峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用
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第36卷第3期 2015年5月 吉首大学学报(自然科学版) Journal of Jishou University(Natural Science Edition) Vol|36 NO.3
May 2015
文章编号:1007—2985(2015)03—0090—04 峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用
周罗琴,田宏现 (吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000)
摘要:研究峨嵋双蝴蝶植物水提物的抗五步蛇毒作用.建立小鼠五步蛇毒中毒模型,观察小鼠的中毒表现,并统计小 鼠的死亡率,比较小鼠组织出血、组织坏死及组织溃疡状况.结果发现,峨嵋双蝴蝶植物水提物给药组动物的死亡率较模型 组的明显下降,局部和全身症状较轻,而且随着剂量的增加症状显著减轻,尤其是对于组织的保护作用比较明显.峨嵋双蝴 蝶植物水提物具有抗五步蛇毒作用,能降低蛇毒毒性. 关键词:双蝴蝶提取液;五步蛇;抗毒性;保护率 中图分类号:R996.3 文献标志码:B DOI:10.3969/j.cnki.jdxb.20l5.03.0l9
五步蛇又称尖吻蝮、蕲蛇等,是中国重要10大毒蛇之一.五步蛇个体大,毒液多,其蛇毒中含有纤溶 酶、凝血酶样酶、蛋白水解酶、出血因子等2O余种蛋白质,会导致伤后发病急剧,变化迅速,对血液及循环 系统破坏尤为明显,属于循环毒,易造成广泛出血、溶血和组织坏死,如不及时救治,容易造成伤肢致残,甚 至危及生命 .现在治疗五步蛇毒的药相继问世,除常规抗五步蛇毒血清和季德胜蛇药外,还有蛇伤l号 合剂 、青龙蛇药 、A草蛇药片ll7 等以中草药为主的单方及验方.传统中药治疗蛇伤历史悠久,积累了丰 富的经验,对提高人体的抗蛇毒能力、泄毒排毒、消除中毒症状、减少组织损伤具有独到的功效.常用治疗 蛇毒的中草药通常有清热解毒、通腑泄火、凉血止血等功能,具抗菌消炎、改善微循环等作用,如黄莲、半支 莲、丹皮、丹参、三七粉、地耳草、地胆头、岗梅根、半夏、天南星等 。 】. 笔者对峨嵋双蝴蝶(Tripterospemum cordatum)植物提取液对抗五步蛇毒的作用进行了研究.峨嵋双 蝴蝶,双蝴蝶属,别名肺形草、黄金钱,属于龙胆科多年生常绿缠绕草本.全球大约17种,中国有15种,其 中中国台湾分布2种,它们都具有相似的形态和利用价值,主要分布于湖南省、湖北省、重庆市、四川省、贵 州省、云南省等地区.中医书记载,峨嵋双蝴蝶性寒、味甘辛,具有润肺止血、清热利尿、解毒、消肿等功 能 .有相关实验研究 表明,从Tripterospemum中提取的Terahydoxy xanthone(THXS)对鼠科动物 的白血病毒的反转录具有强烈的抑制作用;也有台湾学者l1 实验证明,Tr 声f ros声e “ Lanceolatum中 的Norathyrial对循环系统和神经系统的炎症有明显的抑制功能;体外实验口 也证明它有较好的抑菌活 性;还有文献口5_记载它作为治疗蛇伤的中草药.
1材料与方法 1.1材料 1.1.1仪器 KQ一500DB型数控超声波清洗器,购于昆山市超声仪器有限公司;RE52—99蒸发器,购于 上海市亚荣生化仪器厂;SHB—III循环水式多用真空泵,购于郑州市长城科工贸有限公司;MDF— V2086S低温冷冻干燥机,由军事医学科学院实验仪器厂研制,由北京市四环科学仪器厂提供.
