鸭疫里氏杆菌外膜蛋白研究进展
杜金玲，牟巍，赵亚荣，郭书豪，卢会英
（北京大北农动物医学研究中心，北京100097）
［收稿日期］2010－10－09［文献标识码］A ［文章编号］1002－1280（2011）06－0038－05［中图分类号］
S858．32［摘
要］综述了鸭疫里氏杆菌外膜蛋白的研究进展。鸭疫里氏杆菌病为危害养鸭业最严重的疾病之一。外膜蛋白作为鸭疫里氏杆菌不同血清型的共同免疫原性蛋白，
可同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫，具有异种血清型的免疫交叉保护作用，其与鸭疫里氏杆菌毒力密切相关，且在鸭疫
里氏杆菌诊断及疫苗研制中具有重要的应用价值。
［关键词］鸭疫里氏杆菌病；外膜蛋白；交叉保护；毒力；诊断及疫苗研制
作者简介：杜金玲（1981年－），硕士，主要从事动物传染病疫苗研究。E －mail ：dujinling2006@163．com
Research Progress on OMPs of Riemerella anatipestifer
DU Jin －ling ，MU Wei ，ZHAO Ya －rong ，GUO Shu －hao ，LU Hui －ying
（Veterinary Medicine Research Center of Beijing Da Bei Nong ，Beijing 100097；China ）
Abstract ：The article briefly reviewed the recent research progress of outer membrane proteins of Riemerella anatipestifer．Riemerella anatipestifer disease was one of the worst which did great harm to ducks．As the immunogenic component of Riemerella anatipestifer ，the outer membrane proteins could induce humoral and cell －mediated immunity ，also provided immunologic cross －protection in different serotypes．They played an important role in the virulence of Riemerella anatipestifer ，and had important value in diagnosis and vaccines manufacture for Riemerella anatipestifer ．
Key words ：Riemerella anatipestifer ；outer membrane proteins ；cross －protection ；virulence ；diagnostic and vaccines manufacture
鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella
anatipestifer ，
RA ）引起的一种接触性传染病。多见于1 8周龄雏鸭，尤以2 3周龄雏鸭最易感，死亡率一般在5% 75%，当环境恶劣或混合感染其他疫病时死亡率可达90%以上，耐过鸭生长不良，失去饲养价值。该病广泛分布于世界各养鸭国家和地区，不具有季节性，造成巨大的经济损失，已成
为危害养鸭业最严重的疾病之一
［1－3］
。RA 血清型较多，国际上已报道了21个，程安春等在此基础上
又发现了4个新的血清型［4］
，
我国目前发现存在16个血清型。OMPs （Outer Membrane Proteins ）是RA 的外膜蛋白，具有良好的免疫原性，可同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫，具有异种血清型的免疫
交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原［5］
。
同时，OMPs 与细菌毒力密切相关，在诊断及疫苗研
制中都具有重要的应用价值［6］
，本文就RA OMPs 研究进展进行简要综述，以期为RA 致病机制的研究、新疫苗和诊断试剂的开发提供一些参考。
1RA OMP 结构及其功能
1．1
结构保守性根据GenBank 中已发表的RA 外膜蛋白A （Outer Membrane Protein A ，OMPA ）基
因序列，魏秀丽等［7］
