管碟法测定生物效价影响因素的探讨及改进_李凡

制可信限率和抑菌圈大小 ,见表 1。
表 1 试验菌新 、旧传代保存方法测定结果对照表
品名
试验菌名 称及编号
盐酸大观霉素 大肠杆菌
新方法
抑菌圈 可信限
边缘 清晰
率 /% 4. 75
CMCC (B) 44103 硫酸粘菌素 大肠杆菌 清晰
3. 94
CMCC (B) 44103 硫酸壮观霉素 大肠杆菌 清晰
自配培养基按《中国兽药典 》提供的处方及制备 方法进行配制 ,试验发现多数抗生素品种适合使用 进口生化试剂配制培养基 ,能有效的控制抑菌圈的 清晰度、直径大小和平均可信限率 ;但是有些品种选
作者简介 :李 凡 (1959年 2) ,女 ,高级技师 ,助理工程师 ,从事微生物检定工作 。 E - mail: yxnbj@163169. net
硫酸大观霉素
17. 90 16. 45
18. 05 17. 90
18. 55 18. 52
2. 2. 1 方法对照试验 选盐酸大观霉素和硫酸大 观霉素两个品种 ,分别用法定培养基 ⅤpH 8. 0 和 改进培养基 ⅤpH8. 4进行效价测定 ,求出两组效价 结果的平均偏差 ,见表 3。
品种 盐酸大观霉素 硫酸大观霉素
表 5 各品种在不同温度的培养结果
品种 硫酸安普霉素
培养温度 35～36 ℃ 抑菌圈 可信限
4. 37
CMCC (B) 44102 酒石酸泰乐菌素 藤黄微球菌 清晰
3. 81
CMCC (B) 28001
旧方法 抑菌圈 可信限
边缘 率 / % 有虚圈 5. 88 直径小 不清晰 8. 12 不圆正 有虚圈 5. 22 直径小 不清晰 6. 32 有虚圈
2 培养基对效价测定的影响探讨及改进 2. 1 培养基的质量对效价测定的影响探讨 培养 基有干粉培养基和自配培养基两种 。干粉培养基 即购买的半成品干粉培养基 ,按比例加入水中混匀 灭菌 ,使用方便 。但经试验发现有些品种不适合使 用 ,如盐酸大观霉素 ,若用干粉培养基 Ⅱ测定效价 , 抑菌圈清晰度差 ,仪器测量较困难 。
表 4 回收率试验结果
设计浓 理论效价 实测效价
平均回
度点
/ ( u·mg - 1 )
回收率 / ( u·mg - 1 )
/%
收率
/%
RSD /%
80%
620
614
99. 03
617
99. 52
626
100. 96
100%
620
615
99. 19
619
99. 84 99. 89% 0. 69%
625
mm ,见表 2,可信限率也有所降低 ,见表 3。并进行 了方法对照 、精密度 、回收率 、线性及线性范围试 验。
表 2 不同 pH值的培养基测定抑菌圈直径比较 /mm
品名
pH 8. 0
pH 8. 2
pH 8. 4
盐酸大观霉素
16. 32 16. 89
Hale Waihona Puke 17. 85 18. 03
18. 65 18. 86
2008, 42 (1) : 45～48 /李 凡 ,等 中国兽药杂志
·45·
管碟法测定生物效价影响因素的探讨及改进
李 凡 ,朱志华 ,姜凤丽 ,宋丽华 ,代晓静
(山东鲁抗医药股份有限公司质监中心 ,山东济宁 272021) [收稿日期 ] 2007206206 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 100221280 (2008) 0120045 - 04 [中图分类号 ] TQ460. 72
随着我国兽药市场的不断发展 ,国家对兽药质 量标准的要求更为严格 。抗生素药品的生物效价 测定是兽药检验的重要项目 ,为保证效价测定结果 的精密度和准确度 。笔者试从试验菌 、培养基 、溶 液配制 、培养温度 、培养时间 、测量仪等方面进行以 下实验探讨及改进 。 1 试验菌对效价测定的影响探讨及改进
制备双碟应按标准操作规范 [ 4 ] ,并注意保证操 作台水平 ,无菌无抗生素污染 。培养基最好用水浴 融化 ,而用微波炉融化易损失水分使培养基变稠 。 培养基的融化次数最好不超过两次 ,否则会影响抑 菌圈清晰度 。制备底层前要把培养基摇匀 ,同一组 双碟的加量要一致 ,否则碟间差异大 ,导致可信限 率偏高 。菌层培养基的温度要严格控制细菌在 48 ～50 ℃,经试验芽孢菌可提高到 60～70 ℃,有利于 菌层培养基摊布均匀 ,并无气泡 ,无凝块 ,才能有效 地控制抑菌圈均匀度和平均可信限率 。
平均
批号
182 183 184 001 002 003 ---
表 3 不同 pH值的培养基测定结果对照
①法定培养基 ⅤpH 8. 0
测定效价 抑菌圈清晰度 可信限率 / %
/ ( u·mg - 1 )
656
清晰
4. 53
663
清晰
5. 96
658
清晰
5. 33
635
清晰
4. 05
628
清晰
4. 52
100. 81
120%
620
616
99. 35
620
100. 00
622
100. 32
