榆紫叶甲Ambrostomaquadrii_省略_咽下神经节GABA阳性神经元分
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[收稿日期] 2006207220[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(30470546).[作者简介] 暴学祥(1953—),男,教授,博士研究生导师,主要从事昆虫脑神经生物学研究.
[文章编号]100021832(2007)0420110207榆紫叶甲Ambrostomaquadriim2pressum
脑及咽下神经节GABA阳性神经元分布模式的构建
暴学祥,王 彬,白效耘(东北师范大学生命科学学院,吉林长春130024)
[摘 要] 采用树脂石蜡(CP)组织包埋切片技术,结合免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)双染法,初步构建了榆紫叶甲脑及咽下神经节GABA阳性神经元的分布模式.结果显示,榆紫叶甲脑结构比较特殊:视叶不发达,但具内髓板;嗅叶不发达;蕈形体冠高度退化,而根叶相对发达;中央复合体结构明显;后脑经由围咽神经束与咽下神经结相连,咽下神经结非常发达.榆紫叶甲的所有髓区几乎都有GABA免疫阳性纤维分布.一侧脑半球及咽下神经节共存在约2800个GABA阳性神经元,分布广泛,且趋向于集群分布.该研究表明榆紫叶甲的脑结构及GABA阳性神经元的分布模式与榆紫叶甲的生活习性、进化地位等密切相关.
[关键词] 榆紫叶甲;脑;咽下神经节;GABA;免疫组织化学[中图分类号] Q189,Q421 [学科代码] 180・4725 [文献标识码] A
免疫组织化学及生理学研究表明,GABA是一种重要的抑制性神经递质,在昆虫中央神经系统中具有抑制作用[1].有关GABA免疫组织化学反应模式在蟋蟀Achetadomesticus[2]、果蝇Drosophilamelanogaster[3]、蟑螂Periplanetaamericana[4]、烟草蛾Manducasexta[5]、蜜蜂Apismellifera[627]、日本弓背蚁Camponotusjaponicus[8]、异色瓢虫Harmoniaaxyridis[9]等昆虫脑内已得到相关报道.鞘翅目为昆虫纲中最大的一目,与人类关系密切,其种类繁多、生活方式多样、行为复杂.但目前人们对该目昆虫中央神经系统的结构和功能了解不多,有关其神经递质的免疫组织化学研究也很少见.榆紫叶甲Ambrostomaquadriim2pressum属鞘翅目(Coleoptera),叶甲科(Coccinellidae),Ambrostoma属.成虫体长1014～1110mm,近椭圆形.它主要取食榆树芽苞、叶片,是危害榆树等树种的主要害虫之一[10],分布广泛,材料易得.
我们采用CP组织包埋切片技术[11]对其全脑进行连续切片观察,并通过GABA抗血清免疫组织化学染色[12],对其全脑和咽下神经节GABA阳
性神经元的分布进行了系统研究,旨在进一步探讨昆虫脑结构的多样性,加深了解GABA在昆虫中央神经系统信息传递过程中的调节作用,为神经科学的基础理论研究积累资料.
