大二下--微生物学实验总结

实验一、常用培养基配制一、 器皿清洗1、试管、培养皿、三角瓶、烧杯等玻璃器皿的清洗用瓶刷或海绵沾上洗衣粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。

热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污,去离子水润洗，倒置晾干或烘干。

2、全自动实验室玻璃器皿清洗机预清洗洗涤剂清洗自来水冲洗 纯水冲洗 135℃高温干燥 消毒3、装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。

带菌的器皿在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25％新洁尔灭（苯扎溴铵）消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。

带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。

二、载玻片与盖玻片的清洗用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5～10分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，最后用蒸馏水润洗数次，待干后浸于95％酒精中保存备用。

使用时在火焰上烧去酒精。

三、器皿包扎1、培养皿的包扎培养皿常用牛皮纸密密包紧，一般以5～8套培养皿作一包，包好后进行灭菌。

2、试管和三角烧瓶等的包扎试管和三角瓶盖上铝帽或者塑料帽后用牛皮纸包扎，进行灭菌。

包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。

四、器皿清洗和包扎小结微生物学实验室所用的玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包扎方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。

因此，在实验准备的时候要严格按照要求洗涤实验器皿。

包扎并灭菌后备用。

五、培养基配制牛肉膏蛋白胨培养基（培养一般细菌用） 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15～20g 水 1000ml实验原理：在配制固体培养基时要加入一定量琼脂作凝固剂。

琼脂在常用浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。

固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

培养基要用稀酸或稀碱将其pH 调至中性或微碱性，以利于细菌的生长 繁殖。

实验器材：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/L NaOH，1mol/L HCl；三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养皿，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 6.4~8.0）等。

实验步骤：1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨（易吸潮，称取要迅速）、NaCl放入三角瓶中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入三角瓶(琼脂在调节好pH后加入) 。

2.溶化在上述三角瓶中可加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

3.调节pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.2～7.4。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

4、分装、加塞、包扎液体：试管高度1/4左右固体：不超过试管高度1/5，灭菌后制成斜面；不超过三角烧瓶容积的1/2。

半固体分装试管：管高1/3，灭菌后垂直待凝。

5、灭菌将上述培养基以121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。

6、倒板将灭菌后的培养基冷至50℃左右，取出高压过的培养皿，制备牛肉膏蛋白胨培养基固体平板（在酒精灯火焰旁10cm附近操作）。

培养基配制小结1、注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

2、无菌检查：将灭菌的培养基放入37°C温室培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。

六、高压蒸汽灭菌原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。

待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

高压蒸汽灭菌方法：1.将灭菌篮取出，再向锅内加入适量的去离子水，使水面与底孔相平宜。

2.放回灭菌篮，并装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与壁面接触。

3.关闭高压锅盖排气阀，设定工作状态，本实验用121℃，20分钟灭菌。

4.灭菌所需时间到后，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成管塞沾染培养基而发生污染。

5.将取出的液体灭菌培养基放入4℃保存，如果是制备固体培养基平板则要待固体培养基温度降至50℃左右制备平板，固体培养基平板也放4℃保存。

七、培养基的分类1、按成分的不同分：天然培养基（主要成分是复杂的天然有机物质，如：马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，对其成分不完全了解，每次用量不恒定。

如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基等。

）合成培养基（化学成分完全了解的纯试剂配置而成的培养基：高氏1号培养基、查氏培养基等。

一般用于营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等）2、按培养基的物理状态分：固体培养基(凝固剂：琼脂Agar【加入1.5-2.5%即可凝固】、明胶、硅胶。

此培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保存等用)半固体培养基（加0.2-0.7%的琼脂。

常用作细菌动力检查和菌种保存、噬菌体制剂的制备等）液体培养基（常用于生理代谢的研究和工业发酵等）3、按培养基的用途分：基础培养基（含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质，如：牛肉膏蛋白胨培养基。

可作为一些特殊培养基的基础成分）营养培养基【加富培养基】（在基础培养基中加入某些特殊营养物质：血液、血清、生长因子等。

用以培养对营养要求高的微生物）鉴别培养基（含某种特定化合物或试剂，主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如：用醋酸铅培养基鉴定某种细菌能否产生H2S。

原理：某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，以此与别的微生物相区别。

）选择培养基（原理：微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长。

如：马丁氏培养基【分离真菌】、远藤氏培养基【鉴别肠道杆菌】）霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性；细菌和放线菌的培养基的pH是中性或微碱性。

注意：1、配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。

因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，再调整pH。

2、已配好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分、产生次生代谢废物和改变培养基的酸碱度而带来不利的影响。

3、生物安全柜：适用于病原菌。

实验二、土壤微生物的分离鉴定该实验采用平板分离法，操作比较简单，普遍应用于微生物的分离和纯化：一、实验原理1. 在适合于微生物的生长条件（如营养、温度、酸碱度、氧气等）下培养待分离微生物;或者加入某种抗生素形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，进而筛除一些不需要的微生物。

2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖形成的。

因此可通过挑取单菌落而获得纯培养的微生物。

获得单个菌落的途径可通过稀释涂布平板或平板划线等方法来完成。

实验器材：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/L NaOH，1mol/L HCl；三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，离心管（15ml）培养皿，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，无菌操作台，恒温培养箱，移液枪（枪头），pH试纸（pH 6.4~8.0）。

土样二、实验步骤1、配制牛肉膏蛋白胨培养基；2、121℃灭菌20min，倒平板固体培养基；3、制备土壤稀释液：(1) 称取10g土样，放入盛有90ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min使土和水充分混合；(2) 然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的离心管中，混合均匀；(3) 以此类推分别制成制成0.1、0.01、0.001和0.0001不同稀释度的土壤溶液。

(本实验采用15ml离心管盛无菌水)。

4、涂布培养：把0.01、0.001 和0.0001三个浓度的土壤稀释液作为涂布平板的含待分离微生物的菌液，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基上，共有9个培养基平板，标号，37℃温箱倒置培养24~48 h。

5、划线分离（划线培养）：对土壤稀释溶液微生物的培养基平板进行观察，记录区分明显的细菌特征。

挑取此细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养3个培养皿），标号，37°C温箱培养。

一般用斜线法、曲线法和四格法:四格法好处：1、控制变量；在一个平板培养不同的菌，结果可以进行对比。

2、节约平板。

6、初步鉴定：对菌体进行革兰氏染色观察，记录结果。

注意：1、平板经检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用；2、微生物计数：平板上的单菌落30~300个；3、涂布后的平板要先正放一段时间后再倒置培养：先正放：因为涂布的是菌液；再倒置培养：1）不至于不小心就打开皿盖；2）防止培养基水分挥发过快以至干裂；3）防止正放时液化于上方的水滴到培养基上将菌落混杂。

4、怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？1）观察菌落外观特征；2）显微镜下单细胞形态比较。

实验三革兰氏染色酸性染料电离后染料离子带负电，碱性染料电离后染料离子带正电。

一、实验原理革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的。

在染色过程中，当用乙醇处理时，肽聚糖脱水而孔障缩小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色，用G+表示。

革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶解的类脂质含量高。

当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液的颜色，因此呈现红色，用G-表示。

二、实验器材（一）金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,土壤分离细菌。

（二）革兰氏染色液：（结晶紫染液；Lugol碘液；95%乙醇；稀释石炭酸复红染液），载玻片，酒精灯，接种环，吸水纸，香柏油，擦镜纸等。

（三）普通光学显微镜。

三、实验步骤（一）、细菌涂片的制作1. 取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水，按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。

2. 再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。

3.将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。

待涂片冷却后，再加染色液。