生物技术综合大实验https://www.doczj.com/doc/f819227235.html,work Information Technology Company.2020YEAR
2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。
GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。
北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣
地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。
下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
2.实验器材
2.1实验材料：
含GFP融合质粒，Top10菌株
2.2实验试剂：
质粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mM EDTA /25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2M NaOH/1% SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer；
转化：0.1M预冷 CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；
GFP提取：液氮，Lysis Buffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；
疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；
离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，
Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）)
Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0) SDS-PAGE电泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等
2.3实验仪器
高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。
3.实验方法
3.1质粒提取
1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；
2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；
3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；
4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；
5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中；
6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心8min，弃上清；
7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；
8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；
9.加40μL TE Buffer溶解DNA，4℃备用。
3.2感受态细胞的制备以及转化
1.取1.5mL Top10菌液，在4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；
2.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min 后4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；
3.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；
4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；
5.42℃热激90s；
6.立即放在冰上3-5min；
7.加入800μL LB液体培养基，37℃ 150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）；
8.取200μL菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。
3.3扩大培养
1.取含GFP质粒的Top10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；
2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL的LB液体培养基，
100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37℃，200rpm振荡培养至对数生长期（约3-4h）；
3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mL LB液中（Amp工作浓度 100ng/ml，阿拉伯糖工作浓度2mg/ml），37℃，200rpm培养过夜。
3.4细胞破碎
1.将培养好的细菌3000g离心10min，紫外灯观察弃上清，沉淀用液氮冻融；
2.用30mL Lysis Buffer(50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)悬浮沉淀；
3.向悬浮液中加15mg溶菌酶，混匀后室温溶解10min；
4.400W功率下，超声处理10min；
5.将破碎液9000g离心15min，紫外灯观察，留上清备用；
6.选取合适的浓度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP；一般(NH4)2SO4饱和度为30%时，杂蛋白的沉淀量最大，饱和度达到70%时GFP沉淀量达最大附：(NH4)2SO4浓度与含量表，体积为10ml；
7.向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室温放置20min，9000rpm离心15min，转移上清至另一试管中，再加入
