2.2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》课件

是
分离 只生长 尿素 尿素细
养基
细菌 菌
对照组
牛肉膏蛋 白胨培养
基
判断该培 生长多
是
养基有无 种微生 选择性 物
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定 容积里样品中微生物的数量。
优点： 设备简单、能观察微生物的形态特征
缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外将少量DNA大量复制 的技术，而此项技术的实施必须使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。
or ?
水生栖热菌Taq
Taq酶
因为热泉温度为70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有
Taq细菌被筛选出来。
1.启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境要求，到相应的 环境中去寻找。
每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培 养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
菌落的特征：形状、大小、隆起程度和颜色等。
三、操作提示
[一]无菌操作 1、取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 [二]做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 [三]规划时间
石油分解菌
纤维素分解菌 尿素分解菌
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，
同时抑制或阻止其他微生物生长。
3.选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微 生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培 养基。

将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上 生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此， 牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养 基是否起到了选择作用。
2020/10/15
9
（三） 样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目2的020/：10/1保5 证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板10
计算公式：
每ml菌液含菌数 = N ×K ×d
(N：每个小方格含菌数平均值；
d：菌液稀释倍数；
2020/10/15
K = 4×106)
15
2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上 所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一 个菌落代表原先的一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
2）若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数进 行报告。
3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数 最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；
4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数 最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；
所有菌落数均不在30~300间，以最接近30或300的平均菌 落数乘稀释倍数。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2020/10/15
8
[二]制备培养基
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选 择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释 度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还 需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管 。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。 C：代表某一稀释度下平板上生长的 8 _平__均__菌__落__数_____。 V ： 代 表 涂 布 平 板 时 所 用 的 稀 释 液 的 9 _体__积___________ (mL)。 M：代表 10 _稀__释__倍__数_______。
3．微生物的培养与观察 (1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 22 ______温__度____和培养 23 ___时__间_________。 (2)观察：每隔 24 ___2_4_h_________统计一次菌落数目，最后 选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
4．细菌的计数：当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的 3 个平板进行计数，求出 25 __平__均__值________，并根据所对应的 26 __稀__释__度________计算出样品中细菌的数目。
1．判断正误 (1)显微镜直接计数法统计的都是活菌。( × ) (2)土壤样品稀释时不同的微生物应该选择不同的稀释度。 (√ ) (3)对活菌进行计数时，所做的平板越大越好。( × )
(4)只要培养基中有尿素即可筛选出分解尿素的细菌。( × ) (5)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最 多的平板进行统计。(× )
C．涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 21、212 和 256， 取平均值 163
D．涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 210、240 和 256， 取平均值 235
(2)一同学在稀释倍数为 106 的培养基上测得平板上菌落数 的平均值为 212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时 所用的稀释液体积为 0.2 mL)______________________。
积的样品中微生物的 板上的菌落数，就能推测出样品中

微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个 菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相 差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30——300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加 到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培 养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
㈢.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测 试因素对实验结果的影响，提高实验结果 的可信度。
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固 体培养基上所形成的一个菌落是由一个单 细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的 一个单细胞。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。
小结：通过这个事例可以看出，实验结果 要有说服力，对照的设置是必不可少的。
二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样
6、怎样证明此培养基具有选择性呢？
培养基类型
是否 接种
目的
结果
实验组
以尿素为 唯一氮源
是
分离 只生长尿 尿素 素细菌