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ChIP Protocol(用于细胞)

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ChIP实验步骤总结
1.细胞交联将细胞从孵箱取出，置于常温。

加入甲醛溶液（SIGMA），至终
浓度为1%。

（以10cm皿为例，内含10ml培养液时，加入280ul甲醛溶液）。

轻轻混匀，RT，静置10min。

2.终止交联加入2.5M甘氨酸（SIGMA），至其终浓度为0.125M（以10cm皿
为例，内含10ml培养液时，加入550ul 2.5M甘氨酸）。

轻轻混匀，RT，静置5min。

3.洗涤吸去培养基，用PBS清洗三次。

每次加入5ml PBS,轻摇混匀，吸去液
体。

4.细胞收集加入PBS,将细胞收集到15ml离心管内。

水平转子离心，
RT,2000rpm,8min，弃去上清。

于液氮中速冻后放于-80℃冻存，或进行下步实验。

5.细胞膜的破碎⑴加入1ml ChIP Hypotonic buffer ,20ul Protease Inhibitor
Cocktail，10ul 100mM PMSF,将细胞转移到1.5ml EP管中，4℃，旋转10-15min.
⑵用杜恩斯组织匀浆器匀浆，选用紧锤（即Pestle B）,匀浆20-30次至推
拉无阻力。

⑶离心。

4℃,3000rpm,5min，弃去上清。

6.细胞核的破碎加入300ul Nuclear Lysis Buffer，6ul Protease Inhibitor Cocktail，
3ul 100mM PMSF，将沉淀吹散后，4℃旋转15-30min.
7.超声加入1.2ml ChIP Dilution Buffer , 24ul Protease Inhibitor Cocktail，12ul
100mM PMSF，混匀后分成三份(每份约500ul)到1.5mlEP管中。

Diagenode* Bioruptor™ 300 细胞超声破碎仪
（以293T细胞为例）设置程序：1 CYCLE=15’ON 20’OFF TOTAL 32 CYCLE 8.离心，4℃,13000rpm,20min。

转移上清到新的EP管中，-80℃冻存，或进行
下步实验。

9.抗体孵育细胞：抗体参考孵育比例：2×106 :2-3ul抗体
⑴用ChIP Dilution Buffer 将孵育体积补齐到 1.2ml,加入20ul Protease
Inhibitor Cocktail，10ul 100mM PMSF。

⑵预清除：取ProteinG磁珠(Thermo Fisher Dynabeads® Protein G 货号10004D)
20ul，用200ul 1%BSA/PBS洗三次后，加入⑴样本，4℃旋转1h.此步能去除样本中与ProteinG 磁珠非特异性结合的背景。

(磁珠配套磁力架或磁铁使用)
⑶预清除后，将样品转移至一新1.5mlEP管中。

留取50ul样本作为input，加入150ul ChIP Elution Buffer ，55℃水浴，解交联过夜。

⑷向样品管中加入抗体，4℃旋转过夜或12h。

9．磁珠封闭取ProteinG 磁珠30-50ul（磁珠用量取决于抗体的量，抗体量在1-5ul 内用30 ul磁珠即可），加入1ml 1%BSA/PBS,4℃旋转封闭过夜或12h。

10.免疫复合物的沉淀封闭过夜的磁珠，用30ul 1%BSA/PBS悬起加入到步骤8中孵育抗体的EP管中。

4℃旋转2-4h。

11. 免疫复合物的清洗
a. 1ml low salt buffer 1次，4℃旋转10min
b. 1ml high salt buffer 1次，4℃旋转10min
c. 1ml Licl wash buffer 1次，4℃旋转10min
d. 1ml TE buffer 1次，4℃旋转5min
e. 1ml TE buffer 转移到另一新1.5mlEP管中。

12.解交联加入110ul ChIP Elution Buffer ，悬起磁珠，55℃水浴，解交联过夜。

13.将解交联的溶液转移到另一新EP管中a。

再加入100ul TE Buffer ，vortex10s，清洗磁珠b。

将b与a合并。

14.（input样品、CHIP样品）加入2ul RNAase A(10mg/ml), 55℃烘箱处理1h.
15. （input样品、CHIP样品）加入4ulproteinase k (10mg/ml), 55℃烘箱消化2 h.
16 .Qiagen PCR 产物纯化试剂盒提取DNA。

