HPLC法测定广西甜茶中水解型鞣花鞣质的含量

HPLC 法测定广西甜茶中水解型鞣花鞣质的含量莫建光1,陈秋虹1,徐慧1,卢安根1,周翔2(1.广西分析测试研究中心,广西南宁530022;2.广西大学,广西南宁530004)摘要 [目的]建立高效液相色谱法测定广西甜茶中水解型鞣花鞣质含量的方法。

[方法]色谱条件:W aters C 18柱(25010mm @4.6mm ,5L m ),柱温40e ,用乙腈-0.2%磷酸(体积比18B 82)为流动相,检测波长为254n m,外标法定量。

[结果]鞣花酸在0.1000~0.8755m g/m l 内与峰面积呈良好的线性关系,R 2=0.9991,最低检出限为0.65L g /m,l 平均加标回收率为97.12%,RS D 为1.04%。

[结论]该方法精确可靠,可作为广西甜茶中水解型鞣花鞣质含量测定的方法。

关键词 广西甜茶;水解型鞣花鞣质;高效液相色谱中图分类号 R 284.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)13-6926-03Deter m i nati on of H ydrol ysa b le E llagitann i ns i n Sweet T ea of Guangxi by HPLC MO Ji an -guang et al (G uangx iAnal y sis and Testi ng R esearch Cent er ,Guangx,i Nanni ng 530022)Abstract [Objecti ve]A HPLC method for t he separati on and deter m i nati on of hydro l ysabl e ell agitann i ns i n s w ee t tea o fG uangx iw as estab -li shed .[M et hod]Chro matography was perf or m ed on a W aters C 18(25010mm @4.6mm ,5L m )a t 254n m .T he m obile phase consisted of a m i xture o f ace t onitrile and 0.2%phospha t e ac i d (18B 82)a t a fl ow rate of 1.0m l/m i n ,hydro l ysabl e e llag it anni ns i n s weet tea o fGuangx iwerequantiz a t ed by externa l standardm et hod .[R esults]The standard curve o f li near relations h i pw as0.1000-0.8755mg /m l and R 2=0.9991,The lm i its of detecti on was 0.65L g /m.l The average recovery w as 97.12%,RSD w as 1.04%.[Concl usion]T he est ablis hed methodw as ac -curate and reliable f or the deter m i nation o f hydrolysable e llag it anni ns in s weet tea o fGuangx.i K ey words S weet tea o fGuangx;i Hydrol ysabl e e ll agitanni ns ;HPLC基金项目 广西科技基础条件平台建设项目(07-105-001)。

作者简介 莫建光(1955-),男,广西南宁人,硕士生导师,高级工程师,从事药品、食品化学成分和质量控制方法标准研究。

收稿日期 2010-01-25鞣花鞣质包括水解型和缩合型两大类,其中水解型鞣花鞣质为最常见、最重要的一类。

广西甜茶(Rubus s uavissi m us S .Lee)为蔷薇科悬钩子属多年生灌木,是近年来发现的一个新物种[1]。

水解型鞣花鞣质是广西甜茶中主要的一类活性物质。

有关研究表明[2-8],水解型鞣花鞣质具有抑制H I V 增生、清除自由基、抗过敏、抗肿瘤、抗突变、降低血压、预防骨质疏松等多种生理作用。

因此,水解型鞣花鞣质作为一种新型的药物原料和食品添加剂日益受到人们的重视。

水解型鞣花鞣质分子量大,结构复杂,运用常规方法很难对其进行定量检测。

平井孝一[9]的研究表明,甜茶中水解型鞣花鞣质在酸性条件下,高温易发生完全水解,生成没食子酸、鞣花酸及葡萄糖3种单体。

由于鞣花酸性质稳定,用紫外检测器易检出和定量,因此可选用鞣花酸为检测物质进而对水解型鞣花鞣质进行定量。

已有研究对多种物质的鞣花酸含量的测定方法进行了报道[10-15],但用H P LC 法测定广西甜茶中鞣花酸含量的研究尚未见报道,笔者对此进行了研究。

1 材料与方法1.1 试验材料 甜茶干叶(广西):正常落叶,晒干后备用。

1.2 仪器与设备 W aters 2695高效液相色谱仪(美国W a -ters 公司);W aters 2996紫外二极管矩阵检测器(美国W aters 公司);日立CR22G 高速离心机(日本日立公司);真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);烘箱(南京永兴干燥设备厂);聚四氟乙烯水解罐(郑州凯特瑞仪器有限公司)。

1.3 试剂 鞣花酸标准品(纯度\99%,购自S ig m a 公司)、甲醇、乙腈(色谱纯,购自F isher 公司)、其余试剂均为分析纯。

1.4 标准溶液的配制 准确称取鞣花酸标准品51.60m g ,置于100m l 容量瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀。

经0.45L m 微膜过滤得到浓度为0.5160mg /m l 的鞣花酸标准溶液。

1.5 高效液相色谱条件 色谱柱:W aters C 18柱(25010mm @4.6mm ,5L m );流动相:乙腈-0.2%磷酸溶液(体积比18B 82),流速1.0m l/m i n ,进样体积10.0L ;l 柱温:40e ;检测波长:254n m 。