6.88g(NH4)2SO4，充分混匀，室温放置至少20min，9000rpm离心15min，弃上清，留沉淀备用；
3.5疏水作用层析
1.将沉淀的GFP，用10mL 2M (NH4)2SO4/Lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，离心10min，留上清；（2号样品）
2.用3倍体积平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；
3.将步骤1中的上清液上柱，用3倍柱体积的Washing Buffer （1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；
4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外灯检查，GFP快流出时，准备收集；
5.将收集液透析过夜。（3号样品）
3.6离子交换层析
1.将透析后所得的透析液9000rpm离心10min，弃去沉淀（4）；
2.用3倍体积的Start Buffer(A液)平衡柱子；
3.将步骤1中所得的上清液上柱，再用3倍柱体积的Start Buffer洗柱子；
4.梯度洗脱GFP，梯度液：Start Buffer(A液)、Elution Buffer(B 液)，紫外灯观察，GFP快流出来时，准备收集
5.将收集液透析过夜(透析液为A 液)。 3.7凝胶过滤纯化GFP
1.将透析袋置入含PEG 10000的培养皿中，浓缩至体积约2mL ；
2.用3倍柱体积的20mM Tris-HCl ，pH 7.0平衡柱子；
3.将步骤1中所得的GFP 上柱，用20mM Tris-HCl ，pH 7.0洗柱子，紫外灯检测，GFP 快流出时收集备用。 3.8 SDS —PAGE
将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer ，煮沸裂解5min ，冰浴2min ，12,000rpm 离心10min ，取上清-20℃保存备用。
1.按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。
2.分离胶的制备 按下列成分配制分离胶：
各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为浓缩胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层20%乙醇封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的乙醇，用滤纸吸干凝胶顶端的乙醇。 3.浓缩胶的制备
ddH2O
30%丙烯酰胺混合液 1.5M Tris(pH8.8) 10%SDS
10%过硫酸铵 TEMED
8.2 mL 6.68mL 5.0mL 0.1 mL 0.1 mL 0.04 mL
按下列成分配制2mL 5%的积层胶：
ddH2O
30%丙烯酰胺混合液1.0M Tris(pH6.8) 10%SDS
10%过硫酸铵TEMED 7.35mL 1.3mL 1.25mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL
各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。
4.待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。
5.将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20μL各样品。
6.样品在浓缩胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。
7.卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液（50%甲醇，0.05%考马斯亮蓝，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平摇床上室温染色45min，之后取出凝胶并回收染色液，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液（与染色液同，只是无考马斯亮蓝）中，在水平摇床上脱色1h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察结果并拍照。（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离胶进行SDS-PAGE。）
思考题
1.实验纯化效果如何？如果要得到较纯的GFP，你会采用哪些方法进一步纯化？
答：实验纯化效果请见实验结果分析。
2.SDS-PAGE的样品缓冲液中有哪些成分它们有什么作用为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸
答：SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有SDS，甘油，溴酚蓝和β-巯基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白质变形，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；β-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。
3.常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么？
答：交联葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交联葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水2.5g。
4.离子交换层析后，交换剂用什么方法再生后可以继续使用？
答：
5.简述疏水层析的原理和主要步骤。
答：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其他方法不易纯化的蛋白质。主要步骤有：首先用高盐溶液平衡柱子，使柱子暴露出疏水基团，然后在蛋白质过柱子后，最后换用低浓度盐溶液洗脱。
