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HPV16和11型L1基因双价重组质粒的构建

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常渗透压而死亡。

肽抗生素作用的靶点是整个细菌胞膜,作用范围大,其次,肽抗生素是通过形成离子通道杀灭细菌的,细胞膜仅仅是肽抗生素架设离子通道的“地基”,细菌不可能在短期内将整个细胞膜突变成其它结构,细菌难以产生抗药性。

综述举例介绍了多种肽抗生素的抗菌活性(有效抗菌浓度、抗菌谱);抗肿瘤活性及其抗瘤机制;增强传统抗生素活性的功能;促进创伤修复的活性;结合内毒素,抑制炎症的发生;与肝素结合,抑制血管增生等活性。

在肽抗生素应用开发现状中,本文跟踪了世界上主要从事肽抗生素研究并有产品进入临床实验的七个国际制药大公司(IntraBiotics公司,Mi2 crologix Biotech Inc公司,Helix BioMedix,Inc公司,Taipan Inc公司,XOMA公司,Magainin Phar2 maceuticals公司以及Merck公司),目前正在研制的几十个肽抗生素的进展状况。

最后展望了目前肽抗生素研究所面临的困境与前景。

・简　报・
HPV16和11型L1基因双价重组质粒的构建
庄　敏,谷鸿喜,魏兰兰,肖　鹏,孔卫兰
(哈尔滨医科大学微生物学教研室,黑龙江哈尔滨　150086)　中图分类号　R373 文献标识码　A 文章编号　1005-7021(2003)02-0060-01
目的　人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种性传播疾病的病原体,由于HPV目前在体外无法进行大量有效地繁殖,所以国内外专家都将重点放在基因工程疫苗的研制上。

而HPV各型别之间不具有明显的交叉性,为防止各型别混合感染,联合不同型别的多价基因工程疫苗的研制势在必行。

HPV基因组晚期基因L1主要编码主要衣壳蛋白L1,可以自我组装成病毒样颗粒(virus2 like particles,VL P),并可刺激机体产生中和抗体,对病毒的攻击起到保护作用。

本研究构建HPV16211L1双价真核表达质粒,为制备一种同时可以预防宫颈癌和尖锐湿疣的基因工程疫苗奠定基础。

实验材料　(1)pSP73:大肠杆菌克隆质粒。

(2) pBluescript:大肠杆菌克隆质粒。

(3)pfast2Bac2Dual:杆状病毒转移质粒,含有Ppolh强启动子和p10弱启动子。

(4)pCR2.12HPV16L1重组质粒(谷鸿喜教授提供)。

(5)宿主菌DH5α。

(6)限制性内切酶Xho I,K pnI,SalI,XbaI (Promega)。

(7)T4DNA连接酶(invitrogen)。

实验方法　(1)黑龙江省地区尖锐湿疣组织中感染的HPV11型L1基因的克隆:采用PCR方法扩增3例人类尖锐湿疣组织中L1基因片段,PCR引物两端加入Xho I 和K pnI酶切位点,酶切后克隆至pSP73载体,得到pSP732HPV11L1质粒,并对其进行全序列分析。

(2) HPV16L1的亚克隆:采用PCR方法扩增pCR2.12HPV16L1质粒的L1片段,PCR引物两端加入SalI和XbaI酶切位点,酶切后克隆至载体pBluescript质粒,经蓝白筛选,挑取白色阳性菌落进行鉴定和测序,得到pBluescript2HPV16 L1质粒。

(3)构建HPV16型和11型结构基因L1双价真核表达质粒:①选用SalI和XbaI酶切已构建的pBlue2 script2HPV16L1
质粒,将切下的16L1插入杆状病毒转移
质粒pfast2Bac2Dual的Ppolh强启动子之下,酶切鉴定;②
用Xho I和K pnI酶切已构建的pSP732HPV11L1质粒,得
到的11L1片段插入到杆状病毒转移质粒pfast2Bac2Dual
的p10弱启动子之下,酶切鉴定。

实验结果　(1)获得3个黑龙江省地区尖锐湿疣组织
中感染的HPV11L1分离株,得到3个克隆质粒pSP732
HPV11L1,大小为4.0kb左右。

酶切鉴定,结果与预计
相符。

经过测序发现有两处核苷酸序列与原始序列不同,
分别是第258位的碱基为T,而原始序列为C;第837位
的碱基为T,而原始序列为C。

这两处并没有影响所编码
的氨基酸,均为无意突变。

(2)获得pBluescript2HPV16L1
亚克隆质粒,大小为4.5kb左右,经测序后比较与pCR2.
12HPV16L1的序列相符,并经酶切鉴定,结果与预计相
符。

(3)获得pfast2Bac2Dual2HPV16L12HPV11L1双价真
核表达质粒,大小为8.2kb左右。

两次分别用酶切鉴定,
均与预计相符。

为进一步转染昆虫细胞做好了必要的准
备,为制备基因工程双价疫苗奠定基础。

06 微　生　物　学　杂　志 23卷。

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两大方法帮你搞定质粒构建

两大方法帮你搞定质粒构建

两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。

原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。

下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。

壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。

1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。

其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

[可选酶切体系]VECTOR 3 ugCutSmart Buffer 5 ul限制性内切酶 1 1 ul限制性内切酶 2 1 ul酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。