用50ul dd H2O溶。

17.q-PCR 验证相关基因的表达。

CHIP LOW SALT （WASH）BUFFER
母液50mL用量500mL用量终浓度10%脱氧胆酸钠(filtered) 0.5mL 5mL 0.1% 10%TritonX-100(filtered) 5mL 50mL 1% 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered) 0.2mL 2mL 2mM 1M HEPES(PH7.5) (filtered) 2.5mL 25mL 50mM 5M Nacl(filtered) 1.5mL 15mL 150mM ddH2O(filtered) 定容至50mL 定容至500mL
4℃保存
CHIP HIGH SALT BUFFER
母液50mL用量500mL用量终浓度10%脱氧胆酸钠(filtered) 0.5mL 5mL 0.1% 10%TritonX-100(filtered) 5mL 50mL 1% 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered) 0.2mL 2mL 2mM 1M HEPES(PH7.5)(filtered) 2.5mL 25mL 50mM 5M Nacl(filtered) 5mL 50mL 500mM ddH2O(filtered) 定容至50mL 定容至500mL
4℃保存
TE BUFFER
母液50mL用量500mL用量终浓度1M Tris-HCL(PH7.5) (filtered) 0.5mL 5mL 10mM 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered)0.1mL 1mL 1mM ddH2O(filtered) 定容至50mL 定容至500mL
4℃保存
CHIP NUCLEAR LYSIS BUFFER
母液50mL用量200mL用量终浓度20%SDS(filtered) 2.5mL 10mL 1%SDS 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered) 1mL 4mL 10mM 1M Tris-HCL(PH8.0) (filtered) 2.5mL 10mL 50mM RT保存
PBS/1%BSA(filtered) 50mL
BSA filtered1xPBS定容至
0.5g 50mL
4℃保存
CHIP ELUTION BUFFER
母液50mL用量200mL用量终浓度20%SDS(filtered) 2.5mL 10mL 1%SDS 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered) 1mL 4mL 10mM 1M Tris-HCL(PH8.0) (filtered) 2.5mL 10mL 50mM RT保存
CHIP HYPOTONIC BUFFER
母液50mL用量500mL用量终浓度1M HEPES(PH7.5) (filtered)1mL 10mL 20mM 1M KCL(filtered) 0.5mL 5mL 10mM 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered)0.1mL 1mL 1mM 10%NP-40(filtered) 1mL 10mL 0.2% 50%Glycerol(filtered) 10mL 100mL 10% ddH2O(filtered) 定容至50mL 定容至500mL
4℃保存
CHIP DILUTION BUFFER
母液50mL用量500mL用量终浓度1M Tris-HCL(PH8.0) (filtered)1mL 10mL 20mM 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered) 0.2mL 2mL 2mM 5M Nacl(filtered) 1.5mL 15mL 150mM 20%SDS(filtered) 0.025mL(25ul) 0. 25mL(250ul) 0.01%SDS 10%TritonX-100(filtered) 5mL 50mL 1% ddH2O(filtered) 定容至50mL 定容至500mL
4℃保存
LICL WASH BUFFER
母液50mL用量500mL用量终浓度1M Tris-Hcl PH8.0(filtered)0.5mL 5mL 10mM 1M Licl (filtered) 12.5mL 125mL 250mM 0.5M EDTA(PH8.0) (filtered)0.1mL 1mL 1mM 10%NP-40(filtered) 2.5mL 25mL 0.5% 10%脱氧胆酸钠(filtered) 2.5mL 25mL 0.5% ddH2O(filtered) 定容至50mL 定容至500mL
RT保存。

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CHIP-Seq protocal

CHIP-Seq protocal

• 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体 做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为 0.2 M），65℃处理4 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的 效果。 • 4. 在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP Dilution Buffer【0.01%SDS，1.1%TritionX-100,1.2mM EDTA， 16.7mM Tris，pH8.1。167mM NaCl，】和20 ul的蛋白酶 抑制剂PMSF。
CHIP-Seq
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种 用于研究蛋白质与DNA 的体内相互作用 的经典实验技术。采用特异性抗体将目 的蛋白进行免疫沉淀，由此可以把目的 蛋白所结合的基因组DNA 片段也富集下 来。通过与高通量测序技术的结合，对 ChIP 后的DNA 产物进行测序分析，从 全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA 结 合位点，以高效率的测序手段得到高通 量的数据结果。
实验步骤
一、细胞的甲醛交联与超声破碎 • 1. 取出1平皿已转染细胞（10 cm平皿），加入270 ul 37%甲醛，甲醛的终浓度为1%（培养基共有10 ml），使 DNA和与之相互作用的蛋白交联。 • 2. 37℃孵育10 min。 • 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为125m M。加入1.5ml 1M甘氨酸于平皿（10ml培养基）中。混匀后，在室温下 放置5 min即可。 • 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞3次。
• 二、检验超声破碎的效果 • 1. 取300 ul超声破碎后产物，加入12ul 5M NaCl，65℃ 处理4 h解交联。 • 2. 在样品中加入5μl 0.5M EDTA，10μl 1M Tris-HCl pH6.5，和5μl 的10mg/ml蛋白酶K(P.K)，在45℃消化蛋白 1h。 • 3.先用酚/氯仿（v/v=1:1）对样品1:1抽提，再用氯仿1；1 抽提。加入1/10体积的3M NaAc，pH5.2，和2.5-3倍体积 的乙醇，﹣20℃放置1h以上，12000rpm，10min，4℃离 心，吸去上清，加500μl的70%乙醇，12000rpm，10min， 4℃离心，洁净台上干燥，加入30-50μlddH2O溶解。
chip seq原理