《生物技术综合实验》 一、实验课名称：生物技术综合实验 Experiment of Biotechnology 二、实验课性质：独立设课，专业主干必修课 三、适用专业：生物技术 四、采用教材及参考书 1．贾士儒主编．生物工艺与工程实验技术（第一版）．北京：中国轻工业出版社，2002.9 2．魏群主编．生物工程技术实验指导（第一版），北京：高等教育出版社，2002.9 3．陈坚等主编．发酵工程实验技术（第一版），北京：化学工业出版社，2003.5 五、学时学分：课程总学时：72；课程总学分：2；实验课总学时：72 六、实验项目名称和学时分配 七、实验教学的目的和要求 本门课程的学习目的是让学生能够掌握和综合运用各种生物技术实验技能，并提高学生的综合动手能力和实验素质。要求学生通过实验能够理解实验原理及实验方案，掌握正确操作规程；掌握仪器的使用，了解其性能参数、适应范围及注意事项，各种参数的测定方法；掌握生物技术领域常用参数的测定方法。 八、实验项目的内容和要求 实验一：α-淀粉酶产生菌的分离及验证 内容：（1）土壤采样及材料预处理；（2）培养基的配制、倒平皿、稀释涂布、培养；（3）透明圈的辨认与α-淀粉酶产生菌的分离纯化；（4）摇瓶培养与淀粉酶活性的测定。 要求：本实验为综合性实验，要求学生掌握从土壤中分离微生物的方法，理解
以淀粉为惟一碳源进行分离淀粉酶产生菌的原理，掌握透明圈辨认方法，掌握淀粉酶活性的测定方法。 应配备的主要设备名称和台件数 实验二：呼吸缺陷型菌种的选育与确证 内容：（1）酵母菌种的诱变处理及诱变后菌种的液体培养；（2）CM培养基的配制及稀释涂布；（3）TTC下层培养基的配制及点种；（4）TTC上层培养基的配制与呼吸缺陷型菌落的观察；（5）甘油培养基的配制与呼吸缺陷型酵母的验证。 要求：通过本实验要求学生掌握诱变育种的方法，理解诱变育种的原理，掌握变色圈法分离菌种的方法。 应配备的主要设备名称和台件数 实验三：谷氨酸发酵及提取工艺 内容：（1）谷氨酸菌种的制备；（2）噬菌体的检测（选开）；（3）大肠杆菌（谷氨酸脱羧酶）酶粉的制备（选开）；（4）发酵过程中还原糖的测定；（5）发酵过程中谷氨酸含量的测定；（6）发酵罐的构造及空消；（7）谷氨酸中糖一次发酵及控制；（8）谷氨酸高糖一次发酵及控制（选开）；（9）谷氨酸发酵液黏度的检测及菌体浓度的检测；（10）谷氨酸的离子交换回收（选开）；（11）谷氨酸的等电回收及精制；（12）谷氨酸钠质量控制及分析；（13）离子喷雾干燥使用及发酵液的无害化处理要求：通过本实验使学生对微生物的无菌操作、生化分离技术、发酵工程的原理、生物工程设备的应用及生物工艺学所学的知识进行了全面的回顾，因此可以培养学生的综合技能。 （1）要求学生通过本实验了解发酵工业菌种的制备工艺和质量控制； （2）掌握发酵罐的空消、实消原理和方法，能正确的操作发酵罐； （3）掌握生物工程工业中物质的分离、提取、精制工艺；掌握还原糖、噬菌体
生物技术综合实验报告（第一部分） 实验一工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌 一、实验目的 掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。 二、原理 培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。 湿热条件(121℃的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液 和培养基中的微生物达到灭菌的目的。 三、器具和试剂 灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。 琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮。 四、实验内容 PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备 （一）培养基的配制步骤 1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。 2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。 3、用NaOH或者稀HCL调剂酸碱值。 4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。 5、高压灭菌（121℃,15min-20min)。 6、冷却，取出，备用。 （二）棉花无菌苗培养基的制备 1、取25 ml MS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH 值为6.0，加入7.5g/l 琼脂煮沸。 2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。 3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。 4、灭菌后臵于水平的工作台上冷却即可。 要求：配制1L （三）拟南芥无菌苗培养基的制备 1、拟南芥无菌苗培养基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g琼 脂高温高压灭菌。 2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121° 高压灭菌15分钟。 3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。 要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。 五、注意事项 1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量 来配制工作液、母液及培养基。 2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。 3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。