252、380 u /mL 的 6份溶液 。按照管碟法操作要求 , 用培养基 ⅤpH 8. 4 测定各种浓度的抑菌圈直径 。 每种浓度各制备 10个抑菌圈 , 6种浓度共需要制备 60个抑菌圈 ,一个双碟可安排 6 个抑菌圈 ,共需要 10个双 碟 。测 得 6 种 浓 度 的 平 均 直 径 分 别 为 : 14. 58、15. 77、16. 92、17. 93、18. 96、20. 06 mm。以
[摘 要 ] 《中国兽药典 》(2005年版 ) [1 ]收载的兽用抗生素药品效价的微生物检定包括两种方 法 ,即管碟法和浊度法 。目前多数使用者仍以管碟法为主 。管碟法作为抗生素效价测定的经典 方法 ,具有它的优点 ,但此方法操作步骤复杂 ,试验影响因素多 ,需要从每个环节严格控制 ,才能 得到与真值更为接近的结果 。笔者结合日常工作实践 ,对管碟法测定抗生素生物效价过程中的 多种影响因素进行探讨及改进 ,使测定条件得到了较好的控制 ,有利于提高效价测定结果的精密 度和准确度 。 [关键词 ] 抗生素效价 ;管碟法 ;影响因素 ;探讨 ;改进
634
清晰
4. 06
---
---
4. 97
②改进培养基 ⅤpH 8. 4
测定效价 抑菌圈清晰度 可信限率 / %
/ ( u·mg - 1 )
651
清晰
3. 85
652
清晰
4. 02
660
清晰
4. 52
629
清晰
3. 93
625
清晰
2. 36
636
清晰
3. 38
---
---
3. 68
( ① - ②) / ( u·mg - 1 )
试验菌传代和保存的旧方法是将冷冻管菌种 复苏后 ,采用斜面低温保藏法 ,一般 1～3个月转种 一次 ,每 6 代平板分离一次 ,挑选典型的单个菌落 扩大培养 ,继续使用 ,缺点是抑菌圈清晰度逐渐变 差 ,导致平均可信限率偏高 ,有些抗生素品种的抑 菌圈直径逐渐偏小 ,需要做较多的工作才能有效的 控制 。通过查找有关资料 [ 2 ]和咨询有关专家 ,并进 行了反复试验 ,改进菌种传代和保藏的新方法为 : 将冷冻管菌种复苏后 ,挑取单个纯种菌落的第 2代 菌种用适宜的方法保藏数支 ,同时挑取纯菌落转接 斜面菌种作为工作用菌种到第 5代为止 ,再取保藏 的第 2代菌种转种工作用菌种至第 5代 ,如此循环 用完保藏的第 2代为止 ,同时保藏的第 2代菌种要 定期传代至第 4 代为止 。这样能保证试验菌种的 使用质量 ,提高抑菌圈清晰度及均匀度 ,有效地控
量和含量 ,能保证抑菌圈边缘的清晰度 ,有效地控 制平均可信限率和抑菌圈大小 。所以要选择合适 的生产厂家 ,来保证质量 ,使配制的培养基凝固后 透明无沉淀 。同时控制好琼脂含量 ,试验发现 ,琼 脂含量应控制在最低限度 ,即控制在小钢管不下陷 为准 。这样在加菌层培养基时粘度适中 ,不容易结 块 ,摊布均匀 ,形成的抑菌圈均匀度好 。 3 溶液配制对效价测定的影响探讨 3. 1 使用的标准品与供试品必须同质 [3] ,要注意多 组分抗生素标准品与供试品的组分比应相同 ,尽量避 免使用不相同组分进行比较 ,否则标准品与供试品的 两条反应直线不平行 ,计算结果时出现误差较大。 3. 2 配制标准品溶液和供试品溶液时 ,应按标准 操作规范 [ 4 ] ,并注意所用剂量器具必须是 A 级品 , 按其要求进行标定后才能使用 。标准品与供试品 所用溶剂尽量相同 ,使用同一瓶缓冲液 ,用同一支 吸管 、吸取相同的体积 、同时进行稀释 ,使标准品和 供试品的测定条件尽量一致 ,抵消各种误差 ,将操 作误差降低到最低限度 。否则也会影响标准品与 供试品两条直线间的平行 ,影响测定结果的精密度 和准确度 。 4 双碟制备对效价测定的影响探讨
5 11 -2 6 3 -2 3. 5
效价测定结果 t检验 [2 ] :两组结果的平均偏差 d平均与标准值 d0 比较 , 当 计t 算 < 表t 值 时 , 两种方法 无显著性差异 。
假定两种方法无显著性差异 ,即 d0 = 0; 计算 d平均 = 3. 5; s = 5. 01; 计t 算 = 1. 43;查 t值分布表 ,当 f = 5,置信度为 95%时 ,表值 t(0. 05, 5) = 2. 57。 2. 2. 2 精密度试验 选硫酸大观霉素 033批 ,用培 养基 ⅤpH 8. 4,测定 10次 ,效价测定结果如下 : 614、 617、626、615、619、625、616、620、622、623 u /mg。平均 效价为 620 u /mg, S = 4. 22, RSD = 0. 68%。 2. 2. 3 回收率试验 选硫酸大观霉素 033 批 ,配 制成浓度约为 ( 80、160 ) , ( 100、200 ) , ( 120、240 ) u /mL的 3 种溶液 (相当于平常分析浓度的 80%、 100%、120% ) ,每种浓度配制 3 份共配制 9 份溶 液 。用培养基 ⅤpH 8. 4 测效价结果 ,计算回收率 , 见表 4。 2. 2. 4 线性及线性范围试验 精密称取一定量的 硫酸大观霉素 033 批 ,在规定的 50 ～380 u /mL 浓 度范围内 ,依次配制成浓度约为 50、75、112、168、