日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究

中国寄生虫学与寄生虫病杂志２０１５年８月第３３卷第４期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　Ｐａｒａｓｉｔ　Ｄｉｓ　Ａｕｇ．２０１５．Ｖｏ１．３３．Ｎｏ．４　・２５１・　文章编号：１０００．７４２３（２０１５）一０４—０２５１．０７　日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能　的初步研究　

柴日奕　，王吉鹏　，李健－，张瑞祥　，李青　，刘牧－，辛明　，徐斌　，胡薇－，ｚ　

【论著】　

【摘要】　目的　探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ．１ｉｋｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ）在终宿主体内的基因表　达、定位和潜在功能，评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。　方法利用软件分析日本血吸虫胰凝　乳蛋白酶样蛋白（　ＣＴＲＬ）基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＦＮ３１７５６１．１）的理化特性．及与其他物种同源基因的种系发　生关系。采用整体原位杂交法定位ＳｊＣＴＲＬ基因转录本在ｄ　成虫中的表达部位。利用实时定量荧光ＰＣＲ方法监测　感染后１４、１８、２２和２６　ｄ等４个发育时期雌雄虫的ＳｊＣＴＲＬ基因转录水平。制备ＳｊＣＴＲＬ．ｄｓＲＮＡ，采用体外浸泡　法对ｄ　合抱雌雄虫进行ＲＮＡ干扰，并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去　除跨膜结构的编码基因序列，并克隆至ｐＥＴ．２８ａ原核表达载体，转化大肠埃希菌（Ｅ．ｃ０们ＢＬ２１（ＤＥ３）后进行　原核表达。将纯化重组蛋白免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠。用尾蚴（４０±２条／鼠）攻击感染进行动物保护性实验。同时设对　照组。感染后３５　ｄ收集虫体和肝脏，统计减虫率、每克肝组织减卵率。　结果　原位杂交定位结果显示。该基　因转录本位于雌虫后段肠道。ＳｊＣＴＲＬ基因仅在ｄ　雌虫体内有较高的转录本丰度。ＳｉＣＴＲＬ．ｄｓＲＮＡ干扰后雌虫相应　基因转录本的相对表达量降至２５．７％（Ｐ＜０．０５），但未有可观察到的形态学变化。构建了ｐＥＴ．２８ａ／ｓｊＣＴＲＬ重组质　粒，诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示，减虫率为２５．４％，减卵率为８０．５％。　结论初步探　明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在ｄ　雌虫的后段肠道高转录。体外干扰可降低ＳｊＣＴＲＬ基因的转录本水　平．该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠的成虫数和肝脏虫卵数　【关键词】　日本血吸虫；胰凝乳蛋白酶样蛋白；原位杂交；ＲＮＡ干扰；免疫保护　

中图分类号：Ｒ３８３．２４　文献标识码：Ａ　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ・ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　

ＣＨＡＩ　Ｒｉ－ｙｉ　，ＷＡＮＧ　ｊｉ－ｐｅｎｇ　，ＬＩ　Ｊｉａｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｒｕｉ—ｘｉａｎｇ　，ＬＩ　Ｑｉｎｇ　，　ＬＩＵ　Ｍｕ　，ＸＩＮ　Ｙｕｅ　，ＸＵ　Ｂｉｎ　，ＨＵ　Ｗｅｉ　，　

（１　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ；２　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００２５，Ｃｈ／ｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ—ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＳｊＣＴＲＬ）ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ，ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｍｍｕｎｅ—ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ＳｊＣＴＲＬ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＴＲＬ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｉｎ　２６一ｄａｙ－ｏｌｄ　ｗｏｒｍｓ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｗｈｏｌｅ—ｍｏｕｎｔ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＳｊＣＴＲＬ　ｉｎ　ｍａｌｅ　ａｎｄ　ｆｅｍａｌｅ　ｗｏｒｍｓ　ａｔ　ｆｏｕｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ（１４，１８，２２，ａｎｄ　２６　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ・ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ＳｊＣＴＲＬ—ｄｓＲＮＡ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｉｎ　２６一ｄａｙ—ｏｌｄ　Ｗｏｌｌｎｓ　ｖｉａ　ｓｏａｋｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｗｏｒｎｌｓ　ａｆｔｅｒ　ＲＮＡｉ．Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ｔｈｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ）ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　ｅＤＮＡ．Ｔｈｅ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐＥＴ一２８ａ　ｐｌａｓｍｉｄ，　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｅｒｃａｒｉａｅ．Ｔｈｅ　ｗｏｒｍｓ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｏｎ　ｄａｙ　３５　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｏｒｎｌ—　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｅｇｇ．ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　

