人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 方法的初步研究

国际检验医学杂志２０１５年６月第３６卷第ｌ１期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｊｕｎｅ　２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１１　

・论　著・　

人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组ＤＮＡ方法的初步研究　

孙佳蕊，马行川，陈仲栩，易　柳，刘　湘△，宁　勇　

（湖北中医药大学检验学院，湖北武汉４３００６５）　・　ｌ５１３　・　

摘　要：目的　探索从人类口腔黏膜上皮细胞中提取基因组ＤＮＡ方法的可行性。方法　分别采用煮沸法和碱裂解法从人　

口腔黏膜上皮细胞提取基因组ＤＮＡ，然后与临床常用的碘化钠（ＮａＩ）法提取的人全血基因组ＤＮＡ进行比较。结果　煮沸法和　

碱裂解法２种方法均能从口腔黏膜上皮细胞抽提到ＤＮＡ，提取的ＤＮＡ浓度虽低于ＮａＩ法，但用２种方法提取到的ＤＮＡ样品进　

行聚合酶链反应，均能获得满意效果，与常规ＮａＩ法无明显差异。结论从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组ＤＮＡ简便、快捷、无　损，在临床上具有潜在的应用价值。　

关键词：口腔黏膜上皮细胞；　基因组ＤＮＡ；　提取　Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１５．１１．Ｏ１４　文献标识码：Ａ　文章编号：ｌ６７３—４１３０（２０１５）¨１５１３－０３　

Ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｏｒａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　Ｓｕｎ　Ｊｉａｒｕｉ，Ｍａ　Ｘｉｎｇｃｈｕａｎ，Ｃｈｅｎ　Ｚｈｏｎｇｘｕ，Ｙｉ　Ｌｉｕ，Ｌｉｕ　Ｘｉａｎｇ　，Ｎｉｎｇ　Ｙｏｎｇ　

（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ，４３００６５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｏｒａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　

Ｔｈｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｂｏｉｌｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｏｒａｌ　ｍｕｃｏｓａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　

ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＮａＩ），ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｗｈｏｌｅ　ｂｌｏｏｄ．　

Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｏｒａｌ　ｍｕｃｏｓａ１　ｅｐｉｔｈｅｌｉａ１　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｂｏｔｈ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａ　ｌｏｗｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．　

Ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｍｏｎｇ　ａｌｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｃｏｎｃｌｕ。　

ｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｏｒａｌ　ｍｕｃｏｓａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｈａｒｍｌｅｓｓ，ｗｈｉｃｈ　

ｈａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｏｒａｌ　ｍｕｃｏｓａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ；　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　