1 材料和方法1.1 标本的制备(1)取榆紫叶甲40只(捕捉于长春市东北师
范大学校园内),用刀片迅速切下头部,置于4%
多聚甲醛(0.1mol/LPB)中室温固定3h;(2)用PBS(0.1mol/L,pH7.4)充分洗净,酒精系列脱
第39卷第4期东北师大学报(自然科学版)Vol.39No.4
2007年12月JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)December2007水;(3)叔丁醇透明;(4)CP包埋剂包埋;(5)手摇切片机连续切片(片厚6μm);(6)将切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,晾干备用.1.2 免疫组织化学染色(1)切片复水后入PBS(0.1mol/L,pH7.4).(2)过氧化酶阻断溶液(试剂A)室温孵育10min.(3)非免疫性动物血清(试剂B)室温孵育5min.(4)1∶3000兔抗GABA(Sigma公司)4℃过夜.(5)次日,利用生物素标记的第二抗体(试剂C)室温孵育10min.(6)链亲和素2过氧化物酶溶液(试剂D)室温孵育10min.(7)DAB/H2O2显色5～10min.以上除(2),(3)步PBS洗5min外,其他各步间PBS洗3次(5min/次).(8)苏木精复染、脱水、透明、中性树胶封片.(9)OLYMPUS显微镜观察摄影.1.3 对照实验PBS代替兔抗GABA同步进行上述免疫组织化学染色过程,结果为阴性.2 结果榆紫叶甲为前口式(prognathous)昆虫,其头内部结构相对比较特殊,脑的体积比较小,约占头部大小的1/45,颅腔的大部分由发达的肌肉系统填充.脑由视叶(opticlobe,OL)、前脑叶(proto2cerebrum,Pro)、中脑(deutocerebrum,Deu)和后脑(tritocerebrum,Tri)构成,各脑区之间由多条神经纤维通路连接;咽下神经节(suboesophagealgan2glion,SOG)非常发达.我们从额切方向(horizontalsections)对其GABA阳性神经元的分布进行了详细观察,结果显示,各脑区均分布有GABA免疫阳性反应纤维,约2800个阳性神经元的胞体位于髓区周围.下面根据榆紫叶甲的脑轴方向对其GABA免疫组织化学染色结果进行叙述.2.1 视叶(opticlobe,OL)在额切片中,榆紫叶甲视叶与脑中部构成约30°的锐角,自外向内分别由神经节层(Lamina,La)、外髓(medulla,Me)和内髓复合体(lobulacomplex,LC)三个髓区构成(见图1,图2中A,C).神经节层远离复眼,其外侧以细长的网膜后纤维与复眼相连,可对来自复眼光感受器(pho2toreceptor)的视觉信息进行初步整合,其内侧以外交叉(outerchiasma,Och)与外髓相接.外髓在三个髓区中体积最大、免疫组织化学反应最复杂,存在明显的分层现象,其内侧以内交叉(innerchi2asma,Ich)与内髓复合体相接.内髓复合体由内髓(lobula,Lo)和内髓板(lobulaplate,LP)构成,经由不同神经通路与前脑相连.GABA阳性纤维在髓区出现分层现象是视叶最显著的特征.
La:神经节层;Me:外髓;Lo:内髓;LP:内髓板;Pro:前脑;
MB:蕈形体;Ca:冠;P:柄;aL:α2叶;bL:β2叶;PB:前脑桥;CBU:中央上体;CBL:中央下体;AOTu:前视突;ALA:侧副叶;AL:嗅叶.标尺:100μm.图1 榆紫叶甲的额向切片复合模式图2.1.1 神经节层(lamina,La)神经节层分为细胞体层(cytonlayer,CL)和神经纤维层(nervefiberlayer)(见图2中A).细胞体层主要由单极细胞(monopolarcell)构成,不呈现GABA阳性反应.根据免疫组织化学染色的深浅,神经纤维层从外向内可分为A,B,C三层(见图2中A):A层宽约14.25μm,B层宽约11.15
μm,C层宽约12.08μm.神经节层的A,B,C层由
光感细胞、无长突神经元和单极神经元发出的神经突起交错联系形成.A层和C层为主要阳性反应区,染色较深,而B层几乎为阴性.GABA阳性纤维柱状排列模式非常明显.外交叉呈现弱阳性反应(见图2中A,B).
2.1.2 外髓(medulla,Me)外髓在额状切片中呈肾形,根据其GABA免疫组织化学染色深浅可分为9层(见图2中A):第1层宽约8.31μm,染色较深;第2层宽约24.25μm,染色最浅;第3层最宽,近26.38μm,且染色深;第4层宽约9.47
μm,染色浅;第5层宽约16.53μ
m,染色较
深;第6层宽约14.56
μ
m,阳性神经纤维呈网状交
织;第7,8,9层宽度分别约为8.33
μm,6.13μ
m,8.94
μm,第7,9层染色最深.内交叉同样现出弱阳性反应
(见图2中C).