生命的基本特征：①细胞是生物的基本组成单位（病毒除外）②新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能③生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质④生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性 生物学经历的三个阶段：描述生物学阶段、实验~、创造~ 生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的 生物技术发展三个阶段：作坊式生物技术、工业化~、现代~ 生物技术内容：基因工程技术、细胞~、酶~、发酵~、蛋白质~ 细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术 蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。蛋白质工程也成为“第二代基因工程” 生物技术基本特征：①高效益②高智力③高投入④高竞争⑤高风险⑥高势能 透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度 实验室常用水的制备：①利息交换法②蒸馏法③反浸法④超纯法 消毒灭菌方法：①高压高温灭菌②干热灭菌③滤膜灭菌④化学消毒法⑤紫外线灭菌⑥抗生素灭菌消毒 核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列 二级结构：双螺旋结构 三级结构：超螺旋结构 DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程 增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升 DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象 减色效应：DNA复性时，OD260值下降 影响复性速度的因素：①溶液温度的高低②单链片段的大小③单链片段浓度④溶液离子强度的大小⑤片段内重复序列的多少 OD260的应用：OD260=1.0 相当于①50ug/ml 双链DNA ②40ug/ml 单链DNA或RNA③20 ug/ml 寡核苷酸 基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达 阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列 基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区 三个关键因素：①自由复制的DNA序列②着丝粒DNA序列③端粒DNA序列 原核生物和真核生物染色体的区别：①原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始②真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。这些蛋白具有功能或结构方面的作用。染色体DNA的数量远比原核生物多。每条染色体有多个复制起点 分离纯化核酸的总原则：①保证核酸的一级结构完整性②防止核酸的生物降解③排除其他分子的污染 真核细胞DNA制备实验基本原理：要从组织中提取DNA就必须先将组织分散成单个细胞，
生物科学专业应用综合大实验的设计与实践 一、实验目的 本综合大实验的目的是通过设计和实践一系列生物科学实验，提高学生的实验设计和 实践能力，培养他们的科学精神和创新思维。 二、实验内容 1.细胞培养实验：学生需设计并实践如何培养细胞，包括准备培养基、细胞传代复苏、细胞的处理和传代等。 2.基因工程实验：学生需设计并实践如何使用基因工程技术，包括DNA的提取、酶切、连接、转化和筛选等。 3.蛋白质表达实验：学生需设计并实践如何表达蛋白质，包括构建表达载体、转染细胞、蛋白质提取和分析等。 4.酶活性测定实验：学生需设计并实践如何测定酶的活性，包括选择合适的底物和试剂、确定最佳反应条件和测定方法等。 5.分子生物学实验：学生需设计并实践如何进行分子生物学实验，包括PCR、DNA测序、RT-PCR等。 6.生物材料制备实验：学生需设计并实践如何制备生物材料，包括纳米颗粒、薄膜、 丝素蛋白等。 三、实验步骤 1.学生根据实验目的和内容，设计实验方案，并制定实验步骤。 2.学生准备实验所需材料和试剂，并对仪器设备进行检查和准备。 3.学生按照实验方案进行实验操作，记录实验数据和结果。 4.学生对实验结果进行分析和统计，并撰写实验报告。 5.学生进行实验结果的讨论和解释，并提出实验中的问题和改进方案。 四、实验评价 本综合大实验的评价主要包括以下几个方面： 1.实验设计的合理性和创新性。
2.实验操作的准确性和规范性。 3.实验数据的可靠性和完整性。 4.实验结果的分析和解释的科学性和合理性。 5.实验报告的格式和内容的规范性和清晰性。 五、实验总结 通过本综合大实验的设计与实践，学生能够提高实验设计和实践能力，培养科学精神和创新思维，为以后从事生物科学相关工作打下坚实的基础。通过实验的反思和总结，学生能够对生物科学的理论知识有更加深刻的理解，并且能够将所学知识应用到实际生活中。
生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <
生物技术大实验陆挺王大慧汪成富 苏州大学生命科学学院 二零零七年六月
前言 脂类被广泛地定义为能溶于有机溶剂的一类生物分子【1】。甘油脂类是指主链中含有甘油的脂类。主要的甘油脂类包括三酰基甘油和各种磷脂。由脂肪酸和甘油组成的三酰基甘油可在动物的脂肪组织，植物种子或果实中大量储藏。脂肪酸是三酰基甘油的主要成分，其作为能量被储存在三酰基甘油中。虽然在肝脏和肠内也发现三酰基甘油，但是发现它们主要存在脂肪组织中。 磷酸甘油酯(简称磷脂)，是另一种含有磷酸基的甘油脂类。这类脂类的共同特点是它们都是具有亲水性和疏水性的兼性分子，水解以后都产生磷酸和脂肪酸。可见，脂肪酸也是磷脂的主要成分。在真核和原核细胞的生物膜（包括细胞膜，细胞器膜）中，磷脂是主要的结构脂类。磷脂双层可构成两相界面，是各种分子的通透性屏障。磷脂组成的变化对细胞膜的流动性，膜蛋白的活性等细胞生理功能由重要的调节的作用。【2】 溶血磷脂是一类重要的磷脂。其中，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid ,LPA）是目前已知的结构最简单的甘油磷脂。它的系统命名为1或2－脂酰－甘油－3－磷酸（1 or 2-acyl sn-glycerol-3-phosphate）。 溶血磷脂酸在体内的信号转导途径中起着重要的作用，被称为多功能“磷脂信使”。通过活化特定的G蛋白受体，LPA调控着多种细胞反应，如有丝分裂的发生、细胞粘附、细胞骨架重排、离子转运、细胞分化、平滑肌收缩以及细胞调亡等等【3】。LPA存在于多种生物体体液中，如血清、血浆、眼球的水状体等。多种类型的细胞均可产生LPA，并通过自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外影响靶细胞的功能。机体可由如下途径释放LPA：1）血小板在凝血酶刺激激活后可迅速产生和释放LPA；2）哺乳类的成纤维细胞在肽类生长因子刺激下可迅速产生LPA并释放到细胞外间质；3）人的脂肪细胞可产生LPA，并刺激前脂肪细胞的增殖[4]；4）在卵巢癌患者的腹水及血浆中可检测到增高的LPA[5]，其来源尚不清楚，但有可能是肿瘤细胞产生的；5）某些炎症细胞、内皮细胞、神经细胞及受损的细胞也可产生LPA[6] 多方面研究表明，LPA的产生同多种病生理状态密切相关。LPA是促使肿瘤细胞生长和浸润的一个强有力的因子[7，8]，它在包括癌症、肥胖以及动脉硬化等疾病中起着重要的作用，近年来，越来越多的证据显示LPA与人卵巢癌及其他人恶性肿瘤的病理生理学关系密切[9，10]。当前，LPA已经被用作卵巢癌检测的一个重要的分子指标[10，11]。
