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OverExpress C43(DE3)化学表达感受态细胞使用说明

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OverExpress C43(DE3)化学表达感受态细胞OverExpress C43(DE3) Chemically Competent CellOVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞基因型：F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞说明：OverExpress C43(DE3)、OverExpress C41(DE3)两个菌株均起源于BL21(DE3)，其优点是可以高效表达毒性蛋白或疏水性蛋白。

OverExpress C41(DE3)跟BL21(DE3)的区别在于其基因组含有至少一个未知突变，这个未知突变使其获得了高效表达毒性蛋白(1-5)的能力，此突变位点参与大肠杆菌表达毒性蛋白时的细胞死亡途径；OverExpress C43(DE3)来源于OverExpress C41(DE3)，是通过筛选OverExpress C41(DE3)对另一个不同毒性蛋白的抗性菌株获得。

OverExpress C43(DE3)菌株具有比OverExpress C41(DE3)更强的表达毒性蛋白和疏水性蛋白的能力，所以说OverExpress C43(DE3) 菌株与BL21(DE3)相比拥有至少两个未知突变，正是这两个未知突变使其获得了更广泛的表达毒性蛋白或疏水性蛋白的能力。

此菌株含有DE3区，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

OverExpress C43(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达5×108 cfu/μg DNA。

OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞操作方法：1. OverExpress C43(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm 复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB mediumcontaining the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubesand place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-induced control samples.6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptable).IPTGPrepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) bydissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞注意事项：1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化. OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞保存条件：-80℃华越洋OVEREXPRESS C43(DE3)感受态细胞相关：Rosetta-gami B(DE3)pLacI感受态细胞DMT感受态细胞Rosetta-gami 2(DE3)pLacI感受态细胞TKB1感受态细胞Rosetta-gami感受态细胞Origami感受态细胞Rosetta感受态细胞HMS174, HMS174(DE3), HMS174(DE3)pLysS Rosetta-gami 2(DE3)pLysS感受态细胞平板涂布专用玻璃珠Stbl3超级感受态细胞Stbl3感受态细胞RosettaBlue感受态细胞NMY51酵母感受态细胞RosettaBlue(DE3)感受态细胞TG1感受态细胞，TG1感受态细胞TOP10F′超级感受态细胞EHA105感受态细胞RosettaBlue(DE3)pLysS感受态细胞Stbl2感受态细胞RosettaBlue(DE3)pLacI感受态细胞DH10B感受态细胞Tuner(DE3)pLacI感受态细胞T1感受态细胞Rosetta2(DE3)感受态细胞M15感受态细胞Rosetta2(DE3)pLacI感受态细胞HB101感受态细胞Tuner(DE3)pLysS感受态细胞JM109感受态细胞Rosetta(DE3)感受态细胞Y1HGold酵母感受态细胞Rosetta(DE3)pLySs感受态细胞Rosseta(DE3)感受态细胞Rosetta(DE3)pLacI感受态细胞AH109酵母感受态细胞Rosetta 2感受态细胞TB1感受态细胞，TB1Rosetta 2(DE3)pLySs感受态细胞EGY48酵母菌感受态细胞Origami B感受态细胞XL1-Blue感受态细胞Origami 2(DE3)pLysS感受态细胞DH10Bac感受态细胞Tuner(DE3)感受态细胞BJ5183感受态细胞，BJ5183 Origami 2(DE3)pLacI感受态细胞DB3.1感受态细胞Tuner感受态细胞JM110感受态细胞OmniMAX2-T1感受态细胞GV3101感受态细胞NovaF-感受态细胞SURE感受态细胞，SURE感受态细胞NovaBlue感受态细胞BL21(DE3)感受态细胞XL1-Blue化学感受态细胞stbl3感受态细胞，stbl3感受态细胞DH5α超级感受态细胞BL21 Star(DE3)感受态细胞DH5α- T1感受态细胞BL21 Star(DE3)pLySs感受态细胞BLR(DE3)感受态细胞AD494(DE3)感受态细胞BLR(DE3)pLysS感受态细胞KM71H,KM71H酵母感受态细胞BLR(DE3)pLysS感受态细胞EHA101,EHA101农杆菌感受态细胞BL21-SI感受态细胞ER2566感受态细胞BL21-Gold(DE3)感受态细胞Tuner(DE3)，Tuner(DE3)感受态细胞BL21-AI感受态细胞TOP10F` 感受态细胞BL21(DE3)pLacI感受态细胞EHA101农杆菌感受态细胞BL21 trxB(DE3)感受态细胞TG1感受态细胞BL21 trxB(DE3)pLysS感受态细胞XL10-Gold 感受态细胞Mach1-T1 Phage Resistant 感受态细胞农杆菌感受态细胞DH10bac(BmNPV) 感受态细胞Stable感受态细胞BJ5183-AD-1感受态细胞F-DH5α感受态细胞F-TOP10感受态细胞stable电击感受态细胞DH10B电击感受态细胞EPI400电击感受态细胞TG1电击感受态细胞BL21(DE3)pLysS感受态细胞CodonPlus感受态细胞BL21感受态细胞GV3101电击感受态细胞EHA105电击感受态细胞AGL1电击感受态细胞LBA4404电击感受态细胞C41(DE3), C41(DE3)PlysS感受态细胞C43, C43(DE3)感受态细胞OrigamiB,OrigamiB(DE3),OrigamiB(DE3)pLysS,OrigamiB(DE3)pLacIDH10bac (BmNPV)克隆感受态细胞。

