细胞实验三 植物细胞骨架观察(参考)

实验细胞⾻架的显⽰及观察实验4 细胞⾻架的显⽰及观察姓名：李思露学号：131140040⼀、实验⽬的1.掌握⽤考马斯亮蓝R250染⾊观察动物和植物细胞⾻架的原理和⽅法。

2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和⽅法。

⼆、实验原理1.细胞⾻架：指真核细胞中的蛋⽩纤维⽹架体系。

⼴义的细胞⾻架包括细胞核⾻架、细胞质⾻架、细胞膜⾻架和细胞外基质。

狭义的细胞⾻架是指细胞质⾻架，包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediated filament，IF）。

2.微管微管是细胞内由微管蛋⽩形成的直径约呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。

微管蛋⽩有α和β两种。

αβ异⼆聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。

微管不稳定，对低温（冷冻）、⾼压等物理因素及秋⽔仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。

紫杉醇可以和微管蛋⽩多聚体结合，抑制微管解聚。

3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋⽩（actin）组成的直径为5～7nm的⾻架纤丝。

主要分布在细胞质膜的内侧，作⽤是确定细胞表⾯特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。

脊椎动物肌动蛋⽩分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋⽩组成不同。

肌动蛋⽩单体为球形，依次连接成链，两串肌动蛋⽩链互相缠绕扭曲成⼀股微丝。

细胞松弛素B为微丝断裂剂。

4.中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋⽩组成的细胞⾻架（1）了解细胞⾻架与细胞各种功能⾏使之间的关系。

（2）了解理化因素是否通过影响细胞⾻架对细胞功能产⽣影响，以便趋利避害。

（3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。

6. 显⽰细胞⾻架的常⽤⽅法：考马⽒亮蓝染⾊法、免疫荧光染⾊法、⿁笔环肽标记法。

（1）考马斯亮蓝染⾊法原理及特点原理：⽤去垢剂Triton X-100处理细胞适宜时间，可以溶解膜脂，并与⼤部分⾮⾻架蛋⽩疏⽔区结合⽽将其溶解，剩下的纤维状细胞⾻架蛋⽩⽐较稳定⽽不被溶解，然后⽤蛋⽩染料考马斯亮蓝染⾊即可显⽰其结构。

实验五 植物细胞骨架和胞间连 丝的观察
一、植物细胞骨架的光学显微镜观察 （一）实验目的 掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光 学显微镜下细胞骨架的网状结构。 （二）实验原理 细胞骨架定义： 狭义的细胞骨架（cytoskeleton）概念是指真核细胞中的蛋 白纤维网络结构。它所组成的结构体系称为 “细胞骨架系 统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称 “细胞内的 三大系统”。包含三类蛋白纤丝？？
3 植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。
triton x-100 (聚乙二醇辛基苯基醚) ，中文名 为曲拉通 x-100，分子量为 647，常作为非离 子型表面活性剂（或称清洁剂）。它能溶解脂 质，以增加抗体对细胞膜的通透性。 免疫细胞化学中，triton x-100 常用浓度为1% 和0.3%，1% 的 triton x-100 常用于漂洗组织标 本，在水溶液中促进蛋白降解。0.3%的 triton x-100 则常用于稀释血清。
广义的细胞骨架概念是在细胞核中存在的核骨架-核纤层体 系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于 细胞核和细胞质的网架体系。
细胞骨架作用：
1 维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有 序性； 2 参与细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞 物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向 转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成 动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、 神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关；
植物细胞用适当浓度的 TritonX—100 处理 后， 可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白 质却保存完好。 考马斯亮蓝 R250 (Coomassie brilliant blue R250) 是一种蛋白质染料，处理后的材料用考 马斯亮蓝 R250 染色后，用光学显微镜观察， 可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。

• 配方：
试剂 相对分子质量 所需浓度 每升加量 备注 咪唑 68.08 50mmol/L 3.40g KCL 74.55 50mmol/L 3.73g MgCl2。6H2O 203.30 0.5mmol/L 0.1g EGTA 380.40 1.0mmol/L 0.38g EDTA。2H2O 372.24 0.1mmol/L 0.04g B-巯基乙醇 78.13 1.0 mmol/L 70ul 甘油 92.09 4.0mmol/L 294.8ml 加水定容至1L，PH调至7.2
『实验内容和方法』
1、取材：撕取小块洋葱鳞茎内皮(约1cm2大小若干片) ，浸于6 mmol/L PBS中，使其下沉，处理5-10min。
2、抽提：吸去PBS，加2 ml 1%的TritonX-100，于37℃水浴处理 30min。
3、冲洗： 吸去TritonX-100，用M缓冲液轻轻洗3次，每次5min。 4、固定：3%戊二醛固定20min。 5、冲洗：弃戊二醛，用6mmol/L PBS液洗3次，每次5min。 6、染色：吸去PBS，用0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。 7、制片：倒掉染液，用水洗2-3次，在载玻片上铺展开，加盖玻
错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为微 管（microtubule，MT）、微丝（microfilament， MF）、中间纤维（intermediatefilament，IF）。它 们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、 分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨 架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技 术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用1%的 TritonX-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95% 以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白 质染料考马斯亮蓝R250染色，使细胞内细胞骨架得以 清晰显现。

1924年，在光学显微镜下首先发现了粗而直的一些纤维， 称为应力纤维。 40年代后期，有人从原生质胶态转变的现象推测，可能在 胞质中存在着一种蛋白质纤维的网架。 1954年，在超薄切片的电子显微镜观察中首次看到了微管。 长时间以来电镜研究中都以锇酸或高锰酸钾在0~4℃固定 材料，使得骨架系统的大部分成分都遭到破坏。 1963年采用戊二醛并在室温下固定的方法以后，才广泛地 观察到各类骨架纤维的存在。
A：Tritonx－100：一种非离子型的去垢剂， 作用：溶解膜脂，又不使蛋白质变性 B：十二烷基磺酸钠(SDS)：离子型去垢剂 作用：使细胞膜崩溃，并与膜蛋白的疏水部分结合而分 离，并使蛋白变性
SDS
2、使用考马斯亮蓝R250染色 注意考马斯亮蓝R250并不是特异的骨架染料。
三、实验材料及试剂
微丝素 ×
洋葱表皮细胞骨架显示
细胞核
细胞骨架
MA104细胞骨架
细胞核
细胞骨架
四、实验步骤
1、预处理(此步骤已作)
切0.5平方厘米小块， 0.2mol／L 的磷酸缓冲液浸泡3-10h
2、抽提剂抽提
1％的Tritonx－100 处理 30min
3、清洗 M-缓冲液洗3次，每次5分钟 4、固定 3％戊二醛固定30min 5、清洗 0.2mol／L 的磷酸缓冲液洗3次，每次2分钟 6、染色（注意撕下内表皮来染色） 0.2％考马斯亮蓝R250染色30分钟 7）水洗----铺片---装片---镜下观察
10nm Intermediate filament • 中间纤维使细 胞具有张力和 抗剪切力。
微丝
细胞中成束的肌动蛋白纤维 （a）微绒毛 (b)应力纤维 （c）运动细胞前缘的鞘和指 (d)细胞分裂时的收缩环