生物技术制药实验报告 人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的 表达与纯化 生物与制药工程学院 罗飞 2016年7月2日
目录 第一节引言 (4) 1.1表皮生长因子(EGF)概述 (4) 1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 (4) 1.3 EGF的生物学效应及应用 (5) 1.4 本实验课程设计的目的与内容 (6) 第二节EGF基因的合成与转化表达 (7) 2.1.实验原理 (7) 2.2实验材料与方法 (8) 2.2.1 试剂材料及试剂 (8) 2.2.2 仪器设备 (8) 2.3 实验方法 (9) 2.3.1 试剂及培养基配制方法 (9) 第三节、实验前的准备 (9) 3.1目的基因hEGF的设计与合成 (9) 3.2载体选择 (11) 3.2.1载体选择主要考虑下述3点： (11) 3.3酶切位点设计 (12) 3.3.1载体的结构 (12) 3.2.2酶切位点设计注意以下 (13) 3.2.3 酶切位点的确定 (13) 3.3 引物设计 (14) 3.3.1 PCR引物设计的基本原则 (14) 3.3.2 引物设计 (15) 第四节、实验篇 (16) 4.1整体实验过程 (16) 4.1.1实验整体流程： (16) 4.1.2 简化后的并行流程 (16) 4.2、小组结果展示 (17) 4.2.1大肠杆菌转化实验结果 (17) 4.2.2 XL10质粒电泳结果显示 (18) 4.2.3 单酶切实验结果显示 (18) 4.2.4 PCR结果显示 (19) 4.2.5 SDS-page 电泳结果展示 (20) 4.3、个人负责实验模块 (20) 4.3.1 提取重组质粒 (20)
2013-2014学年生命科学综合大实验 。 GFP分离与纯化 >
1.文献综述 $ 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu
Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger （钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。 * ~
生物技术综合实验教学设计 引言 生物技术是21世纪最具应用前景的新兴科技之一，它广泛应用于 医药、食品、农业、环境等领域。为了培养生物技术领域的专业人才，高校生物类专业开设了相关的课程，其中实验教学是非常重要的一环。本文主要介绍了一种生物技术综合实验教学设计，旨在提高学生的实 际操作能力和综合素质，培养其生物技术相关的应用能力。 实验目的 1.掌握基本的实验操作技能及常用实验仪器的使用方法； 2.学会运用生物技术的基本原理进行实验； 3.加深对生物技术相关知识的理解，并进一步培养创新能力 和科学素养； 4.培养学生良好的团队协作精神和实践能力。 实验内容及方法 1.实验主题：酶解法制备小分子多肽 2.实验内容： •酶解鸡蛋白制备小分子多肽 •净化小分子多肽 •鉴定小分子多肽的合成情况 3.实验方法：
•酶解鸡蛋白方法：鸡蛋白加入水后均匀混合，加入适量酶液，在37℃恒温恒湿下培养一定时间。 •净化小分子多肽方法：将酶解后的鸡蛋白液使用柱层析法进行分离，收集目标组分并洗脱。 •鉴定小分子多肽的合成情况方法：运用紫外分光光度计测量目标组分的吸光度和A280/A260比值，并进行SDS-PAGE电泳。 实验步骤及时间安排 实验步骤时间安 排 第1周 确定实验方案、组织实验分组，并安排实验室场地及实验仪 器设备 第2周 熟悉实验步骤、安全注意事项和实验记录方法、了解小分子 多肽的相关知识 进行酶解反应，收集取样；制备半制备柱层析，净化溶液并 第3周 进行样品收集 第4周 继续进行净化并确定目标组分；进行SDS-PAGE电泳实验，分 析结果，制备文章 实验总结及实验报告撰写（包括实验过程、数据处理及结果 第5周 分析） 实验材料及仪器 1.鸡蛋白、纤维素柱、氢氧化钠、乙酸钠等； 2.紫外分光光度计、SDS-PAGE电泳仪等。
生物科学专业应用综合大实验的设计与实践 生物科学专业的综合大实验是指将所学的生物科学理论知识与实践技能在一个较长时 间范围内进行整合，通过自主设计实验方案并完成实验的全部过程，最终得到科学数据并 进行分析和总结。本文将探讨生物科学专业综合大实验的设计与实践。 一、确定实验的目的和研究内容 在进行综合大实验之前，首先要明确实验的目的和研究内容。目的可以是深入了解某 一特定生物学现象的机制，或者通过实验验证一个假设。研究内容可以从生物组织、生理、生态、遗传等方面选择。确定实验的目的和研究内容是整个实验设计的起点，也是实验成 功进行的关键。 二、设计实验方案 在确定实验的目的和研究内容之后，要开始设计实验方案。实验方案包括实验的基本 步骤、实验的材料和设备、实验所用的方法和实验的预期结果等。这些都需要根据实验的 目的和研究内容来确定。还要考虑实验过程中可能遇到的问题，并制定相应的对策。 三、准备实验所需的材料和设备 在设计实验方案之后，要开始准备实验所需的材料和设备。这包括实验所需的试剂、 实验所需的动植物材料，以及实验所需的器材设备等。实验所需的材料和设备的准备要提 前进行，并且要确保准备的材料和设备的质量和数量符合实验的需要。 四、实施实验并记录数据 实验方案和实验所需材料和设备准备完毕后，要开始实施实验。根据实验方案的步骤 进行实验，并记录实验数据。实验过程中要注意实验的操作流程和安全规范，确保实验的 数据的真实性和可靠性。 五、数据分析和结果总结 实验完成后，要对所得数据进行分析，并根据实验的目的和研究内容进行结果的总结。数据的分析可以采用统计学方法进行，通过对数据进行比较、计算和图表等方式来得出结论。在结果总结中要提出实验的不足和改进之处，并对实验结果的意义和应用进行讨论。 综合大实验是生物科学专业的重要组成部分，通过实践来提高学生的实验设计和操作 能力，培养学生的科学思维和创新能力。在实验设计和实践过程中，学生需要全面考虑实 验的目的和研究内容，并制定相应的实验方案；学生还需要准备实验所需的材料和设备， 并按照实验方案进行实施，并正确记录实验数据；学生需要对数据进行分析，并对实验结