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EPI400电击感受态细胞使用手册

EPI400电击感受态细胞使用手册

EPI400电击感受态细胞EPI400 Electroporation Competent CellEPI400电击感受态细胞基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG trfA tonA pcnB4 dhfrEPI400电击感受态细胞说明：EPI400电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。

该菌株来源于EC100菌株，将EC100核基因中控制质粒拷贝数的pcnB基因删除后引入一个诱导启动子驱动的pcnB基因，即是EPI400菌株。

EPI400菌株可以降低质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定DNA 或毒性基因的克隆，在加入诱导剂CopyCutter Induction Solution后又可以提高质粒产量到正常状态。

[mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI400菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。

recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。

lacZΔM15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，tonA赋予其抗噬菌体T1和T5的能力，rpsL赋予其链霉素抗性。

EPI400电击感受态细胞适用于不稳定DNA 或毒性基因的克隆，经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>1010 cfu/μg DNA。

EPI400电击感受态细胞操作方法：1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的EPI400电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

唯地生物感受态

唯地生物感受态

唯地生物感受态
1、产品说明
NovaBlue(DE3)来源于K12菌株，是转化效率的原核表达菌株，
可同时用于普通质粒的构建和蛋白的原核表达。

NovaBlue(DE3)菌株
染色体DNA中整合了λ噬菌体DE3区，使得NovaBlue(DE3)菌株可同时表达T7RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，广泛用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

NovaBlue(DE3)菌株具有四环素抗性，endA1和recA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取；lacZΔM15的存在使NovaBlue(DE3)可用于蓝、白斑筛选。

唯地生物生产的NovaBlue(DE3)感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达109cfu/μgDNA。

2、操作方法
1、NovaBlue(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5
分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨EP
管底混匀，冰中静置25分钟。

2、42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3、向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4、5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上（若质粒浓度较高，也
可稀释后涂板，务必保证能在平板上挑到单克隆菌落）。

5、将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

感受态细胞的制备和重组质粒的转化

感受态细胞的制备和重组质粒的转化

感受态细胞的制备和重组质粒的转化1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA 的细胞称为转化子。

在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。

质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。

转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。

细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。

有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。

用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。

对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。

这种转化方法称为“化学法”。

目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。

电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。

微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。

【试剂与器材】〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

感受态细胞的制备和转化

感受态细胞的制备和转化


一 实验原理



感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理 状态。 一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后， 有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后， 就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的 细菌培养时机是很重要的。 本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编 码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因 此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体 菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳 糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的 进行更为经济。

二 实验试剂

菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal （λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）]。 质粒pGEX-6p。

三 操作步骤
1大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养 液中，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左 右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至 40ml灭菌离心管中，在4℃，4000rpm离心10分钟， 弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶 液中，冰浴15分钟，然后在4℃4000rpm离心10分钟。 弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1M CaCl2 溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。
二 实验试剂


LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g， 溶于950ml双蒸水中， 用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭 菌。需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌 素。