高效液相色谱法在手性药物拆分中的应用

高效液相色谱法在手性药物拆分中的应用

摘要：外消旋化合物的手性分离是获得单一对映体的方法之一。随着人们对纯光学药物的需求日益增加，各种手性分离技术得以快速发展。近几十年来，在这些手性分离技术中，高效液相色谱法 ( HPLC ) 被公认为是一种强大、快速、高效的分离技术，它已成功应用于对映体药物的分离分析和制备中。HPLC用于对手性药物分离的研究已取得很大进展，并且研发了大量可应用于手性小分子和聚合物分离的手性固定相，大大提高HPLC的手性识别能力。本文以HPLC的手性药物分离为焦点，介绍了近几年高效液相色谱法手性固定相的新发展和应用。

关键词：高效液相色谱法 手性药物 手性拆分

- 1 - Application of High Performance Liquid Chromatography

in Chiral Separation of Pharmaceuticals

Abstract：Resolution of racemic compounds is one of the potential ways of obtaining

both enantiomers. The increasing demand for enantiopure drugs has led to the

development of a variety of stereoselective separation technologies. Among several

resolution techniques in the past few decades, high performance liquid

chromatography ( HPLC ) is well recognized as a powerful, fast and efficient

technique, which has been successfully employed for analysis and preparation of

enantiomers of drugs. Enantioseparation by HPLC has significantly advanced, and a

large number of chiral stationary phases ( CSPs ) for HPLC have been developed

using both chiral small molecules and polymers with chiral recognition abilities. This

review focuses on various HPLC methods for chiral separation of pharmaceuticals,

many new developments and applications are introduced in chiral stationary phase of

HPLC in recent years.

Keywords：HPLC; Chiral drug; Chiral separation;

- 2 - 引 言

手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体，是目前药物研究领域的热点之一。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别。而手性在自然界中是普遍存在的，并且人体本身就是一个手性环境，比如蛋白质、多糖、核酸和酶等大都是手性的。绝大多数的药物由手性分子构成。虽然它们的理化性质相似，但在生物体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。由于酶、受体、载体等分子都是具有手性特征的物质,手性药物的不同对映体在生物体内的吸收、转运、分布、代谢、排泄等存在显著的差异，甚至能够产生意想不到的毒性作用[1, 2]。因此，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害。比如，(S) -构型多巴为治疗帕金森综合症的首选药物，而(R) -构型能造成粒状白细胞减少症，使用极度危险；著名的“反应停事件”，R-反应停具有镇静作用，而S-反应停则对胎儿有致畸作用。

手性制药是医药行业的前沿领域，2001年诺贝尔化学奖就授予分子手性催化的主要贡献者。不同手性药物在体内发挥的作应不同，一种可能是高效低度的，而另一种可能有毒害作用。手性制药就是利用化合物的这种原理，开发出药效高、副作用小、药物的专一性高的药物。据调查，1985 - 2004年上市的550个新化学合成药物中，有313个药物具有手性中心，其中以单一异构体上市的手性药物为167个，手性药物数量呈逐年上升趋势；2005年世界药物的销售总额为6020亿美元，而手性药物的销售总额为2250亿美元，占全球制药市场销售总额的37 %，2010年可望超过5000亿美元[3, 4]。

一般情况下获得手性化合物有以下几种方法：天然物的提取、生物合成、外消旋体拆分、不对称合成等方法[5]。外消旋体拆分主要有：经典结晶法拆分、动态动力学拆分、色谱法拆分、膜拆分法、萃取拆分法等技术[6, 7]。本文重点介绍色谱法中HPLC在手性药物拆分中的应用。

1 高效液相色谱法简介

高效液相色谱法( High Performance Liquid Chromatography , HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”等。HPLC是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分

- 3 - 被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱仪可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分

高效液相色谱的发展始于20世纪60年代中后期。60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划、蛋白质组学用HPLC做预分离等。现在该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。

高效液相色谱法有如下特点：(1)

高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。(2)

高效：分离效能高，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。(3)

高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。(4)

应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。(5) 分析速度快、载液流速快：通常分析一个样品在15 - 30分钟。此外，高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

2 高效液相色谱的手性拆分方法

高效液相色谱技术在手性药物拆分中应用最广泛的方法之一，在手性药物质量控制、立体选择性的药理学和毒理学研究等方面起着极其重要的作用。HPLC对药物对映体的分离方法主要分间接法和直接法。

2.1 间接拆分法

间接法又称衍生化法，是手性化合物对映体在分离之前把手性药物对映体混合物在预处理液中进行柱前衍生化，形成一对非对映异构体，溶质分子与固定相和流动相之间作用力不同，发生差速迁移，对映体分子实现分离。常用的手性衍

- 4 - 生化试剂主要有：酰化试剂、胺类试剂、氯甲酸酯类和邻苯二醛等。

如Bhushan R等[8]合成琥珀- (S) -萘普生酯，并用它做衍生化试剂处理DL -青霉胺对映体，采用反相高效液相色谱法进行分离，分离效果很好。Peccinini RG等[9]使用C18柱，(-) -氯甲酸薄荷酯作为衍生试剂处理血浆和尿液中的卡维地洛，用氯仿提取，用荧光检测器检测，对映体分离较好。该方法可应用于对映选择性的药代动力学研究。Bhushan R等[10]考察了二氯- S -三嗪和一氯- S -三嗪作为氨基酸的衍生化试剂，产生的对非对映体用反相C18柱分离，流动相为乙腈和三氟乙酸水溶液的混合物，实验结果说明，这两种试剂可以安全地用于氨基酸的手性分析药物分离。手性试剂衍生化法多用非手性柱即可分离，但是需要较高纯度的衍生试剂，衍生化反应要严格控制，对不同的药物要寻找相应的衍生化试剂，且操作比较麻烦，只可在小范围内应用。在HPLC中，直接法应用较多，手性添加剂和手性固定相种类多样。

2.2 直接法

2.2.1 手性流动相添加剂法

手性流动相添加剂法是在流动相中加入手性添加剂，然后利用非手性固定相进行拆分。常用的手性流动相添加剂有：手性离子对、CD、冠醚、手性金属配合物、动态手性固定相等。最常用的添加剂为环糊精。如郭娜等[11]采用 C18固定相，以羟丙基- β -环糊精为手性流动相添加剂，建立了奥昔布宁对映体的高效液相色谱拆分方法。该法拆分奥昔布宁对映体，方法简单，灵敏度高，分离度好。刘学斌等[12]建立拆分新药尤利沙星对映异构体的 HPLC手性流动相添加剂法。本文利用尤利沙星对映体与手性添加剂L -异亮氨酸和 Cu2+ 间形成三元非对映体配位化合物，在较短时间内能达到理想的分离效果。

2.2.2 手性固定相法

目前认为手性固定相法是非常简单而有效的方法，应用也最为广泛，可分离的手性药物多。手性固定相法是将手性试剂化学键合到固定相上制成手性柱，外消旋体中的一个手性物质与手性固定相发生作用，生成不稳定的短暂复合物，而两者在固定相中的保留时间不同，从而达到分离的目的。CSP法发展异常迅速，手性固定相的种类大致有以下几类：手性聚合物类、刷型手性固定相、蛋白质类、大环抗生素类、分子印迹聚合物、冠醚类、多糖类和环糊精类等[13]。本文对几