生物技术综合大实验https://www.doczj.com/doc/f819227235.html,work Information Technology Company.2020YEAR
2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣
地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
生物技术大实验操作指南 注意事项 1、工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。 2、用电、气安全注意事项。 3、节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。 4、实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。 5、实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。 实验一鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取） 一、原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加 一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。 二、试剂与设备：TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit， 氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。 三、步骤： 1、新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆， RT 5-10 Min。 2、加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。 3、4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。 4、加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。 5、加1ml 75%乙醇洗涤沉淀2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干 3-5Min。 6、50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。 7、检测RNA纯度与浓度。 四、结果 五、讨论
实验二溶菌酶基因第一链cDNA合成 一、原理：mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转 录合成cDNA，此cDNA为单链。 二、试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离 心机。 三、步骤： 1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物： 总RNA 或Poly(A)+ RNA或特异性RNA Xμg Oligo dT (0.5μg/μL) (20 pmol) 1μL RNase free ddH2O 定容至12μL 2. 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴30 s，然后 离心3~5 s。 3．将试管冰浴，再加入如下组分： 5×Reaction Buffer 4μL RNase Inhibitor ( 20 U/μL) 1μL dNTP Mix(10 mmol/L) 2μL M-MuLV RT（200 U/μL）1μL 注：若5×Reaction Buffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。 4．轻轻混匀后离心3~5 s。 5．在PCR 仪上按下列条件进行反转录反应cDNA 合成42℃ 30-60 min 6.终止反应95℃ 5 min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20℃保存。 * M-MuLV RT酶最后加。 四、结果 五、讨论
关于生物技术综合实验报告 生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 爱惜细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 能够调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫进程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆进程紧密相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 把握Trizol提取的方式和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解进程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成份的同时维持RNA的完整性。TRIzol 的要紧成份是苯酚。苯酚的要紧作用是裂解细胞，使细胞中
的蛋白，核酸物质解聚取得释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉能够抑制RNase，与氯仿联合利用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，致使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的要紧作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方式取得的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处置留宿后高压灭菌； ②Trizol试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75％乙醇； ⑤TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液
