Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)

转染protocol
注意：整个过程要防止293T细胞漂，所以动作一定要轻缓，不要急。

一、细胞准备
转染前12-18小时，铺细胞。

293T 细胞，介于1:2~~1:3传。

二、转染前换液
吸去细胞上层培养基，轻轻地加入PBS（14.5cm皿需要至少5ml培养基），缓慢地晃动培养皿，然后吸去PBS。

轻轻地加入10ml Opti-MEM。

然后放回细胞培养箱。

三、PEI稀释，DNA与PEI混匀
抗体重链与轻链质粒比例按照1：2.5混匀；质粒与PEI按照1：1混匀。

（质量比，PEI 为1ug/ul）；每14.5cm皿可以转染40ug质粒。

每皿我们需要1-2mlPEI&DNA混合液（Opti-MEM稀释）。

首先计算好抗体重链、轻链所需质粒，PEI需要量以及二者混合后最终体积。

然后，取一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入PEI，Vortex，净置5分钟。

取另一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入DNA，Vortex。

将PEI稀释液逐滴加入DNA稀释液中，混匀。

静置20分钟。

（尽量避光）
四、轻轻地将PEI&DNA混合液加入细胞培养皿中（1-2ml/皿）。

缓慢晃动培养皿，混匀。

然后放回细胞培养箱。

五、一小时后，吸去Opti-MEM，每皿加入20ml 293freestyle培养基。

（动作轻缓）
六、4天后，收上清。

慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。

2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。

3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。

4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。

5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。

6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。

7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。

8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。

本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。

原汁原味的慢病毒转染与感染protocol Lentivirustransfection and infectionsPackaging cell line:293FTGrowth medium:DMEM containing 10% HI FBS, 1%P/S, 0.5mg/ml G418,4 mM L-Glutamine,0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids,1 mM MEM sodium pyruvateLentiviral medium:DMEM containing 10% HI FBS, without antibiotics,4 mML-Glutamine, 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids,1 mM MEM sodium pyruvateTargetcell medium:DMEM or other medium containing 10% HIFBS, without antibiotics.ProtocolCulturing 293FT cellsQuickly thaw the frozen 293FT cells, and immediately after thawing, transfer the cells to a 15 ml tube containing 10 ml PBS,and then pellet the cells. Resuspend the cells in growth medium, and incubat e cells at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator.Transfection and infections1. On Day 1, prepare DNA-Lipofectamine? 2000 complexes foreach sample.a.In a sterile 5 ml tube, dilute 3 μg pLP1, 3 μg pLP2, 3 μg pLP/VSVG, and 3 μg of pLenti expression plasmid DNA (12μg total) in 1.5 ml of DMEM (noserum, no P/S). Mix gently.b.In a separate sterile 5 ml tube, dilute 36 μl Lipofectamine? 2000 (mix gently before use) in 1.5 ml of DMEM (no serum, no P/S). Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature.c.After incubation, combine the diluted DNA (Step a) with the diluted Lipofectamine? 2000 (Step b). Mix gently.d.Incubate for 20 minutes at room temperature to allow the DNA Lipofectamine ? 2000 complexes to form. The solution may appear cloudy, but this will not impact the transfection.e.While DNA-lipid complexes are forming, trypsinize and count the 293FT cells.Resuspend the cells at a density of 1.2x 106 cells/ml in lentiviral medium.f.Add the DNA-Lipofectamine? 2000 complexes (Step 1d) to a 10 cm tissue cultureplate containing 5 ml of lentiviral medium.g. Add 5 ml of the 293FT cell suspension from Step 2 (6 x 106 totalcells) to the plate containing media and DNA-Lipofectamine? 2000 complexes (Step 3).Mix gently by rocking the plate back and forth. Incubate cells overnight at 37°Cin a humidified 5% CO2 incubator.2.The next day (Day 2),remove and discard the medium containing the DNA Lipofectamine ? 2000 complexes and replace with 10 ml lentiviral medium.Incubate cells for 48 hours at 37°C in a humi dified 5% CO2 incubator.Note:Expression of the VSV G glyco protein causes293FT cells to fuse, resulting in the appearance of large, multinucleated cells known as syncytia. This morphological changeis normal and does not affect production of the lentivirus.3. Day 3, set up the targetcell line in target cell medium to 60mm plate so that they will be 30% confluent on the next day.4. Posttransfection (Day 4),a. harvestvirus-containing supernatants. Use a 10 ml syringe to remove the medium from the 293FT cell lines, and filter the viral supernatants through a 0.45 μm filter in 15 ml sterile tube. Replace the medium removed from the packaging cells with 10 ml lentiviral medium.b. infect target cells: 1 volume of lentiviral medium (2ml) and1 volume offiltered virus-containing supernatants(2ml), with polybrene 4 μg/ml.c.Pipet the retaining viral supernatants into 1.5 ml sterile tube in 1 ml aliquots. Store viral stocks at -80°C. When stored properly, viral stocks ofan appropriate titer should be suitable for use for up to one year. When using the frozen viral stocks, thaw frozen stocksat room temperature, rather than at 37°C, since lentivirus is temperature-sensitive.5. Day 5 or 6, second round of infection: repeat the infection as described on day 4. And throw the 293FT cells.6.Day 6 or 7, split target cells to 100 mm plate with fresh target growth medium.7. On the Day 7or 8, select cells using drug.。

慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。

对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。

2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。

4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。

次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。

（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。

根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。

慢病毒转染实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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1. 病毒液与靶细胞准备。

将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。

慢病毒感染目的细胞实验步骤1. 感染预实验以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。

工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。

实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。

（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）Day1：准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种5×104个细胞，添加细胞培养液至500µL。

通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。

（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）Day2：（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；C. 混匀后，细胞培养板置于37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。

Day3：更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。

（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。

）Day4：继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。

Day5：观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。

（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。

慢病毒感染细胞具体方法及详细步骤
材料和试剂
1. 6 cm细胞培养皿(Fiosher).
2. 人类或小鼠细胞系，细胞试验所需要的生长培养基。

3. 凝聚胺(海美溴铵; Sigma H 9268)
4. 合适的选择性抗生素。

仪器
1. 细胞培养箱
步骤
慢病毒感染方法应该根据不同的细胞系和以细胞为基础的试验来进行优化。

例如，下列的参数应该在大规模的感染之前进行优化，以确定一个实验的最适条件：
1) 细胞种植密度
2) 慢病毒的数量
3) 嘌呤霉素的浓度
4) 感染时间
2. 在6cm培养皿中种植适当密度的细胞，每孔体积6ml。

1) 贴壁细胞：转染前1天种植细胞
2) 悬浮细胞：转染当天种植细胞，培养基中需要含有凝聚胺。

3. 细胞中加入病毒:
1) (贴壁细胞):弃掉培养基，加入新鲜的含有凝聚胺的培养基。

或者，弃掉部分培养基并且补充含有凝聚胺的培养基。

调整体积和凝聚胺的浓度，使得凝聚胺的终浓度为8ug/ml。

4. 病毒感染:
1) 孵育细胞过夜。

2) 感染后24h更换培养基。

弃掉培养基，换入6ml新鲜的培养基。

如果需要抗生素选择，则使用含有抗生素的新鲜培养基。

注意：嘌呤霉素的浓度应该根据每种细胞系来进行优化；常用的浓度范围为：2-5 μg/mL.
5. 孵育细胞，根据需要每隔几天更换培养基(如果需要，则要含有抗生素) 。

孵育时间的长短主要依赖于感染后的试验。

慢病毒转染PROTOCOL第一天病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。

加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。

在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。

注意：也可用其它型号培养板转导。

这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。

第二天准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。

移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。

注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。

Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。

过长时间暴露于Polybrene （> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。

在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。

培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。

轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。

病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。

注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。

反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。

注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。

此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。

注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。

第三天移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。

孵育细胞过夜。

第四天欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。

第五－六天及以后用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。

Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。

Generation o f L entivirusReagents•293T: ATCC•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001•FBS: Invitrogen cat# 16000-044•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058293T/fibroblast media (500 mls):DMEM (450 ml)10% FBS (50 ml)Pen/strep (5ml)L-glutamine (5ml)NEAA (5 ml)Reagent setupLentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectorsA. Production of Virus1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cellsreach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorftube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.Second generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMD2.G 5 ugpsPAX2 5 ugThird generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMDL g/pRRE 5 ugpRSV-Rev 2.5 ugpMD2.G 2.5 ug3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) andreplace with fresh medium.4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with freshmedium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4Cuntil all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C orconcentrated.Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw analiquot on ice before use; do not refreeze.Concentration by ultracentrifugation:1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip withappropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min toovernight at 4C for the pellet to completely dissolve.3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do notrefreeze.。

病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

病毒转染包括以下步骤：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。

以慢病毒为例。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成,即包装成分和载体成分。

包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因.将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。