*收稿日期:2015—01—17 作者简介:周罗琴(1 987一),女,湖南邵阳人,吉首大学生物资源与环境科学学院硕士研究生,主要从事植物学研究 通信作者:田宏现(1953一),男,湖南保靖人,吉首大学生物资源与环境科学学院教授,博= ,主要从事微生物学和林 业生物技术研究. 第3期 周罗琴,等:峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用 1.1.2实验动物清洁级BACB/C小白鼠数只,雌雄兼用,体重18~23 g,由广州市中山大学实验室动物 中心提供;KM种小鼠,体重18 ̄22 g,购于中南大学湘雅医院实验动物中心. 1.1.3实验植物及药物峨嵋双蝴蝶采集于湖南省怀化市中方县.取全草洗净,自然阴干;称干重536 g浸 泡于6 500 mL水中24 h,通过低温(60℃)超声波抽提2 h,过滤.滤渣加入1 250 mL水第2次抽提,过滤 后再收集滤渣加入1 000 mI 水和800 mL水重复抽提第3、第4次,第2到第4次抽提时间分别为1 h.最 后共收集滤液6 500 mL,合并滤液通过蒸发器浓缩至600 mL.将得到的浓缩液用低温冷冻干燥机干燥, 得浸膏粉末113 g,放置冰箱中保存备用(临用前加蒸馏水稀释至所需实验质量分数). 1.1.4蛇毒纯化干粉,购于广州市养蛇场. 1.2实验方法 1.2.1峨嵋双蝴蝶水提物动物急性毒性实验 因预实验发现该药物毒性过低,LD 。无法测出,故进行最大 耐受量实验.小鼠口服灌胃最大耐受量实验:选用18~22 g健康KM种小鼠4O只,雌雄各半,随机抽取, 均匀分组,给药组与对照组各20只,分笼饲养2 d,实验前16 h禁食.给药组按一次性灌胃给药,所配制的 药液每毫升含峨嵋双蝴蝶水提物0.55 g(最大溶解度),小鼠灌胃容积为0.04 mL/g(最大容积),小鼠给药 量为峨嵋双蝴蝶水提物22.0 mg/g,合生药为79.3 mg/g.对照组给等量的生理盐水0.04 mL/g,观察 7 d.结果给药组与对照组均未见异常,12 h内健在,72 h后处死解剖尸体验心、肺、肝、脾、肾等脏器,肉眼 未见异常.结论:小鼠灌胃给药峨嵋双蝴蝶水提浸膏粉的最大耐受量(MTD)为22.0 mg/g,合生药为 79.3 mg/g,相当于人临床用量的165倍. 1.2.2五步蛇毒致死剂量和时间的确定为了节省实验动物,用序贯法(上下法)计算LD 。,缺点是动 物必须逐个进行实验,下一只动物用药剂量又决定于上一只动物的反应情况,实验时间较长,而它适合急 性致死药物的动物实验.选用1O只18 ̄22 g健康小白鼠,雌雄各半,随机抽取.分别配制好4种不同质量 分数的五步蛇毒生理盐水注射液,通过预试验确定剂量分组,在本实验中即为2.5,2,1.5,1/ ̄g/g这4种. 实验先从较大剂量开始,第1只动物用五步蛇毒生理盐水注射后,如果发生死亡,在表中以“+”记录,下一 只动物就降低一级剂量注射;相反,如果动物存活,在表中以“一”记录,下一只动物就用高一级的剂量;依
此类推.最后1只动物虽未进行实验,但在表格内仍占位置,以“×”符号表示.本方法所用动物总数 也应事先定好,一般>:7"/一lO即可获得满意的结果.实验结果如表1所示,其中:D为蛇毒致死剂量实验 组;S(safe)为存活数;F(fata1)为死亡数; (number)为剂量组的动物数;X—log D,即剂量的对数. 表1五步蛇毒半数致死剂量(LD 。)的实验 D/( g・g )X 实验结果 S F 靠 X 2.5 2 1.5 1 + O 1.204 0.88 O
设C一>:>:( X),则C===2.084.根据I D 。一log (c/>: ),得LD5。一log (2.084/10)一1.6. i 即五步蛇毒皮下注射对小白鼠的半数致死量LD 。为1.6 g/g.