实验一牛乳卫生质量的检测 实验目的： 1．学习美蓝还原酶实验对牛乳质量评估的原理和方法 2．学习巴氏消毒法的原理及方法 3．学习利用牛乳中细菌菌落总数判断牛乳是否被污染的指标 实验内容： 1.美蓝还原酶实验评估牛乳质量 2.检测巴氏消毒法消毒牛乳的效果 3. 稀释平板计数法测定牛乳含细菌总数 实验仪器设备和材料： 材料：鲜牛奶；纯牛奶；牛肉膏蛋白胨培养基 试剂：美蓝溶液（1:250 000）；无菌水；蒸馏水等； 仪器和用具：试管，试管架，三角瓶，5mL移液枪及枪头，1mL移液枪及枪头，培养平板，高温蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微波炉，显微镜，载玻片，标记笔等。 实验要求： 1.掌握根据美蓝还原酶实验的结果评估牛乳质量； 2.熟悉巴氏消毒法的原理及方法 3．掌握利用牛乳中细菌菌落总数判断牛乳是否被污染的指标 实验方法与步骤： 1 牛肉膏蛋白胨培养基和无菌水的制备与灭菌 制备牛肉膏蛋白胨培养基400mL，分装在两个三角瓶中；取9支试管，每支试管加9mL蒸馏水。将牛肉膏蛋白胨培养基与装有蒸馏水的试管及21个平板一起灭菌，121℃维持20min。牛肉膏蛋白胨培养基的配方（每1000mL）为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂4.4g，水1000mL，pH=7.0~7.2。 2 美蓝还原酶实验法测定牛乳质量 （1）取三支无菌试管，标记为1号、2号和3号，1号试管加入10mL亚奥特鲜牛奶，2号、3号试管分别加入10mL亚奥特纯牛奶，1号、2号试管分别加入1mL美蓝溶液，分别加棉塞塞紧。 （2）轻轻摇动试管，置于37℃水浴锅中温浴，记录开始时间； （3）试管在水浴锅中稳定5min后取出，轻轻摇动后再放回水浴锅； （4）每隔30min取出试管观察美蓝与牛乳混合液颜色变化，直至3-6h，记录试管中牛乳4/5
《生物技术大实验》课程教学大纲 课程编号：0803013 课程总学时/学分：54/3（其中理论0学时，实验54学时） 课程类别：专业限选课 一、本课程的目的、任务 生物技术大实验是一门综合实验课程，包括了细胞工程、基因工程、微生物发酵工程和酶工程技术等，覆盖生物技术大部分研究领域，使学生得到生物技术实验操作的全过程、全方位训练，以提高学生的学习兴趣、动手能力和工作的责任心。实验内容同时将过去简单的验证性实验转变为综合性、设计性实验，旨在实验中提高学生实验设计能力、分析问题、解决问题的能力以及实验数据的处理能力，从而培养和提高学生的实践能力和创新能力。为以后进一步从事与生物技术相关的工作或继续深造打下扎实的基础。 二、教学基本要求 本课程为一系统性、综合性实验，实验主要从组织到细胞，再到DNA分子进行较为系统的分析研究。通过本实验的训练，要求学生熟练掌握细胞培养技术，基因工程菌的培养及质粒的提取鉴定方法；初步掌握基因组DNA的提取、DNA 体外扩增技术；工程菌的发酵调控及啤酒的酿造技术，本实验要求在教师的指导下，充分发挥学生的主动性和创造性，锻炼学生的实践动手能力和创新精神。三、教学内容及学时分配 [实验一] 植物基因的克隆 [实验要求] 基因工程技术已成为生物学领域许多实验室的常用技术，它的先进性和普及性使人们感到有必要在大学的教学课程中得到反映。基因工程的实际技术和实验系统正在不断的创新，新方法、新技术不断推出，而在有限的学时内，所能触及的技术只是基因工程中极少的一部分，不可能面面俱到。本实验主要学习理解提取基因组DNA的原理，掌握植物基因组DNA的提取及检测方法；掌握基
生物技术综合试验 目的：主要是通过本课程的学习，使学生受到严格的基因工程和分子生物学等技术实验技能的训练，熟悉现代生物技术仪器的基本操作使用和应用范围，加深对生物技术系列相关课程基本理论、基本技术原理的理解认识。 实验一、质粒DNA的小量提取 实验二、双酶切反应 实验三、PET28-a质粒载体的胶回收 实验四、引物设计 实验五、目的片段的PCR扩增 实验六、PCR产物的双酶切反应 实验七、PCR产物的胶回收 实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反应实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备 实验十、重组质粒转化感受态细胞的实验 实验十一、菌落PCR反应 实验十二、IPTG诱导OMP31和BLS融合基因的表达 实验十三、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验一、质粒DNA的小量提取 一、目的要求 1、掌握用试剂盒提取质粒DNA的技术 2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法 二、基本原理 在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、仪器、材料和试剂 1.仪器：微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台 式高速离心机、分光光度计 2.材料：含有质粒的大肠杆菌DH5a 3.试剂及溶液：LB培养基、葡萄糖 质粒小提试剂盒 操作步骤 1．质粒DNA的提取 1）培养细菌：将带有质粒的单菌落，接种到LB液体培养基中，37o C，200r/min,过夜震荡培养； 2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 3）取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干； 4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1（确保已加入RNaseA），用枪头混匀； 5）向离心管中加入250μl溶液P2，温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 6）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。 7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）尽量不要吸出沉淀。12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附