下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。

2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。

3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。

4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。

5.限制性内切酶：用于DNA切割。

6.DNA连接酶：用于DNA连接。

7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。

8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

9.细胞培养基：用于细胞培养。

10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。

11.抗生素：用于防止细胞污染。

12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。

二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。

2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。

3.水浴锅：用于保温反应液。

4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。

5.细胞培养箱：用于细胞培养。

6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。

7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。

8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。

三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。

2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。

3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。

6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。

细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。

下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。

常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。

病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。

非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。

通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。

二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。

o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。

o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。

o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。

o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。

2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。

o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。

o移液器及枪头：用于精确加样。

o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。

o无菌水：用于稀释和配制溶液。

三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。

2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。

3.水浴锅：用于加热溶液。

4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。

5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。

6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。

7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。

四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。

2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。

磷酸钙转染法制备慢病毒的protocolProduction of lentivirus by Calcium phosphate in 293T cellsThis protocol was adapted for 10 cm dish.Day 1: HEK293T platingPlate 2.5~3×106cells/10 cm dish in DMEM+10%FBS(+1% L- Glutamine)Day 2: TransfectionThere will be around 70% confluence.Two hours before transfection, replace the medium with 10 ml fresh medium preheated at 37℃. For each 10 cm dish, prepare the following transfection mix:10.0 ug GFP(or other plasmd of interest)10.5 ug pLP110.5 ug pLP29.0 ug pVSVG.Then add in this order:293.3 ul of TE buffer (0.1×, pH 8.8)155.6 ul d.d.water50.2 ul CaCl2(2.5M)Briefly mix, then add 500 ul 2×HBS, dropwise under agitation by vortexing at least 1~2min.Wait at least 5min(no more than 30min) at RT.Add dropwise 1ml/10cm dish of the precipitate, and mix gently by rotating the plate.Day 3: Observe the cells and change the mediaObserve the cells. They should be reaching confluency. If a visible marker (such as GFP) is present in the lentivector plasmid, transfection efficiency may be assessed visually. Ideally, transfection efficiency should be >90%.Remove medium around14~16h post-transfection and put ≈ 8ml/dish of fresh pre-heated medium.Day 4: Collect first harvest of supernatantCollect and pool supernatant (8 ml/dish) from dishes at 48 h post-transfection and store at -80℃. Add 8ml of fresh DMEM +10% FBS +1% L-Glutamine to each dish. Incubate dishes at 5% CO2, 37 °C overnight.Day 5: Collect second harvest of supernatantCollect supernatant from dishes (8ml/dish) at 72 h post- transfection. Pool supernatant from first and second harvests. Centrifuge at 3000 × g for 15 minutes at 4℃to remove cells and cell debris.。

慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。

本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。

一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。

慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。

这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。

二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。

2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。

三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。

2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。

3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。

4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。

5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。

6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。

四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。

2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。

3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。

4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。

5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。

6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。

如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。

实验室用慢病毒包装与感染细胞实验方案1.实验材料：细胞株：293细胞质粒：pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro（简称CDHv）pMDL-gag/pol RRE（简称RRE）pVSV-G（简称VSVG）pRSV-Rev（简称REV）转染试剂：聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI），贮存液浓度为1mg/ml。

Sigma公司产品，Cat No. 408727-100ML感染增强剂：polybrene(hexadimethrine bromide)，中文名称为：凝聚胺或海地美溴铵其它：一次性注射器、0.45um针头滤器等2. 实验程序：1. 首先将目的基因克隆至CDHv的多克隆位点区获得CDHv-Gene，而后制备包括CDHv、RRE、VSVG和REV在内的5种质粒；2. 培养293细胞至其生长情况良好，接种至10cm细胞培养皿中，细胞数目以12hr后或第二天转染时细胞覆盖率为70-80%为佳；3. 转染293细胞：分别在两个洁净的1.5ml离心管加入500ul无血清MEM（或DMEM、PBS、saline），其中一只管中混合包装病毒用四种质粒（CDHv或CDHv-Gene、RRE、VSVG和REV），各质粒用量依次比例为4ug:4ug:3ug:2ug(或为4ug:4.2ug:3.2ug:2.1ug)，轻轻吹打3-5次混匀；另一只管中加入PEI溶液，用量（ul数）与质粒量（ug数）大致保持1:1的关系，即第一只管中加入13ugDNA，此管中即加入13ul 浓度为1mg/ml 的PEI溶液，同样轻轻吹打混匀后，将第一管中的质粒溶液加入至第二管中的PEI溶液中，室温放置孵育15分钟后，直接加入铺有293细胞的培养皿中（此处293细胞转染前可不换液），轻轻晃动培养皿混匀后继续常规培养；4.（可选）大约8hr后，更换新鲜的完全培养基（温育为佳），继续常规培养；5. 培养48-72hr后，培养基变黄，部分293细胞浮起，收集上清至离心管中离心数分钟（目的是除去可能掺杂的293细胞，不至于下一步过滤时阻塞针头滤器），利用一次性注射器和洁净的0.45um针头滤器过滤上清至洁净的离心管中，此上清可直接冻存于-80℃备用，直接感染细胞最佳；6. 感染目的细胞：可直接将过滤后的病毒上清直接加入弃去原有培养基的铺有目的细胞的培养皿中（此时的目的细胞也应生长状态良好，覆盖率不宜过高，个人认为50-60%为宜，过高可能会因为细胞过度生长营养不足且感染效率低，或过低会形成大量病毒攻击少数细胞，两者都可能会引起大量细胞死亡），12hr 后丢弃病毒，更换新鲜培养基。