基因组ＤＮＡ的提取是分子生物学检验工作的最基本技　

术。临床常用的方法有碘化钠（ＮａＩ）法、酚一氯仿法、Ｃｈｅｌｅｘ－ｌＯ０　法和试剂盒法等ｌ１　］。这些方法大多使用人全血作为提取　

ＤＮＡ标本，采样存在一定困难，如安全隐患和患者拒绝率较高　

等，同时这些方法成本比较高，操作较繁琐，试剂对人体具有一　

定的毒害性　］。因此，探索一种取材简便、操作快捷、成本较低　

的方法来采集、提取ＤＮＡ具有重要的临床意义。口腔黏膜上　

皮细胞的采集十分简便、快捷，不仅方便易得，而且无创，患者　

易于接受。已有研究表明，漱口液中提取到的ＤＮＡ数量与质　

量较理想　］，且口腔洗液及口腔黏膜上皮细胞的基因多态性　

检测结果与全血标本的ＤＮＡ分析结果完全一致　］。因此，　

本研究采用碱裂解法与煮沸法２种简易方法提取口腔黏膜上　皮细胞基因组ＤＮＡＥ　］，并将提取到的ＤＮＡ进行聚合酶链反　

应（ＰＣＲ），比较其与ＮａＩ法的优缺点，以探讨２种简易方法从　口腔黏膜上皮细胞提取基因组ＤＮＡ的可行性。　

１材料与方法　

１．１标本采集　

１．１．１　血液标本　取静脉全血５　ｍＬ于乙二胺四乙酸（ＥＤ—　

ＴＡ）抗凝管中，共计５Ｏ份，来自５０例湖北中医药大学体检学　

生中的健康志愿者。　

１．１．２　口腔黏膜上皮细胞的提取　口腔拭子均由上述５Ｏ例　健康志愿者提供。提供者使用温开水漱口后，用医用消毒棉签　

在颊黏膜两侧轻刮多次，置于装有生理盐水１．５　ｍＬ的ＥＰ管　中，多次搅动使棉签上的细胞尽可能多地脱落人生理盐水中。　

１．２仪器与试剂ＴＧＬ一１６Ｂ台式离心机购自上海安亭科学　

仪器厂，Ｃａｔａｌｏｇ＃１８６　１０９６ＰＣＲ扩增仪购自Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司，　ＪＹ６００Ｃ电泳仪购自北京君意东方有限公司，ＢｉｏＣａｐｔ凝胶成像　

分析系统购自法国Ｖｉｌｂｅｒ　Ｌｏｕｒｍａｔ公司。６　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＩ溶液、　

氯仿／异戊醇（２４：１）、异丙醇、７Ｏ　乙醇、生理盐水、５×ＴＢＥ　

（５４　ｇ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，２７．５　ｇ硼酸，２Ｏ　ｍＬ　５００　ｍｍｏＬ　ＥＤＴＡ）、细胞　

裂解液（１　ｍＬ　０．２　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ、４　Ｌ　２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ混　

匀）、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、５×Ｔａｑ缓冲液、１０　ｍｍｏｌ／Ｉ　ｄＮＴＰ、　

ＤＮＡ标记物（１（）（］～６００　ｂｐ）、上样缓冲液、琼脂糖等。　

１．３方法　１．３．１　ＮａＩ法提取人全血基因组ＤＮＡ　取自愿者血液２００　

Ｉ　于ＥＰ管中，编号，加入２００　Ｌ　ＮａＩ，振荡２～３　ｍｉｎ；加入　

４００　Ｌ氯仿／异戊醇，摇匀，１０　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１０　ｍｉｎ后，取上　

清４００　Ｉ　至新ＥＰ管，加入２００　Ｌ异丙醇，摇匀后１０　０００　ｒ／　

ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，弃上清；加入１　ｍＬ７０　乙醇，离心１０　ｍｉｎ，弃　

上清；加入ｄｄＨ　０，取５　Ｌ进行ＰＣＲ或电泳。　

１．３．２煮沸法提取人口腔黏膜上皮细胞基因组ＤＮＡ将装　

有口腔黏膜上皮细胞标本的ＥＰ管室温下１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３　

ｍｉｎ，弃上清；再加入５００　Ｌ生理盐水，１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３　

ｍｉｎ，弃上清；用生理盐水反复清洗３次以上，加入５Ｏ　Ｌ　５×　

ＴＢＥ，置于沸水中５　ｍｉｎ；取出后振荡２～３　ｒａｉｎ，再加５Ｏ　Ｌ　

ＴＢＥ，１２　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心３　ｍｉｎ，取上清于新ＥＰ管中备用。　

＊　基金项目：中国博士后科学基金面上项目（２０１４Ｍ５５２０２３）；湖北省自然科学基金面上项目（２０１４ＣＦＢ２２０）。　作者简介：孙佳蕊，女，在读　

本科生，主要从事分子生物学研究。　通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｎｇ２ｏｏ２２３Ｏ１＠１６３．ＣＯＩＴＩ。

　国际检验医学杂志２０１５年６月第３６卷第ｌ１期Ｉｎｔ　Ｊ　ＬａｂＭｅｄ，Ｊｕｎｅ　２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１１　