chip seq原理

ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的技术。

它结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和高通量测序技术。

ChIP-seq的基本原理如下：
1. 交联：首先，细胞或组织中的染色质与蛋白质相互作用需要被交联，通常使用甲醛进行交联。

2. 染色质免疫沉淀（ChIP）：交联后的细胞或组织被裂解，染色质与特定的抗体结合，形成染色质-抗体复合物。

这些复合物可以通过抗体的亲和力选择性地富集。

3. DNA解交联：染色质-抗体复合物被洗脱，并通过加热或酶解去除交联。

4. DNA测序：富集的DNA被提取，并通过高通量测序技术进行测序。

这可以产生大量的短序列片段。

5. 数据分析：测序数据经过质量控制和预处理后，可以通过比对到参考基因组上，确定染色质-抗体复合物结合的位置。

通过统计分析，可以确定特定蛋白质与DNA相互作用的区域。

ChIP-seq技术的优势在于可以高分辨率地确定特定蛋白质与DNA相互作用的位置，从而帮助研究人员理解基因调控、表观遗传学和疾病发生机制等方面的问题。

Co-IP protocol

Co-IP protocol

1.转染48h的细胞换无FBS的培养基（add 0.1%BSA）饥饿细胞12h过夜后第一天PBS（含钙、镁离子）4ml (Hepes 10~20mM pH 7.4)饥饿细胞2h；【配DSP（cross-linker）：10mgProteochem加5mlDMSO，再缓慢加入5ml（PBS+10mMHEPES （已配好））。

放在振荡器上边(drop wise, 缓慢摇晃逐滴滴加)加边振荡。

】2.用终浓度为10uM（0.0010563g→500ul DMSO取4ul）的Iso（分子量：211.26）37℃刺激5min（细胞房完成）3.缓慢摇晃逐滴滴加lml DSP（手动旋转，边加边转），加完后室温下摇床（最慢转速）上摇30min。

（两种蛋白粘合）4.每盘166ul 1M Tris（PH7.5）（加法同上）终止DSP，再摇15min。

5.冷PBS（+10mM HEPES）（Hepes分子量：238.30）洗两遍细胞。

6.加入冷裂解液NP40 300ul。

冰上裂解30min。

7.刮细胞到EF管，4℃翻转裂解(2~4)h，4℃12000离心30min后取上清【裂解细胞同时用PBS洗beads。

（每盘25ul beads。

目的：去除保存beads的乙醇）】8.取适量总上清（每盘60ul加等量loading buffer煮100℃5min）Western blot分析，剩余裂解液加入到flag-beads中，4°C缓慢摇晃孵育过夜（6~12hours）第二天9.过夜后，1000r离心5min，去上清。

10.加PBS-Hepes（每盘200ul）4℃翻滚5min。

再1000r离心5min ，去上清11.加PBS-Hepes（每盘200ul）4℃翻滚5min。

再1000r离心5min ，去上清。

12.加入适量裂解液至50ul，加等量50ul loading buffer。

离心。

13.煮100℃5min即可上样run westerns.【两个一组转染，一个对照，一个给刺激。

chip原理

chip原理

ChIP实验原理及步骤∙一．ChIP的概念真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。

因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitation assay, ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。

它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。

其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。

∙二．ChIP技术的原理ChIP的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA 复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段。

染色质免疫共沉淀是理解染色体的一种革命性工具，使研究者了解染色质及其相结合的调控因子之间的时空动态相互作用。

ChIP原理图∙三．ChIP具体实验步骤细胞固定—染色质断裂—染色质免疫沉淀—交联反应的逆转和DNA的纯化—DNA的鉴定.1.细胞的甲醛固定.交联所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。

交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP 结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。

交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。

甲醛的交联反应可被甘氨酸终止。

通常的交联条件为室温10 min。

.2.染色质断裂.通常采用超声波断裂染色质。

超声波使用机械力把染色质断裂成200-1000bp左右的片段，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP 的效率。

所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。