包病毒***保护自己：保护黏膜：戴眼镜口罩手套。

（使用后的枪头以及各种与病毒接触过的废物泡一次84再仍，1片500ml,要提前泡）1种板子：细胞长到70-90%时，可进行计数。

然后种板子（每孔40-50%，一般下午种）2转染：2.1第二天上午进行转染：转染前2h换无血清培养基/换部分无血清培养基（4ml无血清1ml有血清培养基）。

2.2Lipo3000：I 分别用lipo3000和p3000加无血清培养基，II 病毒包装质粒装入离心管，将目的质粒加入离心管（有几个目的质粒准备几个离心管），混匀，静置5min后于I中液体混匀，静置15-20min。

III 加入孔中，摇匀。

（提质粒的倒数第二步，在超净台内静置5min晾干酒精，加入灭菌水后再离心。

提前高压一瓶水，分装与离心管中，用之前加热至70℃）2.36-8h/10-12h换液/加有血清培养基。

3收病毒：3.1转染后48±2h后收病毒（吸取上清，4°保存），加培养基。

3.272h后再次收病毒（这会一般细胞都长满了，从培养箱拿到细胞台要平稳，不然很容易飘起来，飘起来了就取上清后离心，再取上清）。

3.3两次的加到一起，使用滤膜过滤至无菌管（如果前一步细胞飘起来了就先离心后取上清，过滤，5ml/更小的注射器，45微米的滤膜）。

3.4分装后-80保存。

4转病毒：4.1T25（40-50%细胞），剩/吸完加1ml培养基，加2-3ml病毒（病毒与按比例polybrene混匀）。

4.212-16h后换液，48h后加入1微克/毫升的嘌呤霉素进行筛选，一般筛选2-3d即可（可传代后继续筛选，保证稳转），筛选时最好设置对照（对未转病毒的目的细胞进行嘌呤霉素筛选）。

PS：Lipo和PEI在293T细胞中效果一致。

PEI便宜。

6孔板：目的质粒加包装质粒3微克/孔lipo3000：3-5微升/孔。

提质粒后，换手套再进细胞房，酒精擦枪头及吸附柱等可能有大肠杆菌附着的物品。

慢病毒转染实验流程英文回答：Lentiviral Transduction Protocol.Materials:Lentiviral vector.Target cells.Transfection reagent (e.g., Polybrene)。

Culture medium.Selection reagent (optional)。

Procedure:1. Prepare virus and target cells:Thaw the lentiviral vector and aliquot it into appropriate volumes for your experiment.Count and prepare the target cells at a suitable density for transduction.2. Add the transfection reagent:Add the transfection reagent (e.g., Polybrene) to the virus-containing solution according to the manufacturer's instructions. Incubate for the recommended time.3. Incubate virus with cells:Add the virus solution to the target cells and incubate for 24-72 hours. The optimal incubation time may vary depending on the target cell type and lentiviral vector used.4. Remove virus and select for transduced cells:Remove the virus-containing medium and wash the cells with fresh culture medium.If desired, select for transduced cells using an appropriate selection reagent (e.g., antibiotic resistance marker or fluorescent protein).5. Culture and analyze transduced cells:Culture the transduced cells in the appropriate medium and conditions.Analyze the cells for transduction efficiency and transgene expression using methods such as flow cytometry, microscopy, or Western blotting.Additional Notes:Optimization of the transduction protocol may be necessary for different target cell types and lentiviral vectors.Safety precautions should be taken when handling lentiviral vectors, as they contain potentially infectious material.The use of a spin infection protocol can enhance transduction efficiency.Transduction can be scaled up or down as needed by adjusting the volumes used.中文回答：慢病毒转染实验流程。