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生物标记法剖析传统酿造用大曲微生物

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165※生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 11

生物标记法剖析传统酿造用大曲微生物群落结构

秦 臻，郑 佳，彭昱雯，金 扬，黄 钧，周荣清*(四川大学轻纺与食品学院，制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065)

摘 要：建立一种基于生物标记物表征大曲类固态发酵体系微生物群落结构的生物化学方法。以微生物细胞膜的特征组分磷脂脂肪酸(PLFAs)组成信息为指标，描述大曲微生物群落结构特征；采用麦角甾醇标记物含量估算出样品真菌生物量。结果显示：5种不同生产工艺的大曲样品中共计检出18种磷脂脂肪酸，优势PLFAs是16:0、18:2ω6,9和18:1ω9，占总PLFAs物质的量的90%以上。从PLFAs组成特征判断5类大曲中优势菌群均为真菌。基于麦

角甾醇含量与真菌生物量的关联性，估算出绝干大曲中的真菌生物量分布在(110.45±4.60)～(218.47±11.19)μg/mg。关键词：大曲；磷脂脂肪酸；微生物群落结构；麦角甾醇；真菌生物量

Characterization of Microbial Community Structure in Daqu Starter Based on BiomarkersQIN Zhen，ZHENG Jia，PENG Yu-wen，JIN Yang，HUANG Jun，ZHOU Rong-qing*(National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Manufacture, College of Light Industry, Textile and Food,Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Abstract ：A biochemical technique for characterizing the microbial community structure in Daqu starter was established onthe basis of different biomarkers. The microbial community structure was characterized by using the content of phospholipidfatty acids (PLFAs) determined by GC-MS and the biomass of predominant microbial community in Daqu starter was estimatedby the content of ergosterol. A total of 18 species of PLFAs were determined quantitatively in Daqu starter. The predominantPLFAs were 16:0, 18:2ω6,9 and 18:1ω9, which reached up to 90% of total PLFAs. The results showed that predominant

microbial community in Daqu starter was fungi. According to the relative ratio between ergosterol content and fungal biomass in Daqustarter, fungal biomass in five kinds of Daqu starters was in the range of (110.45±4.60)－(218.47±11.19)μg/mg dry weight.Key words：Daqu starter；phospholipid fatty acids；microbial community structure；ergosterol；fungal biomass中图分类号：Q599 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)11-0165-06

收稿日期：2010-09-26基金项目：四川省科技支撑计划项目(2008NZ0014)；四川省重大科技攻关项目(09ZC00735)作者简介：秦臻(1987—)，男，硕士研究生，研究方向为现代发酵技术。E-mail：qzh1026@foxmail.com*通信作者：周荣清(1960—)，男，教授，博士，研究方向为发酵工程与生物化工。E-mail：rqzhou@163.com

磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)是几乎所有微生物(除古生细菌外)活细胞膜的重要组成成分，而非贮存组分，这类组分在细胞生长阶段迅速合成，一旦细胞死亡则快速降解[1-2]。因此在土壤、堆肥等体系的研究中，PLFAs分析常作为生化指纹图谱表征体系总生物量和微生物群落结构特征的信息[3-4]，是研究微生物群落结构的有效免培生物化学方法之一。麦角甾醇是多数真菌细胞膜的主要甾醇类组分[5]，作为真菌活细胞中的生化指纹图谱，具有较几丁质等其他生物组分更灵敏、可靠[6-7]，易萃取的特点，所以常采用HPLC检测并用于表征土壤等复杂微生物菌落中的真菌量[8]。在诸如白酒、食醋等中国传统酿造生产中，大曲不仅是重要的生物催化剂，也是产品中香味组分的主要来源之一。独特的生产工艺与悠久的生产历史赋予其微生物群落结构多样性和时空性。对菌落结构和优势微生物特性的认识与了解是研究大曲在酿造过程中的作用机理与实现有序控制的重要基础。基于可培养方法研究大曲微生物群落特征所取得的成果，揭示了大曲中优势微生物种属的分布情况，促进了酿造微生物相关研究的发展[9]；基于PCR的免疫培养技术在大曲微生物群落结构

剖析研究的应用，为从分子生物学的水平全貌认识和了解其群落结构开辟了有效途径[10]。但因实验操作繁琐、 2011, Vol. 32, No. 11食品科学※生物工程166

结果不稳定、无法跟踪微生物消长过程等多种因素的限制，这些方法在定量揭示微生物群落特征方面存在许多局限。本研究基于细胞膜中PLFAs及麦角甾醇生物指纹图谱的特征及可量化性，探究应用色谱技术快速分析浓香型白酒和四川阆州(保宁)麸醋两种不同类型大曲微生物群落结构组成，并定量估算其真菌生物量，为研究中国传统酿造生产过程微生物消长规律开辟了一条有效途径。

