细胞学实验设计
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细胞生物学实验设计方案——
不同温度对细胞活性的影响
实验目的:
1、验证细胞培养过程中温度对细胞活性的影响
2、学会使用MTT法检测细胞活性。
实验原理:
四唑盐比色实验(MTT法)是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用
显色试剂四唑盐(MTT)是一种能接受氢原子的染料。MTT可作为哺乳类动物
细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时,线粒体内琥珀酸脱氢酶
可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan),将结晶的甲瓒溶解释
放,再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值,OD值的高低可间接反映活细胞的
数量及其活性。活细胞多则吸光度大,反之则吸光度小,从而反映出细胞的存活
及增殖情况。由此可通过检测在不同温度细胞的活性变化,从而验证细胞培养过
程中温度对细胞活性的影响。
实验器材:
1、实验仪器:96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板,悬浮生长的
细胞选用圆底型培养板)、移液器、吸管、离心管、血球计数板、孵箱、显微镜、
振荡混合仪、酶联免疫检测仪、离心机
2、实验试剂:MTT溶液(称取250mg MTT,放入小烧杯中,加50ml 0.01mol
/L, pH7.4的PBS,在电磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器
除菌,分装,4℃保存。两周内有效。)、含l0%胎牛血清RPM1640培养液、0.25%
胰蛋白酶消化液、二甲基亚砜(DMSO)
实验步骤:
1、接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,再用含10%胎牛血清
的RPMl604培养液配成单个细胞悬液,以每孔100-1000个细胞接种于2个96
孔培养板中,每孔体积200ul。
2、培养细胞:将培养板1移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及湿度条件
下,培养3—5天。 将培养板2移入CO2孵箱中,在25℃、5%CO2及湿度条
件下,培养3—5天。将培养板1移入CO2孵箱中,在42℃、5%CO2及湿度条
件下,培养3—5天。
3、呈色:培养第2—5天后,每孔加入MTT溶液(5mg/m1)20ul,对应温
度下继续孵育4h,终止培养,小心吸去孔内培养上清液;对悬浮生长的细胞,
需离心(1000rpm.5min),然后弃去孔内培养液。每孔加入150ul DMSO,振荡
10min,使结晶物充分溶解。
4、比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上调定各孔收值,记录结果。
对比不同温度下的细胞活性。
注意事项:
1、 选择适当的细胞接种浓度。由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,
在进行MTT试验前,对每一种细胞都应测定其贴壁率、倍增时间以及不同接种
细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证适
时终止细胞培养。这样,才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈的线性关系。
2、 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质
会影响试验孔的光吸收值。因此,一般选小于l0%胎牛血清的培养液进行。在呈
色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
3、 设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它试验
步骤保持一样。最后比色时,以空白孔调零。
4、 如果用96孔板,周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因,存在
明显的挥发现象,会误差很大, 所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控制的
比较好, 要不就需要弃取周围两轮孔的数据。
Ps:把实验置于细胞培养这一实验后,检测各位同学所培养细胞的活性。