艾滋病的检测方法及进展

有病毒的RNA基因组、逆转录酶、整合酶、蛋白酶，以及
其他来自宿主细胞的成分。
主要特点
1、主要攻击人体的T淋巴细胞系统。 2、一旦侵入机体细胞，病毒将会和细胞整合在一 起终生难以消除。 3、病毒基因变化多样。 4、广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物 、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的 脑组织液，其中以血液、精液、阴道分泌物中 浓度最高。 5、对外界环境的抵抗力较弱，对乙肝病毒有效的 消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效。 6、感染者潜伏期长，死亡率高。 7、艾滋病病毒的基因组比已知任何一种病毒基因 都复杂。
胶体金免疫层析检测
艾滋病检测试纸条是使用胶体金免 疫层析科技研发的新一代检测试剂。 它可检测血清或血浆标本中的HⅣ1/2特有性抗体。所有操作时间共是 15分钟，动作简便、迅速、准确、自 带质
胶体金快速检测的优点
1.操作更快 2.不需要成批实验 3.不需要使用特殊仪器 4.检测的当天就给出结果 5.只能采用经过WHO推荐的快速HIV抗 体检测，以确保质量
避免了放射性同 1、原理： ．兴起于20 世纪 70 年代， 位素对环境的污 PCR是模板 DNA ，引物和四种脱 氧核糖核昔三磷酸（dNTP）在 利用基因芯片对病人样本进行 现仍在临床应用； 诊断，将分子生物学、微电子、 DNA聚合酶作用下发生酶促聚 染和操作人员的 合反应，扩增出所需目的DNA 计算机等多学科进行结合进行 ．产品处于衰退期； 伤害；可半定量， 诊断 2、优点： 2、优点： ．厂商试剂与仪器共同 但灵敏度不及放 检测速度快，敏感性高，特异 精确度高，无污染， 性强，使用方便 开发，试剂基本系列化。 射免疫。
（一）HIV核酸检测
1. HIV核酸定性检测：通常使用PCR RT-PCR技术，用于HIV感染的辅助诊断。 2. HIV核酸定量检测：使用实时荧光定量 PCR, NASBA, bDNA等技术，常用于监测 HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。
核酸检测特点：
①能够用于常规不能培养和分离的病毒的检测（如HBV、HCV、 HIV等）； ②仅需少量标本或标本中仅含少量病毒也能检测； ③在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前，病毒感染的诊断主 要依靠NAT，适用于早期诊断； ④可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测； ⑤可对病毒基因进行基因分型，比血清分型更有价值； ⑥通过对病毒耐药基因的检测，可预测或发现病毒的耐药性； ⑦可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断； ⑧灵敏度高（可达 ng 甚至 fg 水平，理论上能检出单个病毒基 因），特异性好、快速、简捷。
明胶颗粒凝集试验（PA）
PA是一种简便的HIV血清抗体检测方法。先 将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未 致敏的明胶颗粒，混匀后保温（一般为室温）。 操作简便，无需特殊仪器设备，适合对少 量标本的检测。血清中有HIV抗体存在时，经抗 原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应， 根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。
用ELISA检测P24抗原，在HⅣ感染早期
尚未出现抗体时，血中就有该抗原存在，
但是由于P24量太少，阳性率通常较低。
现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原
，来提高敏感性。
HIV p24抗原测定及适用范围：
（1） HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。
（2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助
艾滋病的检测方法及进展
军事医学科学院微生物流行病研究所 司炳银
形态结构
人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。 病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋 白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并
与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球
形基质，以及蛋白p24形成的半锥形核衣壳。核衣壳内含
1、原理： 3、缺点： 3、缺点： 成本最高，技术成熟度不高，
化学发光免疫 法 （ＣＬＩＡ）
成本高，检测复杂，一次只能 ．兴起于20 世纪80年代， 产品开发难度大 针对一个对象，病毒容易突变 4、发展方向： 4、发展方向： 现 已被临床普遍使用， 灵敏高、快速、 目前实时定量荧光PCR技术发展 适合高端人群和特殊病种的诊 成为临床免疫诊断的支 简便、微量化、 很快，在临床诊断，动物疾病 断，市场空间有限，但盈利能 力突出 柱方法； 诊断，食品安全，科研等方面定量、可自动化 应用广泛，盈利突出，但由于 ．产品处于成熟期； 医保不覆盖，市场占有率还较 等优点。是诊断 低 ．厂商试剂与仪器共同 试剂发展的方向。 开发，仪器自动 44
不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR。 必须在P3级生物安全实验室进行。
HIV病毒分离培养的应用
1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB
不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。对 法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特性等 研究。
3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（ TCID50） 和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒药物测定。或消 毒杀菌药品的效果评价。
中国
国际（欧美为主） ．兴起于20世纪60年代， 现已基本退出临床应用； ．产品生命周期已终结； ．厂商试剂和仪器共同 开发，试剂基本系列化。
优缺点 放射性核素的污 染以及对操作人 员的伤害，灵敏 度高。
放射免疫法 ．兴起于20世纪70年代， 1. （ＲＩＡ） ．现在基本不用。
．兴起于20世纪80年代， 现普遍使用于各级临床机 构，为我国临床免疫诊断 酶联免疫法 的基本方法； （ＥＬＩＳＡ） ．产品处于成熟期； ．厂商试剂与仪器共同开 发。 ．引入于20世纪90年代， 现个别较大医院开展个别 项目； ．产品处于导入期或成长 期； ．无厂商开发生产，完全 依赖进口。
第三代
Y
Y
血清标本
Y
第四代
固相
酶标记物
Y
Y
Y
快速检测试验（RT）
快速HIV试剂的原理* 颗粒凝集 （Particle Agglutination, PA) 免疫渗漏 （Immunoconcentration, Flow through, FT) 免疫层析 （Immunochromatograpy, lateral flow, IF)
（2）HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助
诊断依据，不能据此确诊。
（3）HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中
无反应，不能排除HIV感染。
（五）HIV病毒分离培养
将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同 培养，适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原 /RT，从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感 染。 细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，
（三）HIV抗体确认试验
免疫印迹式验（WB）原理： WB是将HIV病毒蛋白用SDS-PAGE电泳，把
分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把
这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维
素膜上。在受检血清中检测能够和一系列病毒
蛋白发生反应的不同的抗体。原理类似与
ELISA试验。
（四）抗原检测
PCR反应图解
。
定量NASBA技术：
是由一对引物引导的，连续的、均一的、体外核苷 酸等温扩增的酶促反应。 优点：操作十分简单，只需将制备好的模板直接加 到反应体系中，恒温41℃扩增1.5～2小时，即可将模板 扩增109倍。 NASBA 反 应 体 系 包 括 AMV 反 转 录 酶 、 RNA 酶 H、 T7RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、 两个特异的引物及适宜的缓冲液。 NASBA的反应分为两相：循环相和非循环相。
诊断。
（3）第四代HIV抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳
性反应，但HIV-1抗体确认试验呈阴性者
的辅助诊断。
（4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。
HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释
（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试
验确认，若阳性标本的OD值比中和反应前减少
50%以上，才确定为HIV P24抗原结果阳性。
灵敏度问 题。
主要检测技术
分子诊断试剂
核酸诊断技术
诊断技术
聚合酶链式反应（PCR） 基因芯片诊断技术
1、原理： 病人样本 诊断试剂 （核酸）/基 因芯片 将诊断试剂由“抗体抗原”变为 “核酸”，依靠核酸从基因角度 诊断病原及病情 2、优点： 精确度高，能从基因遗传角度检 测疾病 3、缺点： 融合
诊断仪器
诊断结果
荧光定量层析技术
1.上转荧光技术 （UCP） 2.量子点技术(DQ） 3.纳米颗粒（FITC） 4. 时间分辨荧光
以胶体金为代表的层析技术已发展了20多年，目前
仍然广泛应用，但由于只能用于定性或半定量的检测，难 以满足临床检测指标定量化的要求;同时检测结果靠肉眼 判断，特别是在检测结果呈弱阳性时，极易造成人为漏检 现象，因此存在灵敏度较低等问题，需要进一步完善 。 而新型免疫 层析技术以特有的光电磁信号放大系统 提高检测灵敏度，减少样品的本底干扰，拥有传统标记物
HIV感染的实验室检测方法
常用HIV病原学检测方法:
1. 核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 2. 病毒培养分离 3. P24抗原检测
常用HIV抗体tern Blot）、RIBA 其他相关检测方法:
免疫功能测定：CD4/CD8检测
初筛：1.酶联免疫吸附法 ELISA：第三代、第四代 2.快速检测 RT：金标、硒标 3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集
所无法比拟的优势。免疫层析技术正朝着定量、高灵敏度、
多标记检测等方向发展。
根据免疫层析标记物的不同，可分为上转
换发光技术、基于时间分辨荧光免疫分析的层
析技术、荧光乳胶层析技术、荧光微球免疫层 析技术、量子点层析技术、磁珠免疫层析技术