2.1.3 内髓复合体(lobulacomplex,LC)内髓复合体由内髓(lobula,Lo)和内髓板(lobulaplate,LP)构成,并通过内交叉与外髓相
连,根据免疫组织化学染色深浅可将内髓分为3
层(见图2中A):第1层染色稍浅,宽度约为24.74μm,占整个内髓的1/3;第2层染色较浅,
111第4期暴学祥,等:榆紫叶甲Ambrostomaquadriim2pressum脑及咽下神经节GABA阳性神经元分布模式的构建宽度约为21.35
μ
m;第3层染色相对较深,从前
向后宽度逐渐变窄.内髓板近似于钝角三角形,位于内髓与外髓的后方,并与二者存在交叉纤维.内髓板也表现出较强的GABA免疫反应,但分层现象不明显(见图2中A).2.1.4 视叶GABA阳性细胞体的分布视叶分布约1880个GABA阳性神经元,根据其阳性细胞体定位及神经突走向可分为7群(Ⅰ～Ⅶ),从视叶远端到近端依次为:Ⅰ群约含300个无长突神经元,胞体直径4～6μm,分散于外交叉周围及外髓远端(见图2中B).一部分神经元的轴突投射到神经节层,另一部分神经元的轴突则投向外髓的第1层.Ⅱ群约含60个柱状神经元,胞体直径6～8.5μm,位于外髓远端前方(见图2中B),其轴突穿过外髓一直延伸到内髓,同时在外髓的不同层面又形成许多细小分支.Ⅲ群约含1300个无长突神经元,胞体直径4～6μm,分散于外髓周围及内髓板背方,靠近神经束膜(headcapsule,HC)(见图2中C,D,E).一部分神经元的轴突主要深入到外髓,内髓板后方一部分神经元的轴突则进入内髓板.Ⅳ群约由100个柱状神经元组成,属于传出神经元,胞体直径7～9μm,神经元胞体分布于外髓近端,其轴突投射到外髓(见图2中D,E).Ⅴ群约含40个切向神经元,胞体直径9～14μm,位于外髓近端与前脑之间,其轴突主要侧向进入外髓的近端层面,同时也有分支传入前脑,将外髓和前脑联系起来(见图2中E).Ⅵ群位于内髓和侧前脑之间,大约由70个切向神经元组成(见图2中C,F),胞体直径8～12μm,其轴突聚集成束,上行入前脑;本组神经元还有一部分粗大的分支深入到内髓近端,使内髓呈现较强的GABA阳性反应.Ⅶ群由10多个形态相似的切向神经元组成,胞体直径15～17μm,并列分布在内髓复合体与前脑冠之间,染色极深(见图2中C,F).其神经元胞体发出轴突到内髓.2.2 前脑叶(protocerebrum,Pro)前脑位于两视叶之间,分为两个脑半球,前脑的各髓区均有不同程度的GABA免疫组织化学染色.蕈形体的冠高度退化,中央复合体结构明显.前视突(anterioroptictubercle,AOTu)和侧副叶(lateralaccessorylobe,LAL)均为椭球形髓质区,与其他前脑结构之间有明显的界限.2.2.1 蕈形体(mushroombody,MB)蕈形体是榆紫叶甲脑中较明显的神经纤维结构,成对分布于前脑叶、中央复合体前方两侧(见图1).前脑背方成群分布有数千个胞体直径为4～6μm的肯氏细胞(Kenyoncell,Kc),肯氏细胞又名球体细胞(globulecell)(见图2中G,H).肯氏细胞的树突与其他脑区一些投射神经元的轴突末梢在冠区仅构成一个小球形的神经纤维网,但未形成杯状或帽状的冠(calyces,Ca),不具有唇、领和基环的分化,即榆紫叶甲蕈形体的冠高度退化(见图2中G).肯氏细胞的轴突经由前脑背方向腹方投射,形成蕈形体的柄(pedunculus,P).在柄末端,根发生分枝形成向前方(额方)伸展的α2叶(α2lobes,aL)和向脑中部延伸的β2叶(β2lobes,
