蛙类离体心脏灌流
一、【目的要求】
1学习离体蛙心灌流法。
2、观察Na + ,K+,Ca2+及肾上腺素（Adr）,乙酰胆碱（ACh）,乳酸对离体心脏活动的影响。
二、【原理】
将离体蛙心（失去神经支配的蛙心）保持在适宜的环境中，在一定的时间内仍然能够保
持节律性收缩，心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体
心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，可以通过改变灌流液的某些成分，观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性，都与钠、钾及钙等离子有关。外源性给予去甲肾上腺素或乙酰胆碱可产生类似心交感神经或迷走神经兴奋时对心脏的作用。
三、【实验仪器】
青蛙、常用手术器械、蛙板（或蜡盘）、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿（或小烧杯）、棉线、任氏液。套管夹、0. 65% NaCl、2% CaCl2、1% KCl、1: 10000 肾上腺素、1: 10000 乙酰肌碱、3%乳酸。
四、【方法与步骤】
1、斯氏蛙心插管法
（1）一只青蛙，双毁髓后背位置于蜡盘中，按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围
的大血管（见右图）。在左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎（动物个体小时，结扎位置可
靠上些）。再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量（套管内2〜3 cm高度）任氏液（内加入一滴肝素溶液）的斯氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥（见右图）。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内（于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口）。此时可见套管中血液冲人套管，并使液面随
心脏搏动而亡下移动，表明操作成功（否则需退回并重新插入）。用滴管吸去套管中的血液，
更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧（不得漏液），再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏
的联系，使心脏离体（切勿损伤静脉窦）。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致（1.5〜2 cm），即可进行实验。
（2）将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉（不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液）。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连（如右
图）。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。
2、实验观察
（1）记录正常心搏曲线
（2）改用0. 65% NaCI溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线氏插管装置
出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗 2 —3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌
流液面一致（以下同）。
观察可得，NaCI 溶液会阻遏心脏搏动。
(3) 迅速用新鲜任氏液清洗 2〜3次，待心搏恢复正常。向套管内加入1〜3滴2% CaCI : 溶液，观察
并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常 (如果恢复迟缓，可多次冲洗 )。
⑷同法向套管中加1 — 2滴1% KCl 溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时， 同法更换灌流液，待心搏恢复正常。
(5) 同法记录套管中加入I 〜2滴的肾上腺素溶液(1 : 10 000)后心搏曲线的变化。 (6) 同法记录套管中加入 1 — 2滴乙酰胆碱溶液(1: 10 000)后心搏曲线的变化。 (7)
同法记录套管中加入I 〜2滴的3%乳酸后心搏曲线的变化。
五、【实验结果与原因分析】 曲线的幅度 --------- 收缩的程度 曲线的密度 -------- 心率 曲线的基线 --------- 舒张的程度
1、正常收缩曲线图
于灌注液中缺乏 Ca2+ (),以致心肌细胞动作电位 2期内流Ca2+减少，细胞质 Ca2+浓度减 少，心肌的收缩活动也随之减弱。
3、滴加2%CaCI 溶液
分析：细胞外CsT 在细胞膜上对Na *内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。
[Ca 2+] 0增高时，Na *内流受抑制，细胞 0
期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。
[Ca 2 +
] 0增高使Ca 2*内流增多，因此慢反应细胞 0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细 胞平台期缩短，
有效不应期缩短，复极加速。
Ca 2*内流增多，使心肌收缩能力增强。
[Ca 2* ]
0降低时，所引起的变化与高钙时相反。因此加入
CaCl 2后，心率减少、振幅减少，基线上
移。
4、滴加1%KC I 溶液
0.65%NaCI 溶液灌注蛙心时，由
分析：滴加1 % KCI后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下
降，最后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当细胞K+浓度增高时，K+与Ca2+有
竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进入细胞内Ca2+减少，心肌的兴奋一收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。
5、滴加1: 10000肾上腺素溶液
分析：滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，描记的心搏曲线幅度明显增大。
其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透性，导致肌浆中Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白
与Ca2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加，提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度，刺
激Na+与Ca2+交换，使复极期向细胞外排出Ca2+的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增
快，整个舒张过程明显增强。
6、滴加1: 10000乙酰胆碱溶液
分析：上图可示，蛙心收缩减弱，心率减慢最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为:
乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合，一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性，促使K+外流,
将引起：1）窦房强细胞复极时K+外流增多，最大复极电位绝对值增大；Ik衰减过程减弱，
自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房自律性降低，心率减慢。2）复极过程中K+外流
增加，动作电位2、3期缩短，Ca2+进入细胞内减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制
Ca2+通道，减少Ca2+内流，进而使心肌收缩减弱。
7、滴加3%^酸溶液
2期内流Ca2+减少，细胞质Ca2+
浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。
六、【注意事项】
1. 制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。
2. 上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损，而且必须待心搏恢复正常后方能进行下一步实验。
3. 尽量选用健壮、体大的雄性蟾蜍，手术过程中注意保护心脏，避免损伤。
4. 实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。