在其高度保守区设计一对特异性引物，分别扩增了8株RA 中国大陆分离株的OMPA 基因并进行序列分析，证实RA OMPA 基因均为由1164个碱基组成的ORF ，编码387个氨基酸组成的蛋白质，起始密码子均为ATG ，终止密码
子均为TAA，其核苷酸序列非常保守，同源性高达88．2% 100%，氨基酸同源性达到88．9% 100%。张炜［8］根据NCBI检索所得的RA ATCC11845株的2个OMPA序列用软件DNA Star 分析后发现，2个OMPA均由1164个碱基组成，其中N端630个碱基完全相同，C端533个碱基存在多处不同，推测这630bp为RA不同血清型的共有序列，并按此序列设计一对引物，用RA1型北京参考株扩增，产物测序结果与预期一致。
同所有革兰氏阴性菌的OMPA结构相似，RA 的OMPA基因也包含1个C－端保守区以及1个可变的N－端，编码外膜蛋白的基因存在于RA标准株和所有血清型参照株中。Bin Huang［9］等完整表达了RA ATCC11845株的OMPA基因，15株台湾RA分离株、8株参考血清型菌株和国外OMPA序列差异度范围为0 10．5%。其原因极有可能是不同血清型OMPA基因C端及阅读框外侧序列差异较大。外膜蛋白只有胞外区才能刺激产生抗体，膜内区序列不必考虑。
与其他细菌有所不同，RA的OMPA具有6个EF－手铐结合域和2个PEST结构域，这些基序（motif）的出现表明它们在外膜蛋白毒力方面有重要作用，而且编码外膜蛋白的基因存在于RA标准株和所有血清型参照株中。尽管各血清型RA之间存在一定的遗传性差异，但这并不影响外膜蛋白的强抗原特性［10］。由于其氨基酸序列较保守，各血清型间差异较小，所以认为外膜蛋白在RA感染的血清学检测中很有意义，而且在亚单位疫苗的研制中也具潜在的应用价值［11］。
1．2毒力外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，占其全部组成的1/2，除在维持外膜结构、保证物质运输等方面具有重要作用，还与细菌毒力密切相关［12－15］。刘燕等［16］首次应用蛋白质组学双向电泳技术，对血清2型RA（RA2）强毒株及其体外传200代（RA200）获得的弱毒菌株的外膜蛋白进行比较蛋白质组学研究。质谱分析发现，RA2及RA200外膜蛋白表达存在差异，差异表达蛋白质点数达到5倍以上的有3个蛋白，其中1个为热休克蛋白Hsp20家族成员，该蛋白质的改变会导致膜结构构象的改变，进一步会导致细菌的某些生物学特性发生改变；另外2个蛋白为转座酶（transposase），转座酶是催化转座因子从染色体原来的位置切离下来插入到染色体新的位置的一种酶，革兰氏阴性菌的转座子与细菌的毒力密切相关，强、弱毒株转座酶表达量差异可能与二者毒力变化密切相关。
GXRA01（RA血清1型）和GXRA07（RA血清2型）株菌毒力存在差异，前者的致病性高于后者。潘艳等［17］应用双向电泳和质谱技术对上述2株菌体蛋白进行比较蛋白质组学研究，分析2株RA菌体蛋白表达特点，结果经质谱分析鉴定出17个蛋白点中有7个为OMPA，推测这些差异表达蛋白与血清分型及毒力的不同密切相关。
1．3免疫原性外膜蛋白在革兰氏阴性菌引起易感动物发病的过程中起着重要的作用。很多细菌的外膜蛋白具有免疫原性且能诱导保护性免疫反应已得到证实［18－21］。RA OMPA基因结构的保守性同样促使人们以极大的兴趣研究其免疫学功能，以期解决RA交叉保护的问题，为进一步筛选治疗药物提供新的平台［22－23］。
通过提取RA的OMPA、Western Blot检测，结果发现外膜蛋白与免疫鸭血清和自然感染后康复鸭血清出现较强的阳性反应，而与感染发病的濒死鸭血清反应较弱，表明外膜蛋白可能是RA的免疫原性蛋白之一。经甲醛灭活RA1外膜蛋白的菌苗能很好地抵抗同源菌的攻击，100ħ处理1h或用胰蛋白酶处理后完全丧失免疫原性，经脂酶处理后丧失部分免疫原性，证明了外膜蛋白对于抵抗RA感染有一定的保护作用，是RA的主要免疫原［24－25］。用超速离心法提取5种血清型的RA外膜蛋白，采用SDS－PAGE技术对其电泳图谱进行比较分析，并采用免疫印迹技术对其免疫原性及是否存在交叉免疫原性进行初步研究，结果表明其外膜蛋白的电泳图谱具有一定相似性，对主要外膜蛋白条带的组成进行分析后可将这5种血清型的RA外膜蛋白分为3个外膜蛋白型，同时也表明不同血清型的菌株之间存在相同的外膜蛋白型。使用抗RA外膜蛋白阳性鸭血清、抗RA阳性鸭血清和抗RA阳性鸡血清对RA外膜蛋白抗原进行免疫印迹检测，表明5种血清型的RA外膜蛋白均有免疫原性［26］。刘燕等分析了1型、2型、10型与11型四种血清型RA外膜蛋白的电泳图谱，发现相同血清型的电泳图谱相似，不同血清型的电泳图谱差异较大。RA 外膜蛋白抗原在不同血清型菌株暴露的程度有所不同，只有位于外膜外部的表位，才可能在细菌体内生长，并刺激机体产生相应的免疫反应或保护性抗体，所以1型、2型、10型与型RA外膜蛋白与
