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结核分枝杆菌耐药基因检测的临床应用发表时间：2018-01-15T16:36:22.360Z 来源：《世界复合医学》2017年第8期作者：孙百芹权利[导读] 耐多药结核分枝杆菌(MDR—TB)和广泛耐药结核分枝杆菌 (XDR—TB)感染已经对结核病防控工作构成严峻挑战。
黑龙江省鸡西市传染病医院检验科；邮编158100孙百芹权利我国是结核病高负担国家，肺结核病患者达500万，占全球总数的1／4。
耐多药结核分枝杆菌(MDR—TB)和广泛耐药结核分枝杆菌(XDR—TB)感染已经对结核病防控工作构成严峻挑战。
用基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药基因检测是临床基因诊断上升一个新的台阶，它能呈现结核病患者耐药信息，实现对结核病患者的个体化治疗，为临床医生制定合理的治疗方案、及时调整治疗方案提供依据，实现个体化治疗。
适用于临床长期服用抗结药物者、不规范治疗结核病患者、慢性结核患者（经多次不规则治疗后痰菌仍阳性的肺结核患者）、与耐多药结核患者有密切接触史的涂阳患者、复治涂阳患者（包括复治失败患者）、治疗3个月痰涂片仍阳性的初治涂阳患者的结核耐药检测。
能显著提高耐药结核病早期发现水平，使患者得以及时隔离和治疗,减少耐药菌株的传播，有助于提升医院及科室的综合实力和竞争力，增加公共卫生安全，有很高的社会效益。
它具有快速、灵敏度高、性能好、简便等特点。
8小时内可以获得耐药检测结果（常规的药敏培养要4-6周）能检测到的结核分枝杆菌最小为1.0×104copies/mL。
准确性达95%，特异性达98%，重复性达99%上。
对象与方法研究对象肺结核患者200例，其中男136例，女64例，年龄14～88岁(中位数48岁)；为鸡西市传染病院医院2015年4月至2016年3月住院期间确诊的肺结核患者，收集痰液标本进行液化和培养。
肺结核患者的诊断依据为肺结核诊断标准 (WS288—2008)E“。
试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供基因芯方法结果如下讨论近年来，快速检测结核分枝杆菌耐药的方法已有很多报道结核病严重危害人民群众的身心健康，已经成为全球共同关注的重大社会问题和公共卫生问题。
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
1.痰液涂片染色：这是最常用的方法之一、将痰液制备成涂片，进行
酸性染色，如抗酸杆菌染色和耐酸染色。
结核分枝杆菌是抗酸杆菌，其细
胞壁富含脂质，可以抵抗酸性染料的脱色作用。
这种方法可以快速检测出
结核分枝杆菌的存在。
2.结核分枝杆菌的培养：这是鉴定结核分枝杆菌的“金标准”。
痰样
品通常会涂在含有富含营养物质的培养基上，并在适当的温度和湿度条件
下孵育。
结核分枝杆菌需要一个相对较长的孵育时间（通常需要数周）才
能生长和生成可见的菌落。
分枝杆菌的培养是确诊结核病的关键步骤，同
时还可以进行对特定抗结核药物的药敏试验。
3.伊红染色：这种方法旨在鉴定酸酒杆菌属分枝杆菌和其他酸杆菌的
超微结构。
伊红染色可使细胞壁和细胞内储存的色素显现为红色或粉红色。
该方法可以帮助确定分枝杆菌的类属。
4.PCR检测：聚合酶链反应（PCR）能够通过扩增目标基因片段来检
测和诊断结核分枝杆菌。
这种方法具有高度特异性和灵敏度，并可以通过
荧光标记的探针来定量检测。
5.蛋白质组学：蛋白质组学技术通过检测和分析结核分枝杆菌内部蛋
白质的组成和变化，可以为诊断和治疗提供信息。
质谱法是一种常用的蛋
白质组学技术，可以通过检测菌落样品中的特定蛋白质来鉴定结核分枝杆菌。
总的来说，微生物学诊断方法在结核分枝杆菌检测和鉴定中起着至关
重要的作用。
这些方法可以帮助医生确定结核病的诊断和治疗方案，并对
结核分枝杆菌的流行病学研究和控制提供重要的科学依据。
结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值分析