基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．８１２７１８６７）　作者单位：１复旦大学生命科学学院，上海２Ｏ０４３３；２中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海２０００２５　通讯作者．Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｂｉｎ８８８２００３＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｒｎ　・２５２・　中国寄生虫学与寄生虫病杂志２０１５年８月第３３卷第４期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　Ｐａｒａｓｉｔ　Ｄｉｓ　Ａｕｇ．２０１５，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．４　ＳｊＣＴＲＬ　ｍＲＮＡ　ｗａｓ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｆｅｍａｌｅ　ｗｏｒｎｌｓ，ａｎｄ　ｈａｖｉｎｇ　ａｂｕｎｄｅｎｃｅ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　２６一ｄａｙ—ｏｌｄ　ｆｅｍａｌｅ　ｗｏｒｍｓ．Ａｆｔｅｒ　ＲＮＡｉ　ｗｉｔｈ　ＳｊＣＴＲＬ—ｄｓＲＮＡ，ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｔｏ　２５．７％　（Ｐ＜　Ｏ．０５），ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ－２８ａ／ＳｊＣＴＲＬ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ　ＳｊＣＴＲＬ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ．Ｍｉｃｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇａｉｎｅｄ　ａ　ｗｏｒｍ—ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　２５．４％　ａｎｄ　ａｎ　ｅｇｇ—ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　８０．５％ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｅｒｃａｒｉａｅ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｅｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＳｊＣＴＲＬ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ　ｉｎ　２６一ｄａｙ—ｏｌｄ　ｆｅｍａｌｅ　ｗｏｒｍｓ，ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｂｅ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＲＮＡｉ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＳｊＣＴＲＬ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎ　ｒｅｄｕｃｅ　ａｄｕｌｔ　ｗｏｒｍｓ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｅｇｇｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ—ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ；Ｗｈｏｌｅ－ｍｏｕｎｔ／ｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；　ＲＮＡｉ：Ｉｍｍｕｎｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　

Ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．８１２７１８６７）　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｂｉｎ８８８２００３＠ａｌｉｙｕｎ．ｅｏｍ　

蛋白水解酶是血吸虫在脊椎动物体内寄生的关键　蛋白．参与了血吸虫尾蚴侵染宿主以及成虫营养的摄　取、成熟和繁殖、免疫逃避等生命过程Ｎ，２１。丝氨酸　蛋白酶超家族（ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）是一类以一个特　定的丝氨酸（Ｓｅｒ）残基作为必需催化基团的蛋白　水解酶，其家族成员主要有胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ）、　类胰蛋白酶（ｔｒｙｐｔａｓｅ）、弹性蛋白酶（ｅｌａｓｔａｓｅ）、枯　草杆菌蛋白酶（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、凝血酶（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）和　纤溶酶（ｐｌａｓｍｉｎ）等　。在原核生物中，丝氨酸蛋　白酶直接执行食物的消化或降解功能：而在真核生　物中通过一系列的酶或蛋白质激活．完成细菌降　解、食物消化、血液凝固、发育过程、免疫过程和　细胞衰老等功能…　对血吸虫丝氨酸蛋白酶家族成　员的研究大多聚焦于弹性蛋白酶　在曼氏血吸虫　（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ）尾蚴侵染宿主时。弹性蛋白　酶通过降解宿主皮肤中所含的弹性蛋白帮助尾蚴完　成侵染过程　研究者在２００９年日本血吸虫全基因　组数据公布之时　发现．与曼氏血吸虫鉴定出５个　尾蚴弹性蛋白酶（ｃｅｒｃａｒｉａｅ　ｅｌａｓｔａｓｅ，ＣＥ），￣ＰＳｍＣＥ１ａ、　ＳｍＣＥｌｂ、ＳｍＣＥ２ａ［　、ＳｍＣＥ２ｂ、ＳｍＣＥｌｃ［。　相比，　日本血吸虫中仅发现一种弹性蛋白酶（ＳｊＣＥ２ｂ）．　系统进化分析表明ＳｊＣＥ２ｂ与ＳｍＣＥ２ｂ为直系同源　除此之外日本血吸虫中其他丝氨酸蛋白酶的研究仍　未见报道。　在曼氏血吸虫的全基因组　报道后．ＨｏＩＴＩ等Ｅｌｏｌ　对丝氨酸蛋白酶家族中的其他成员进行再挖掘．发　现了该家族的５个成员．包括胰蛋白酶样蛋白１～４　（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ　ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＳｍＳＰｓ　１－ＳｍＳＰｓ　４）　和胰凝乳蛋白酶样蛋白（ＳｍＳＰ５），通过构建吸虫　纲丝氨酸蛋白Ｓ１家族系统进化树得出结论．ＳｍＳＰ５　位于血吸虫蛋白酶Ｓ１家族系统发生树中的一个新的　分支．该分支介于血吸虫的尾蚴弹性蛋白酶和Ｓ１其　他家族的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶之间［ｍ］。　本研究从日本血吸虫全基因组数据库中筛选到　一个新的与已报道的曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶　ＳｍＳＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＨＩ４６４０９．１）　］核苷酸　序列相似性为７９％．蛋白序列相似性为７２％的日本　血吸虫丝氨酸蛋白酶基因．经注释命名为日本血吸　虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因（Ｓ．ｆａｐｏｎｉｃｕｍ　ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ—ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｇｅｎｅ，简称Ｓ／ＣＴＲＬ基因）．　通过原位杂交、ＲＮＡｉ、不同时期转录本水平变化、　克隆表达该蛋白．并进行免疫保护实验等．初步研　究　ＣＴＲＬ基因及其编码的重组蛋白的生物学特性。