1材料与方法1.1微生物与培养基根霉(Rhizopus Q303)：由中国工业微生物保藏中心四川分站提供；毛霉(Mucor)：本实验室保藏，分离自豆腐乳坯，经形态和生理生化实验鉴定；米曲霉(Aspergillus oryzae，As3.811)：由中科院普通微生物研究所(CGMCC)提供；伞枝犁头霉(Absidia corymbifera，CQB43)：本实验室保藏，分离自麸醋醋曲，经26SrDNA及ITS区鉴定。培养基[11]：PDA培养基、Czapek培养基。

1.2大曲样品浓香型白酒用大曲：偏高温大曲(A)和高温大曲(B)由四川泸州老窖股份有限公司提供；阆州麸醋母曲(C)和块曲(D)由四川阆州醋业有限公司提供；保宁麸醋块曲(E)由四川省保宁醋业有限公司提供。分别在大曲曲块表面，边角，中心各取相同质量曲块小样，粉碎，充分混匀，置于无菌广口瓶中，4℃保藏备用。1.3仪器与设备TRACE GC DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪(配备毛细管柱TR-5MS(30.0m×320μm，0.25μm)及Xcalibur1.2数据处理系统) 美国Thermo Fisher公司；Agilent 1100高效液相色谱系统(配备色谱柱Phenomenex Luna 5μmC18(2)100A (150mm×4.60mm)和Rev.A.06.03色谱工作站)

美国Agilent公司；SPE-SI硅酸键合固相抽提小柱(3mL-250mg) 德国Hardwee公司。1.4方法1.4.1菌种培养及收集采用玻璃纸法：斜面菌种经活化后，用接种针挑取3环制备成孢子悬浮液，取0.5mL均匀涂布在覆有灭菌玻璃纸的PDA培养基平板上，(30±1)℃培养不同时间，收集菌丝体。

1.4.2样品中PLFAs的提取采用修正的Bligh-Dyer法[12-13]。按0.8:1:2的体积比

向3g(湿质量)样品中依次加入3.2mL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)、4mL氯仿和8mL甲醇，于暗处、

室温、250r/min条件下振荡2h。先后加入4.8mL缓冲液和 6mL氯仿，剧烈振荡混匀，静置过夜。将氯仿相(下层)转移至新试管中，氮气吹干。提取出的脂肪酸用氯仿溶解，转移至硅酸键合固相抽提小柱中，分别用10mL氯仿、10mL丙酮、10mL无水甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，氮气吹干。磷脂的碱性甲醇水解和皂化：向干燥所得样品中加入甲苯:甲醇(体积比1:1)混合液1mL，1mL 0.2mol/L氢氧化钾-甲醇，37℃水浴保温15min。冷却后，加入2mL超纯水和0.3mL乙酸溶液(1mol/L)，用4mL正己烷分两次萃取样品中脂肪酸甲酯，取有机相，氮气吹干，加入内标物正十九酸甲酯，供GC-MS检测。

1.4.3样品中麦角甾醇的提取采用皂化萃取法[14]：称取适量样品(大曲0.5g或菌丝体0.1g)置于磨口锥形瓶中，加入甲醇15mL萃取2min，依次加入乙醇15mL，氢氧化钾0.4g，水浴回流60min，冷却后加入适量蒸馏水稀释。60mL正戊烷萃取皂化液，收集正戊烷相，减压蒸馏除去正戊烷。适量甲醇洗出样品，氮气吹干，用甲醇定容至2mL，4℃避光保存，供HPLC检测。1.5分析检测方法1.5.1PLFAs的GC-MS检测其程序温度为初始温度40℃，保持5min，以5℃/min升到200℃保持10min；载气：高纯氦，流速为1mL/min，分流比15:1。质谱条件：连接口温度：250℃；电离方式：EI；电子能量：70eV；离子源温度：200℃；扫描范围：40～500u。

1.5.2麦角甾醇的HPLC检测待测样品通过手动进样器进样20mL。流动相：100%甲醇；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：282nm。1.6数据处理检测的质谱数据通过与标准谱库(NIST2005) 对照进行成分鉴定，使用Xcalibur 软件系统对结果数据进行处理，采用SPSS 17系统进行PLFAs主成分分析。

2结果与分析2.1磷脂脂肪酸组成与微生物群落结构特征2.1.1不同类型大曲及不同生产工艺大曲中的PLFAs组成特点磷脂脂肪酸的命名采用以下原则：以总碳数：双键数ω双键距离分子碳链端位置命名，前缀a和i分别表示支链的反异构和异构，Me前数字表示支链距离碳链端距离，cy则表示环丙烷脂肪酸；br表示支链位置未知，后缀c表示顺式，t表示反式[15]。