1.6 样品处理 取一定量的甜茶干叶,粉碎后过40目筛网,准确称取粉碎后原料3.00g ,按照料液比1B 20、抽提温度85e 的条件,在60%乙醇溶液中回流2h ,离心(8000r/m i n ,10m i n),取上清液。

按照上述操作,重复提取2次。

合并上清液,真空浓缩至5m l 。

然后将浓缩液转移到聚四氟乙烯水解罐中,加入5m l 2m ol/L 的盐酸,在150e 条件下水解3h ,水解液用1%Na O H 中和后,转移到50m l 容量瓶中,用甲醇定容。

最后精密吸取1m l 于5m l 容量瓶中,用甲醇定容,经0.45n m 微孔滤膜过滤后供H P LC 测定。

外标法定量,以峰面积计算鞣花酸的含量。

2 结果与分析2.1 色谱条件的确定2.1.1 波长。

取一定浓度的鞣花酸标准溶液,在200~400n m 范围内扫描,吸收光谱如图1所示。

紫外吸收光谱显示鞣花酸在254和365nm 有吸收峰,其中在254nm 存在最大吸收峰,灵敏度高,重现性好,因此选择254n m 作为检测波长。

2.1.2 流动相选择。

高效液相色谱法流动相组成及配比影响被分析物的分离效果。

试验通过改变流动相的组成及配比来确定最佳条件。

用甲醇-水作流动相时色谱峰稍拖尾,这可能是因为酚羟基易产生电离,在固定相表面有双重的保留机制。

改用乙腈-0.2%磷酸溶液作流动相可使鞣花酸的电离被抑制,成为中性分子在反相条件下的疏水缔合物,使分离效果和峰型得到较大改善。

因此,试验选用乙腈-012%磷酸溶液作为流动相。

2.2 HPLC 测定 按照上述色谱条件进行鞣花酸标准溶液和甜茶样品的H P LC 测定,色谱图如图2和图3(图中r hs 为责任编辑 马树梅 责任校对 李岩安徽农业科学,Jou r n al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2010,38(13):6926-6928图1 鞣花酸紫外光扫描吸收光谱图F i g .1 UV chro m atogra m of ella g ic aci d鞣花酸的保留时间,下同)所示,可见鞣花酸分离良好,与其共存色谱峰的分离度大于1.5,符合测定要求。

图2 鞣花酸标准溶液色谱图F i g .2 HPLC chro m atogra m of ella g icacid图3 甜茶样品色谱图F ig .3 HPLC chro ma togra m o f s weet tea2.3 线性关系和检出限 准确称取一定量的鞣花酸标准品,加甲醇溶解并稀释定容,配制成一系列浓度的标准溶液(0.1000、0.3008、0.5160、0.7365、0.8755m g/m l),按上述色谱条件进行测定,以峰面积(Y )对标准品浓度(X ,mg /m l)进行线性回归。

鞣花酸回归方程为Y =4@107X -174433(R 2=0.9991),表明在0.1000~0.8755m g/m l 内线性范围良好。

根据信噪比S /N =3,测出鞣花酸的最低检出限为0165L g/m l。

图4 鞣花酸标准回归曲线F ig .4 St andar d regressio n c urve of ellagic acid2.4 精密度试验 精密吸取鞣花酸标准溶液(0.516m g/m l)10L ,l 按照上述色谱条件连续测定5次,并测定鞣花酸的峰值面积,结果RSD 为0.3%,表明精密度良好;取制备好的样品溶液10L ,l 按上述色谱条件连续进样5次,测定鞣花酸的峰面积,结果RSD 为0.2%,表明该方法精密度良好。

2.5 重现性试验 取同一产地同一批次广西甜茶样品6份,分别按样品处理方法制备,测定其鞣花酸峰面积,计算样品中鞣花酸平均含量为51.85m g/g ,RSD 为1.96%,表明样品处理过程和测定方法均有良好的重现性。

2.6 稳定性试验 取甜茶样品适量,按照/1.60操作,室温放置,分别在0、2、4、6、8h 时按上述色谱条件进行测定,鞣花酸峰面积的RSD 为1.03%,表明样品溶液在室温下比较稳定。

2.7 加标回收率 称取6份已知鞣花鞣质含量(51.85m g/g)的广西甜茶样品,分别接入鞣花酸标准样品并混合均匀,按上述样品处理方法及色谱条件进行测定,计算回收率,结果如表1所示。

表1 样品回收率试验结果Ta b l e 1 Sa mp l e recovery test res ults样品量M g Sa m ple w ei ght样品含量M m g Sa mp le conten t s加入量M m g Add i ng w ei ght总检出量M mg Det ectab l e w ei gh t回收率M %Recycli ng rate平均回收率M %Average recycli n g rateRS D M %2.0020103.803751.24152.949995.912.0391105.727351.24155.691797.511.9602101.636476.86176.977098.0297.211.041.9613101.693476.86176.188996.921.9900103.1815102.48201.910496.341.9957103.4770102.48204.510498.56从表1可以看出,回收率在95.91%~98.56%,平均回收率为97.21%,RSD 为1.04%,符合测试要求。