化而变化，药物对细胞的抑制作用较为明显，并且体现出浓度趋势，整体的染色效果尚可。

实验四?吖啶橙荧光染色法观察细胞形态学的变化?

实验原理：?

吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝色光或紫外光的激发下，DNA和RNA都会激发出荧光，活细胞经过固定，染色后细胞DNA成亮绿色，核仁和散布在细胞质中的RNA成橘红色，胞质的其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因为物质就够发生变化，其细胞核成暗绿色，细胞质也是成暗绿色。?

实验步骤：?

1. 胰酶消化贴壁细胞,调整细胞浓度为1×105?/ml,?每孔2ml加于6孔板,?加盖玻片,加入药物培养相应时间,?取出盖玻片,用PBS洗涤3次,除去血清

2. 95%乙醇固定15~30min

3. 1%醋酸作用30s，1×10-4AO染色30s~60s，0.1M?CaCl2处理30s~2min

4. PBS漂洗3次

5. 甘油封片?

实验结果及分析：

对照组 IC50组

正常细胞染色后发出绿色荧光，密度不均匀呈结构样特征，而凋亡小体边缘清晰，呈染色增强，荧光亢进且密度均一，实验组与对照组实验结果对照明显，可见细胞数量在加药组减少。有细胞正在进行分化，还有分化刚刚结束有细胞正在进行分化，还有分化刚刚结束。

实验五?TRIzol试剂快速分离细胞和组织中的RNA、ＤＮＡ、蛋白质?

实验原理：?

TRIzol试剂是目前最常用的细胞和组织中分离ＲＮＡ的试剂，其主要成

分是苯酚，苯酚的作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白和核酸物质释放，由于ＲＮＡ极易被ＲＮａｓｅ分解，所以TRIzol中常加入８－羟基喹啉，异硫氰酸胍等来抑制内源性和外源性ＲＮａｓｅ活性，以保证ＲＮＡ完整。TRIzol试剂还利用RNA、ＤＮＡ、蛋白质在不同溶液中的溶解性质,加入氯仿离心后,溶液分为水相、中间层和有机相,取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中间层可回收DNA,用异丙醇沉淀可回收蛋白质,从而实现三者快速分离。?

实验步骤：?

样品处理:?TRIzol处理后的样品在室温放置5min,每使用1ml?TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s,室温放置3min,离心15min.样品分三层:底层为红色有机相,上?层为无色水相和一个中间层.RNA主要在水相,中间层和有机层用于分离DNA和蛋白质。

RNA?:

放置干燥RNA沉淀，用无Rnase水在55-60度下溶解ＲＮＡ?

取２ｕｌ样品用核算微量检测仪测量ＲＮＡ浓度

另取２ｕｌ在琼脂糖凝胶中跑电泳?????????????????

DNA：

75%乙醇洗DNA沉淀后再离心

试问晾干后NaOH溶解，再用TE，HEPES调节PH??

取2ul在核算微量检测仪上测量ＤＮＡ浓度

蛋白质?：

室温晾干后１％ＳＤＳ溶解蛋白质

双缩脲试剂检验??

实验结果及分析：?

1、RNA电泳图如下：可以看到28， 18s，5s三条条带?

2.?

OD（260nm）/OD（280nm） 浓度 RNA 1.79 1192.1 ng/ml

DNA 1.00 174.9

ng/ml

3．蛋白质与双缩脲试剂的反应出现阳性结果，但是不是很明显。?

4.?本实验得到的结果虽然都出现阳性结果，但是导致得到的物质的收率不是很高有以下几个原因:?

a)?RNA的得率：样品匀浆时实际量太少，只是样品裂解不够彻底，RNA沉淀没有完全溶解，还有一些污染等原因导致RNA降解。?

b)?DNA?蛋白质得率：样品的匀浆和裂解的不彻底，得到的沉淀没有很好溶解,再就是得到的组织没有马上处理导致样品的降解。?

?我们只有严格的按照试验的流程操作，从操作步骤，样品和仪器的准备，以及注意一些操作环境的维护的事项，这样才能够得到欲想要的大分子，进而进行后续的实验.

实验五??流式细胞仪凋亡分析ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７-ＡＤＤ双染色法

实验原理：?

在凋亡的早期阶段，细胞内的钙离子快速持续上升，使谷氨酰胺转移酶被

激活，造成胞质磷脂不对称丧失，导致膜内侧磷脂酰丝氨酸从细胞内层暴漏与外层，Ａｎｎｅｘｉｎ-Ｖ为３５－３６ＫＤ的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，并可被ＦＩＴＣ荧光物指标记，故ＡｎｎｅｘｉｎＶ被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标记之一，７－ＡＤＤ是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期和坏死的细胞，因为细胞膜受到破坏，而使细胞核染色。? 实验步骤：?

1.样品处理：2ml(浓度为1×106?/ml)细胞接种于6孔板/培养皿,培养24h后,加入合适凋亡诱导剂,设置空白对照1孔,加入同浓度药物各3孔(实验组)

2.进行细胞干预刺激24h,收集并用PBS洗涤,计数,离心

3.制备单细胞悬液,将细胞悬重于200ul的1×binding?buffer中,每个样本浓度约为1×106?/ml

4.100ul制备好细胞悬液加入到12mm×75mm试管

5.加入5ulＡｎｎｅｘｉｎ-Ｖ与７－ＡＤＤ于制备好细胞悬液中,混匀,室温孵育5min,加入400ul稀释后的binding?buffer,?1h内进行流式细胞仪检测

6.测定要做3管对照

1单纯细胞样本

2细胞样本只加入5ulＡｎｎｅｘｉｎ-Ｖ

3细胞样本只加入1ul７－ＡＤＤ

7.细胞仪测定:525nm测ＦＩＴＣ,675nm测７－ＡＤＤ,分析凋亡细胞、活细胞和坏死细胞百分率。?

实验结果及分析

1.这是没有做过药物处理的细胞，所以细胞落在左下象限，还有部分落在右上象限的是死细胞。

?2. 这是经过药物处理的细胞，可以看到在右下象限出现荧光标记，说明细胞处于凋亡早期。

3.在左上象限出现标记，说明药物处理的细胞处于凋亡中、晚期或是坏死细胞。

4. 这个图片比较全面，各个时期的细胞特征都能够体现出来 。