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高温大曲中微生物的分离与鉴定

高温大曲中微生物的分离与鉴定

高温大曲中微生物的分离与鉴定刘效毅;郭坤亮;辛玉华【摘要】The diversity of microbes in high-temperature Maotai-flavor Daqu was analyzed by traditional separation and culture method and modern molecular biological method.147 microbial strains were separated successfully,among them,97 strains were bacteria includingBacillus,Actinomycetes,Staphylococcus,and Micrococcus,and the other 50 strains were mould including Penicillium,Aspergillusfumigatus,Mucor,Alternaria,Phoma,Chaetomium globosum,Eurotium,and Monascus.The research results further proved the diversity of microbes in high-temperature Daqu.（Tran.by YUE Yang）%采用传统分离培养方法和现代分子生物学方法,对酱香型白酒高温大曲中微生物的多样性进行研究分析。

从酱香型白酒高温大曲中分离出147株微生物,其中97株为细菌,包括芽孢杆菌、放线菌、葡萄球菌、微球菌4类;50株霉菌,包括青霉、曲霉、毛霉、交链孢霉、茎点霉菌、球毛壳、散囊菌、红曲霉8类,研究结果表明,高温大曲中的微生物具有高度的多样性。

【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】4页(P52-55)【关键词】酒曲;微生物;鉴定;生理生化特性;16S;rRNA基因;ITS【作者】刘效毅;郭坤亮;辛玉华【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;中国科学研究院微生物所,北京100101【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;TS261.1茅台酒是高温大曲酱香型白酒的典型代表，以用曲量大，制曲温度高为特点。

民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定

民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定

民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定李健容;蔡爱群【摘要】酿造酒的独特风味、质量与酒曲中的微生物密切相关.从选取的民间传统酒曲中主要分离得到酵母茵和根霉菌,还有少量曲霉茵等.通过对其微生物进行茵落特征、茵体形态观察和生理生化特征检测,鉴定出酵母茵有3类,分别为酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia);根霉菌有2类,分别为米根霉(Rhizopus chinensis)和华根霉(Rhizopus oryzae).【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2007(000)005【总页数】6页(P111-115,121)【关键词】酒曲;酵母菌;根霉菌;分离;鉴定【作者】李健容;蔡爱群【作者单位】韶关学院英东生物工程学院,广东,韶关,512005;韶关学院英东生物工程学院,广东,韶关,512005【正文语种】中文【中图分类】工业技术酿酒科技 2007年第 5 期（总第 155 期）．LIQUOR-MAKING SCIENCE＆TECHNOLOGY2007 No.5(T01.155)aLi'kj.j民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定李健容，蔡爱群（韶关学院英东生物工程学院，广东韶关 512005 ）摘要：酿造酒的独特风味、质量与酒曲中的微生物密切相关。

从选取的民间传统酒曲中主要分离得到酵母菌和根霉菌，还有少量曲霉菌等。

通过对其微生物进行茵落特征、菌体形态观察和生理生化特征检测，鉴定出酵母菌有 3 类，分别为酒香酵母属（ Brettanomyces ）、假丝酵母属（ Ccm-dida）、毕赤氏酵母属（ Pichia ）；根霉菌有 2 类，分别为米根霉（ Rhizopu^schinensis ）和华根霉（ Rhi-zopus oryzae ）。

关键词：酒曲；酵母菌；根霉菌；分离；鉴定中图分类号：TQ925.7 ； TS261.1 ； Q93-3 文献标识码： A 文章编号：1001-9286(2007)05-0111-05 IsolationandIdentificationof MainMicroorganisms in TraditionalDistiller's Yeast LI Jian-rong andCAIAi-qun (Yingdong College ofBioengineering,ShaoguanUniversity, Shaoguan,Guangdong512005,China) Abstract: The specific flavor andhighquality ofliquorisclosely related to the microorganismsindistiller'syeast.The marnmicroorganismsisolated fromthe selected tradtional distiller'syeastcoveredyeasts, thizopusandsmall quantity ofaspergillus etc.Throughthe detectionof the characteristicsof flora,the obervationof their appearance,andthe physio-chemicalanalysis,yeast wasidentifiedinto three typesincludingbrettanomyces,candidaand pichia; thizopus wasidentifiedinto twotypes includingthizopuschinen.sisandthizopusoryzae. Keywords:distiller'syeast;yeast; thizopus;isolation;identification中国酒曲历史悠久，有的学者认为，制曲酿酒可与我国古代四大发明相媲美。