摘要:目的：分析结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值。方法：以40例耐药肺结核患者为对象，研究时间是2019年1月-2022年3月，分为参照组20例、研究组20例，参照组应用标准化治疗，研究组应用结核分枝杆菌耐药基因检测联合个体化治疗，对比治疗效果。结果：研究组患者治疗后咳嗽评分、胸痛评分、咯血评分、发热评分更低，与参照组比较（P<0.05）。对于治疗有效率，研究组更高（P<0.05）。结论：耐药肺结核患者采用结核分枝杆菌耐药基因检测联合个体化替代治疗，具有显著治疗效果。
关键词：结核分枝杆菌耐药基因检测；个体化治疗；耐药肺结核；标准化治疗；
结核病是临床常见慢性疾病，是因感染结核杆菌引起，包括肠结核、胃部结合、肝结核、肺部结核等，其中肺结核较为常见，且在所有结核病中约占80.00%。肺结核潜伏期为4-8周，主要症状为咳嗽、咳痰、发热、乏力、消瘦、咯血等，严重威胁患者的身体健康，需及时给予有效治疗[1]。对于耐药肺结核患者，首先需实施结核分枝杆菌耐药基因检测，结合实际情况确定治疗方案。本文将以近年来（2019年1月-2022年3月）40例患者为对象进行研究。详细如下。
1资料与方法 1.1一般资料 选取耐药肺结核者进行研究，共计40例，20例患者是参照组，20例患者是研究组，本研究在2019年1月开始，在2022年3月结束。参照组，11例是男性，9例是女性；年龄平均值为（48.75±4.38）岁。研究组患者中，男性12例，女性8例；年龄平均值为（48.98±4.46）岁。对比分析患者的一般资料，差异P>0.05。 1.2方法 参照组患者实施标准化治疗：应用2HREZS/6HRE化疗方案治疗，即异烟肼（H）治疗，每次1次，每次0.3g；利福平（R）治疗，每天1次，每次0.45g；吡嗪酰胺（Z）治疗，每天1次，每次0.75g。持续治疗1年。
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，主要累及肺部，但也可侵犯其他器官。
然而，近年来出现了结核分枝杆菌对抗生素的耐药性问题，给结核病的防治带来了巨大挑战。
本文将就结核分枝杆菌的耐药性机制以及常用的检测方法进行论述。
一、耐药性机制1.多重耐药（MDR）多重耐药是指结核分枝杆菌对两种最主要的抗结核药物——异烟肼和利福平同时产生耐药现象。
这种耐药形式使得传统治疗手段无法有效控制感染，并且增加了传播风险。
2.延迟耐药（XDR）延迟耐药是在MDR基础上，又产生对氟喹诺酮类等二线抗结核药物的耐药性。
这使得治疗选择更加有限，且通常需要使用更昂贵和毒副作用更大的抗结核药物。
3.全耐药（TDR）全耐药是指对所有一线和二线抗结核药物都产生耐药现象，这种情况下仅能依靠其他的药物才能进行治疗。
然而，这些替代治疗方案费用昂贵且可行性有限。
二、检测方法1.传统的抗生素敏感性测试传统的抗生素敏感性试验使用培养分枝杆菌，并将其接种于含有抗生素的琼脂平板上。
通过观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况来判断其对该抗生素是否具有耐药性。
尽管这种方法简单易行，但其确诊时间较长，且容易出现误判。
2.分子检测方法随着分子生物学技术的进步，利用PCR技术可以更快速地检测结核分枝杆菌的耐药基因突变。
这种方法通过检测与耐药性相关基因序列的存在与否来确定细菌对特定抗生素是否具有耐药性。
由于PCR技术高灵敏度和高特异性，它已成为常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法之一。
3.流式细胞术流式细胞术利用荧光标记的结核分枝杆菌单个细胞对特定抗生素的反应进行测定。
通过测量细胞内荧光信号的变化来判断其对抗生素是否产生了耐药性。
这种方法具有高通量和快速的优势，但需要对样本进行前期处理以获得单个菌落。
4.质谱法质谱法利用MALDI-TOF质谱仪检测结核菌代谢产物图谱与数据库匹配，从而快速确定结核分枝杆菌的耐药类型。
亚能结核分枝杆菌耐药突变（GC－MTB）检测项目开展指南一结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测实验流程示意图二实验室建设1最佳结核分枝杆菌耐药突变基因检测实验室设计平面图1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及杂交分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。