每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。

酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端（2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段[可选 PCR 扩增体系]ddH2O：14ul10xTaq buffer：2ul10um DNTP：1ul10um primer F：0.5ul10um primer R：0.5ul模板 DNA：1ulTaq 酶：1ul[可选 PCR 扩增条件](1)95℃：5min(2) 35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根据引物TM值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。

pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达

pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达

pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达左泽华;李辉;伍欣星【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2003(018)004【摘要】应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达.酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达.由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对HPV16E7分子生物学特性、致瘤机理及APC提呈等的研究.为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础.【总页数】4页(P344-347)【作者】左泽华;李辉;伍欣星【作者单位】武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071;武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071;武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 赵亮;姚丽娟;孔建新;濮跃晨;孙安源;罗以勤;张林杰2.人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 刘丽;欧阳应斌;黄培堂;刘及3.组织蛋白酶B过表达质粒和特异性siRNA表达质粒的构建与转染及对血管平滑肌细胞作用初步探讨 [J], 张涛;羊镇宇;薄小萍;王强;陈茂华;李坚;郭素峡;冯健;尤华彦4.含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用 [J], 郭虹;陈观今;郑焕钦5.弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建 [J], 郭虹;陈观今;周永安;郑焕钦;刘彦文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HPV16 E7c与人β防御素2融合基因表达质粒的构建、表达与免疫功能实验研究的开题报告

HPV16 E7c与人β防御素2融合基因表达质粒的构建、表达与免疫功能实验研究的开题报告

HPV16 E7c与人β防御素2融合基因表达质粒的构建、表达与免疫功能实验研究的开题报告
研究背景与意义:
人类乳头瘤病毒(HPV)感染是导致宫颈癌和其他妇科癌症的主要原因之一。

感染HPV16和18型病毒株增加了罹患宫颈癌的风险，并且这两
种病毒占所有宫颈癌的70％以上。

因此，发展HPV16和18预防和治疗
新策略至关重要。

人β防御素2(DEFB2)是一种天然免疫反应分子，具有广谱抗病毒和
抗肿瘤活性。

因此，将HPV16 E7c与DEFB2基因融合可能会提高病毒病和肿瘤的免疫保护作用。

因此，本研究旨在构建HPV16 E7c和DEFB2基因的融合质粒，并研究其免疫功能，以寻求一种新的HPV16相关疾病的预防和治疗策略。

研究方法:
1.利用PCR扩增HPV16 E7c和DEFB2基因序列，并进行DNA连接。

2.将E7c-DEFB2融合基因克隆到表达载体pUC57中。

3.转化大肠杆菌DH5α菌株，并筛选获得重组融合质粒。

4.提取重组质粒进行限制性酶切和测序验证。

5.将重组质粒转染入HEK293T细胞，用Western blot检测蛋白表达。

6.合成E7c、DEFB2和E7c-DEFB2的多肽，用于实验分析多肽的免
疫反应。

预期结果和意义:
预计成功构建HPV16 E7c和DEFB2基因的融合质粒，并在
HEK293T细胞中成功表达融合蛋白。

使用合成的多肽对小鼠进行免疫，
并通过检测小鼠的免疫反应来评价E7c-DEFB2多肽的免疫效果。

如果本研究成功，本研究将提供一种新的HPV16相关疾病预防和治疗策略。

T C-1-HPV16 L1细胞模型与动物模型的建立与评价

T C-1-HPV16 L1细胞模型与动物模型的建立与评价

T C-1-HPV16 L1细胞模型与动物模型的建立与评价李莉莉;王鹤蓉;周芷亦;罗婧;周玉柏;曾毅【期刊名称】《北京工业大学学报》【年(卷),期】2016(042)010【摘要】为了解决人乳头瘤病毒16型L1蛋白(HPV16L1)为主要靶点的疫苗缺乏肿瘤模型细胞来验证疫苗的免疫效果的问题,构建了一个细胞模型并可以利用此细胞在实验动物体内形成肿瘤,用于以HPV16L1为主要靶点疫苗的验证实验。

利用这个模型细胞或肿瘤模型可以在体内外检测疫苗的免疫学性质和保护功效。

首先,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法获得目标基因HPV16L1的基因序列并连接到载体质粒中,将质粒转染到细胞TC-1后在杀稻瘟菌素抗性压力筛选下获得稳定表达HPV16L1的细胞株。

对TC-1和TC-1-HPV16L1两种细胞的生长增殖和成瘤特性进行比较发现,外源基因的加入对细胞特性没有影响。

通过体外杀伤实验证实细胞TC-1-HPV16L1能够被HPV16L1靶点疫苗免疫过的小鼠脾淋巴细胞杀伤。

实验动物被疫苗免疫后,进行攻瘤实验发现疫苗只对TC-1-HPV16L1组具有保护作用。

综上,在本研究中成功地构建了可以检测HPV16L1疫苗的抑瘤效果的模型细胞TC-1-HPV16L1,为HPV疫苗的研究提供了一个模型细胞。

【总页数】7页(P141-147)【作者】李莉莉;王鹤蓉;周芷亦;罗婧;周玉柏;曾毅【作者单位】北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 100052【正文语种】中文【中图分类】U461;TP308【相关文献】1.U251细胞系来源的脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物模型的建立 [J], 陈成;陈锦轮;赵永阳;方加胜2.大鼠肝细胞凋亡和坏死动物模型的建立及评价 [J], 黄丙仓;詹松华;邱书珺;张蕾3.肥大细胞瘤小鼠异基因造血干细胞移植的急性移植物抗宿主病动物模型的建立和评价 [J], 陈伟红;刘焕勋;冯春锐;张晓翰;翁光样;罗畅如;谢媚;杜新;张巧霞;楼瑾;卓家才;蔡云;史敦云4.糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立 [J], 韩小乐;田磊;夏小林;糜亮亮5.人源性的小细胞肺癌异种移植动物模型及耐药模型的建立 [J], 朱亚如;黄卫妹;吴源周;贾龙飞;李雅玲;陈瑞;郭琳琅;陈群清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。