根据致死剂量实验结果,选择健康的BACB/C小白鼠数只,体重为18~22 g,雌雄各半,随机抽取分 组.按1.6 g/g蛇毒质量分数加3 mL的生理盐水(O.32 g/i )配成注射液注射小鼠(0.1 mL/只).实验结 果表明,注射蛇毒后能使动物致死时间控制在6 h左右,符合本实验时间规定要求(3~8 h),因此确定为本 实验的注射质量分数. 1.2.3小白鼠中毒模型建立将BACB/C小白鼠随机分配为峨嵋双蝴蝶植物水提物低、中、高剂量组及空白 组、模型组(五步蛇毒中毒损伤组),各组小白鼠15只.峨嵋双蝴蝶植物水提物低、中、高剂量组给予峨眉双蝴 蝶植物水提浸膏(分别为成人用量的1.5,3,5倍),空白组和模型组给予相同剂量的生理盐水.以上各组动物 均在实验前禁水16 h,各实验组按每只0.5 mL的剂量灌胃,连续7 d给药,每日给药1次.除空白组外,各组 小鼠均于末次给药后1 h,于每只腹腔注射五步蛇毒100 g,建立小鼠五步蛇毒中毒模型. 1.2.4小白鼠中毒表现观察注射蛇毒后由实验人员轮流24 h观察,记录各组动物各个时间段内的局部 症状以及呼吸、食欲、活动等全身状况,以动物的死亡数累计各组的实验结果.计算各组动物死亡率和保护
O 4 5 1 1 4 1 O O O 3 1 ) + ( × + 一 十 + 9 O O 7 1 O 9 O 7 3 3 l O O 0 O 92 吉首大学学报(自然科学版) 第36卷 率(模型组死亡率一给药组死亡率一保护率).按死亡率的百分率显著性检测进行统计分析 j.24 h后解 剖各实验组小鼠,观察其组织出血量,组织坏死面积以及溃疡发生面积,各指标程度的轻重用“+”的个数 表示,越多表示程度越重. 1.2.5数据处理采用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差( i s)表示,行双侧 检验,检验水准a---0.05.组间多重数据比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果与讨论 2.1中毒表现 除空白组外,各组小鼠从注射五步蛇毒数分钟后,注射部位充血开始,表现为呼吸急促,眼睛瞳孔缩 小,全身缩成一团,行动缓慢,并均有不同程度的嗜睡、懒动等症状.这些症状模型组动物表现得更为明显, 该组死亡1O只,死亡动物都有肛门出血等现象.各剂量组注毒后也出现一些死亡,但并发症状比模型组所 表现的程度轻.3 h后可以看到注射部位充血严重,局部皮肤均出现紫绀、溃烂如烫伤样. 2.2死亡率和保护率 由表2可以看出,各剂量组都表现了不同 程度的保护情况,尤其是高剂量组的峨嵋双蝴 蝶浸膏溶液对五步蛇毒抗性明显,保护率高达 60 ,死亡率明显降低.这说明高剂量的峨嵋双 蝴蝶浸膏溶液具有较强的抗五步蛇毒性的 作用. 2.3组织坏死对比
表2不同剂量药物对中毒小鼠的保护情况 组别 动物数死亡数存活数死亡率/ 保护率/ 模型组 15 lO 5 67 低剂量 15 8 7 53 14 中剂量 15 4 9 26 41 高剂量 15 1 14 7 6O
动物中毒死亡后,将各剂量组和模型组动物取样解剖,与正常健康小鼠(空白组)解剖做对比实验.健 康小鼠血液鲜红、血流正常,肝、肾、脾等内脏无充血等异常现象.而中毒小鼠局部注射部位溃烂,出现结痂 表3局部注射蛇毒后各组织中毒程度对比 并形成血肿块,解剖脏器均有不同程度的充血,血液
注 以上表现程度轻重由“+”多少来表示 呈黯红,血流缓慢,严重的情况肉眼可见肝脏坏死. 解剖前后还对各剂量组和模型组的中毒状况作了对 比,观察各组小鼠的中毒情况,并做详细记录.表3 示出以各组注毒后所出现的局部肌肉组织的出血、 坏死和溃疡情况为例,不同质量分数的峨眉双蝴蝶 植物水提浸膏对抗五步蛇毒的结果.