3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。
4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套。
出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套。
5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括微量移液器、离心机、水浴锅、试管架、一次性手套、移液枪头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪器设备及耗材不能混用。
2实验室环境1）工作区域必须始终保持清洁整齐2）所有实验台面及地面均应保持清洁.3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。
4）每次工作前后对工作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌。
3 实验室制度及人员配备1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。
2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。
3）操作人员需要有强烈的责任感，工作认真细心。
4）操作人员需要严格遵守MTB耐药突变基因检测工作的标准操作规程。
三实验所需试剂、设备及其功能简介整个结核分枝杆菌（MMTB）耐药突变基因检测实验由以下三个实验组成：临床痰样的处理（DNA的提取），基因扩增（PCR）和杂交分析。
1 实验所需试剂2 实验所需仪器（推荐使用）及功能简介结核分枝杆菌耐药突变基因（GC-MTB）临床检测结果及常见问题解答1MTB耐药检测方法有哪些？1）MTB耐药检测目前常规的方法是药敏培养法，但该法操作复杂，耗时长（需3至4周），且培养困难，容易产生假阴性，以致造成误判和延误病人的最佳治疗时间。
2）MTB基因水平的检测○1 DNA测序法：对耐药基因的PCR产物进行直接测序，然后与标准敏感株的DNA片段比较，分析碱基突变的位置和分布。
单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因发表时间：2009-06-09T10:06:02.343Z 来源：《中外健康文摘》2009年4月第10期供稿 作者： 祝纪华1 刘 渠2 徐亚军2 刘衡川3[导读] 链霉素作为结核病的一线用药被广泛应用，近年来，国内外耐链霉素病例也在逐渐增高。
（1四川省夹江县疾病预防控制中心 614100 ；2广东省深圳市龙岗区疾病预防控制中心 518172）（3四川大学华西公共卫生学院医学检验教研室 四川成都 610041）
【中图分类号】R915 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2009)10-0005-02
【摘要】 用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌链霉素耐药株的rpsl、rrs基因突变，可用于临床结核分支杆菌链霉素耐药性的辅助诊断手段。
【关键词】 结核分支杆菌 链霉素 耐药 PCR-LiPA rpsL基因 rrs基因
【Abstract】 PCR-LiPA might become a rapid, simple, sensitive and specific method to detect rpsl、rrs genes mutations in part ofstreptomycin-resistant M. tuberculosis. It could be used for clinical detection of drug-resistance as an assistant test.
【Key words】 Mycobacterium tuberculosis Streptomycin Drug-resistance PCR-LiPA rpoB katG rpsl rrs embB gene.