３讨　论　ＧＦＲ是评价ＣＫＤ患者病情、演变、转归、随访的重要手　

段，然而，准确及时地测量ＧＦＲ在临床上并不现实，目前认为　

测定ＧＦＲ的金标准是菊粉清除率法，但其测定时程序繁琐，不　

适于临床应用。核素检查虽然准确但因价格较贵而不适合门　

诊随访。　

有研究证实，利用ｃｒ、年龄、性别等指标，计算得出的ｅＧ—　ＦＲ，能较好地反映ＧＦＲ水平　］。故各种基于ｃｒ的ｅＧＦＲ估　

算方程相继被提出以弥补ＧＦＲ本身监测不便的不足，本文以　

２００８年美国ＣＫＩＴＥＰＩ开发方程计算ＧＦＲ，同ＣＫＤ患者生化　

指标比较，并与通过简化ＭＤＲＤ和中国人校正的ＭＤＲＤ方程　

估算的ＧＦＲ比较。结果显示：（１）ＣＫＤ患者中，其ＥＰＩ　ＧＦＲ　

与Ｃｒ、ＵＡ、ＣｙｓＣ、Ｐ、２４　ｈＵＰ呈显著负相关（Ｐ＜０．０５），与Ｈｂ　

差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５），呈显著正相关，随着病程进展，　

ＧＦＲ逐渐下降，患者贫血也逐渐加重，ＡＩ　Ｂ、Ｃａ出现不同程度　

的下降，与文献报道一致　］。ｃｒ、ｕＡ、ＣｙｓＣ、ＡＬＢ、Ｃａ、Ｐ、Ｈｂ、　

ｕＰ等这些指标与ＧＦＲ的联合分析，提高了对ＣＫＤ早期损伤　

的检出率及对病程进展的判断，使对患者的诊治更加全面合　理。（２）简化一ＧＦＲ和校正一ＧＦＲ与ＥＰＩ—ＧＦＲ的相关性均较好　

（ｒ分别为０．９９７和０．９９５，Ｐ＜０．０５），提示由３种公式计算所　

得的ｅＧＦＲ一致性好。ＥＰＩ—ＧＦＲ比简化一ＧＦＲ平均值高约　

０．４９　ｍＩ　／（ｍｉｎ×１．７３　ｍ　），比校正一ＧＦＲ平均值低约０．８１　

ｍＬ／（ｍｉｎ×１．７３　ＩＴ＊　）。提示简化ＭＤＲＤ公式总体高估了　

ＣＫＤ的患病率，而校正ＭＤＲＤＧ公式则低估了ＣＫＤ的患病　

率，ＥＰＩ　ＧＦＲ正好弥补了前者过度治疗和后者降低诊断的缺　

陷。（３）简化一ＧＦＲ、校正一ＧＦＲ与ＥＰＩ—ＧＦＲ对ＣＫＤ分期的一　

致性好（Ｋａｐｐａ值分别为０．９０８、０．９０４），有部分肾病患者通过　

ＣＫＩ）＿ＥＰＩ方程得到的分级，比通过简化ＭＤＲＤ方程和校正　

ＭＤＲＤ方程得到的ＧＦＲ分级早期要低，晚期则高。　

因此以ｃＫＤ－ＥＰＩ开发方程计算ＧＦＲ，对ＣＫＤ患者肾功　

能的损伤评价有较好相关性及较好的预测能力，能进行更好的　

风险预期，与传统的ＧＦＲ的相比测定简便易行，可弥补其它评　估方程导致的过度治疗或降低诊断的缺陷，为ＣＫＤ分期提供　了极大便利，可在临床常规　肾功能检测中推广使用，为临床治　

疗提供及时、方便、准确的参考。　

参考文献　

［１］　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　Ｇｌｏｂａｌ　Ｏｕｔｃｏｍｅｓ（ＫＤＩＧＯ）Ｗｏｒｋ　

Ｇｒｏｕｐ．ＫＤＩＧ０　２Ｏ１２　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｋｉｄｎｅｙ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ，２０１３，　３（１）：１—１５０．　［２］Ｌｅｖｅｙ　ＡＳ，Ｓｔｅｖｅｎｓ　Ｉ　Ａ，Ｓｃｈｍｉｄ　ＣＨ，ｅｔ　ａ１．Ａ　Ｆｌｅｗ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｅｓｔｉ—　ｍａｔｅ　ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ［Ｊ］．Ａｎｉｌ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ，２００９，１５Ｏ　

（９）：６Ｕ７—６０４．　［３］全国ｅＧＦＲ课题协作组．ＭＤＲＤ方程在我国慢性肾脏病患者中的　改良和评估［Ｊ］．中华肾脏病杂志，２００６，２２（１０）：５８９—５９５．　［４］贾珂珂，杨硕，乔蕊，等．６种基于血肌酐的肾小球滤过率估算公式