传统大曲微生物多样性技术研究

传统大曲微生物多样性技术研究

传统大曲微生物多样性技术研究李凯;彭敦磊;孙端方【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2015(000)009【摘要】传统酒曲的运用是酿造名优白酒并形成独特风味的基础之一.随着微生物分类学技术的日益进步,揭示传统大曲中微生物多样性结构,对探明风味形成机理、优化生产工艺具有重要意义.简介了选择培养、生化鉴定、基因文库、DGGE等的基础性和适用性;探讨了质谱、定量PCR、高通量测序等的高效性及可行性.%The traditional Daqu is the key factor to produce famous Baijiu(liquor) with special flavor. With the increasing improvement in mi-crobial taxonomic techniques, the exploration of microbial diversity structure of the traditional Daqu is of great significance in the research on the formation mechanism of Baijiu(liquor) flavor, and the optimization of Daqu production techniques. In this paper, the applicability of bio-chemical identification, gene library, DGGE etc. was introduced briefly. The efficiency and the suitability of mass spectrum, real-time PCR, high throughout sequencing etc. were also elaborated.【总页数】4页(P33-36)【作者】李凯;彭敦磊;孙端方【作者单位】贵州省产品质量监督检验院,贵州贵阳550004;国家酒类及食品检验中心,贵州贵阳550004;贵州大学明德学院,贵州贵阳550025;贵州省产品质量监督检验院,贵州贵阳550004;国家酒类及食品检验中心,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】TS261.1;TS262.3;TS261.4;Q93-3【相关文献】1.采用BIOLOG微平板技术研究浓香型大曲微生物多样性 [J], 李浩;罗惠波;侯华;甄攀2.传统镇江香醋大曲酿制技艺关键技术研究 [J], 沈志远;乔桂清;朱胜虎;王海燕;杨永胜3.基于高通量测序技术分析牛栏山大曲微生物多样性 [J], 王勇;周森;魏金旺4.基于MiSeq测序技术石花酒大曲中微生物多样性解析 [J], 薛宇昂;郭壮;赵慧君;张振东;雷敏5.陶融型大曲微生物多样性与挥发性风味成分的相关性研究 [J], 陈蒙恩;侯建光;张振科;韩素娜;李建民;陈伟平;王二英;胡晓龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

平坝窖酒兼香型大曲发酵中的微生物变化探索

平坝窖酒兼香型大曲发酵中的微生物变化探索

平坝窖酒兼香型大曲发酵中的微生物变化探索作者：郭天佑来源：《中国食品》 2018年第11期一、微生物的来源和作用特点微生物来源多种多样，主要来自原料、空气、水和生产环境中，传统的开放式生产方式导致大曲发酵过程中微生物的变化极其复杂。

大曲中的微生物主要是细菌、霉菌、酵母菌、放线菌，其中细菌是生香动力，霉菌是糖化动力，酵母菌是发酵动力。

二、大曲发酵中微生物的变化分析大曲的培养管理就是通过人工控制，给予不同的微生物不同的生长环境，微生物的生长变化主要受到水分、温度和湿度的影响。

由于微生物的代谢受到水分的支配，从微生物的需求水分来看，一般规律是细菌>酵母菌>霉菌，根据大曲的培养规律，在发酵前期低温高湿的环境下霉菌和酵母菌生长旺盛，各种酶的活力也较强。

随着温度的升高，在高温大水环境中细菌开始大量生长，水分在大曲培养中与微生物的生长和酶的生成密切相关。

空气湿度是大曲发酵中必须控制的重要工艺参数，空气湿度控制适宜与否直接影响成品曲的质量，所以必须根据不同的培养阶段严格控制培养室内的空气湿度。

湿度过低会加快曲块内水分的挥发使曲块干裂、不生霉、皮厚、生心，过高则使曲块内水分不能排出窝水、生酸、滋生杂菌。

因为微生物合成各种酶系对水分的需要，在制曲期间通过维持一定的高湿环境，能够有效地控制曲块中水分的挥发，以保证菌体旺盛的新陈代谢。

在高温制曲的前期随着发酵把原料中的蛋白质分解成氨基酸，曲坯中的还原糖和氨基酸含量不断上升，随着曲坯品温逐渐上升到65℃，淀粉和蛋白质的分解进一步加剧，曲坯中的氨基酸、多肽、糖类大为增加。

同时温度的升高使霉菌和酵母菌大量死亡，高温细菌生长旺盛，产生的蛋白质水解酶将原料中的蛋白质分解成大量的游离氨基酸，给美拉德反应提供了足量的前驱物质。

兼香型白酒通过高温制曲中的美拉德反应产生的大量杂环化合物，是酒中酱香风味的主体物质。

大曲发酵的过程其实就是微生物在大曲中富集、生长，并在各个培养阶段进行着代谢和产物积累作用的过程，当大曲成熟后（安全水分内）这些微生物的细胞和酶等物质就会被大曲这个培养基质所固定下来，所以大曲的发酵其实是一个培养微生物的工程，当营造出一个适合大曲中微生物生长的环境时，就可以控制大曲的发酵。