链霉素作为结核病的一线用药被广泛应用，近年来，国内外耐链霉素病例也在逐渐增高。
单链探针反向杂交试验(LiPA)技术基于探针杂交原理，设计合成一系列探针，覆盖整个待检基因的突变高发区，在严格条件下与带生物素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出有无突变及突变的大致位置。本研究用此方法同时检测结核分支杆菌链霉素（SM）耐药相关基因，探讨单链探针反向杂交技术检测结核分支杆菌链霉素耐药性的应用价值。
1 材料与方法1.1临床菌株结核分支杆菌临床分离株50株。2005年至2006年从深圳市四个区级慢性病防治院采集的痰标本中分离，以改良罗氏培养基纯培养，并进行药敏试验分析其耐药特性。
1.2 参考菌株结核分支杆菌标准株H37Rv（93020）、牛型分支杆菌（93006）、偶发分支杆菌（93323）、蟾分支杆菌（93325）、草分支杆菌（93318）、龟分支杆菌（93326）来源于中国医学细菌保藏中心。
1.3 方法1.3.1引物的设计与合成根据rpsl、rrs基因序列及待检测的突变位点设计引物。上游引物5’端标记生物素，赛百胜公司合成。表1 PCR-LiPA检测MTB链霉素耐药基因引物编号 名称 序列5’到3’ 片断长度 Tm值 GC%1上 rrs上游 CACTGGGACTGAGATACGGC 20 58.0℃ 60.0%1下 rrs下游 GACAACGCTCGCACCCTA 18 61.4℃ 61.1%2上 rpsl上游 GTCGGGACAAGATCAGTAAGGT 22 58.1℃ 50.0%2下 rpsl下游 CTGCGTATCCAGCGAACC 18 56.6℃ 51.1%1.3.2探针的设计与合成rpsl基因选择3个最常见的突变：43位AAG→AGG，88 位AAG→AGG、ACG。rrs基因选择3个最常见的突变：513位A→C、T，516位C→T。据此设计探针：rpsl－S1（43 位野生型）、rpsl－R1a（43AAG→AGG）、rpsl－S2（88位野生型）、rpsl－R2a（88位AAG→AGG）、rpsl－R2b（88位AAG→ACG）；rrs－S1（野生型）、rrs－R1a（513位A →C）、rrs－R1b（513位A→T）、rrs－R1c（516位C→T）。赛百胜公司合成。
1.3.3 PCR扩增两种扩增皆使用降落式循环程序，检测到电泳条带后，用四因素三水平正交试验摸索最佳反应体系。用最佳循环条件和最佳反应体系扩增样品。
1.3.4 LiPA应用1U/μlTDT对3pmol/μl探针在37℃加尾2小时；取0.2μ1加尾探针点膜，60℃固定2小时制备膜芯片；加入预杂交液(4×SSC，5×Denharts，0.1mg/ml小牛胸腺DNA， 0.5 % SDS)预杂交半个小时，与10μ1生物素标记的PCR扩增产物于66℃杂交60min；用1×SSC-0.1%SDS和0.1×SSC-0.1%SDS洗液在室温下各洗膜5min；1:5000的SA-AP与膜在37℃反应30min，室温洗膜，加入底物NBT/BICP闭光显色 30min，根据信号强弱判读结果。
1.4 PCR-DS取50μlPCR扩增产物（用未标记生物素的引物扩增）以及相应上游引物送华大生物有限公司测序。2 结果2.1传统药敏试验结果50株菌中共有20株不同程度的耐药，2株耐INH，7株耐 RFP，15株耐SM，2株耐EMB。2.2 PCR-LiPA的条件优化2.2.1优化探针浓度选择点膜探针终浓度分别为1.5pmol/μl、3.0pmol/μ l、6.0pmol/μl，与生物素标记的结核分支杆菌H37Rv rpsl基因扩增产物杂交，同时阴性PCR扩增结果做阴性对照，结果当探针终浓度大于3.0pmo1/μl时杂交效果较好，3.0pmol/ μl、6.0pmol/μl无明显差异。选择3.0pmo1/μl探针浓度。
2.2.2优化杂交温度杂交温度分别为62℃、64℃、66℃、68℃、70℃，同时阴性PCR扩增结果做LiPA阴性对照，结果显示66℃无非特异显色，低于此温度有非特异显色，68℃显色斑点颜色过浅，说明杂交效率不高，选择66℃为rrs、rpsl基因突变检测的杂交温度。
2.2.3优化杂交时间杂交温度66℃，杂交时间分别为30min、45min、60min、 75min、90min，随着杂交时间的增加，显色斑点颜色更深，但在大于60min时，有非特异性杂交斑点，杂交时间选择60min。
2.2.4优化杂交液盐浓度
杂交液的盐浓度和SDS浓度将影响杂交的特异性，杂交液成分5×Denharts，0.1mg/ml小牛胸腺DNA成分不变，选择SSC浓度和SDS浓度：4×SSC、0.3% SDS；4×SSC、0.5% SDS；3×SSC、0.6% SDS，杂交斑点颜色以第二个条件最深。选择4×SSC、0.5% SDS。
2.3 PCR-LiPA鉴定50株临床分离株链霉素耐药基因突变结果15株耐SM菌中6株rpsl基因经PCR-LiPA分析有43位 AAG→AGG的突变，1株rpsl基因88位AAG→AGG突变，其他8株没有相应位点的突变。敏感菌株中有1株发现有43 位AAG→AGG的突变，其他无突变。50株菌PCR-LiPA均未检测到rrs基因相应位点的突变。
2.4 PCR-DR鉴定临床分离株链霉素耐药基因突变结果rpsl基因选择耐SM菌株、检测发生突变的敏感菌株和其他1株敏感菌株共17株测序，有7株发现43位AAG→AGG突变，1株88位AAG→AGG突变，和LipA结果相同。1株 88位AAG→ATG突变，而LiPA法未设计此类型突变探针，故LiPA没能检测出此突变，余下菌株与H37Rv标准菌株序列一致。
rrs基因测序选择耐SM菌15株和1株敏感菌株共16株， PCR-DS结果均与H37Rv标准菌株一致。2.5各基因PCR-LiPA探针敏感性纯化的结核分支杆菌H37Rv株提取DNA用光密度法测定浓度为757μg/ml。用双蒸水稀释成100μg/ml，再10倍系列稀释。用各引物进行PCR扩增，10μl扩增产物进行LiPA 分析，各基因PCR-LiPA探针敏感性均为10pg。 3 讨论本研究以传统药物敏感性试验结果为金标准，PCR-LiPA 试验检测SM耐药灵敏度为47%，特异性为97%，47％的SM耐药菌株的rpsL基因突变，没有发现rrs基因的突变，比文献报道的稍少。耐药菌株突变率不同可能是由于地域不同流行的耐药菌株不同。
影响探针特异性的因素，除探针设计外，LiPA过程很多的因素也有影响。首先是杂交温度的选择。对于没有高度同源的探针，经过Blast分析，具有好的特异性，在杂交温度上要求不高。但是S系列探针和R系列探针用于检测突变，针对同一位点的多个探针只有一个碱基不同，杂交温度要求较高，实验发现2℃的差别就可产生非特异性杂交。通常杂交温度低杂交效率高，但特异性降低，杂交温度高特异性较好，但是杂交斑点显色淡，或者不发生杂交。用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃。实验发现，比Tm值略低1～5℃可在保证特异性的条件下，有好的杂交结果。第二个因素是杂交体系和洗液的离子强度。盐浓度低杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率也增加，但高浓度的盐使碱基错配的杂交更稳定，当探针同源性比较高时，杂交反应液中的盐浓度和洗液的盐浓度不能过高，要维持一定的量。第三个因素是洗膜温度和洗膜时间，洗膜的作用是洗去游离的探针和非特异杂交的探针，非特异杂交的探针通常Tm值比较低，一般低5～12 ℃，洗膜温度过高可能洗去特异性杂交，过低不能洗去非特异性杂交，洗膜时间也是如此。但本实验没有发现洗膜温度和时间有大的差异，可能是非特异性杂交较少的原因。
PCR-LiPA有简便、快速、灵敏的优点，也存在一些缺点：受到探针数量的限制，和PCR-DS相比不能检测到所有可能的突变类型，更不能检测到新的突变类型；基因突变和耐药表型并非一一对应，只能作为快速检验的辅助手段；探针间的同源性很高，容易出现非特异杂交，因此需要严格控制各项试验条件，否则易出现非特异杂交。
参 考 文 献 [1] http://www.who.com ANTI-TUBERCULOSIS DRUGRESISTANCE IN THE WORLD.
[2] 张敦熔主编.现代结核病学.北京：人民军医出版社,2000,36-980.
