生物技术大实验操作指南
注意事项
1、工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。
2、用电、气安全注意事项。
3、节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。
4、实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。
5、实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。
实验一鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取）
一、原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加
一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。
二、试剂与设备：TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit，
氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。
三、步骤：
1、新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆，
RT 5-10 Min。
2、加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。
3、4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。
4、加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。
5、加1ml 75%乙醇洗涤沉淀2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干
3-5Min。
6、50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。
7、检测RNA纯度与浓度。
四、结果
五、讨论
实验二溶菌酶基因第一链cDNA合成
一、原理：mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转
录合成cDNA，此cDNA为单链。
二、试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离
心机。
三、步骤：
1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
总RNA 或Poly(A)+ RNA或特异性RNA Xμg
Oligo dT (0.5μg/μL) (20 pmol) 1μL
RNase free ddH2O 定容至12μL
2. 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴30 s，然后
离心3~5 s。
3．将试管冰浴，再加入如下组分：
5×Reaction Buffer 4μL
RNase Inhibitor ( 20 U/μL) 1μL
dNTP Mix(10 mmol/L) 2μL
M-MuLV RT（200 U/μL）1μL
注：若5×Reaction Buffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。
4．轻轻混匀后离心3~5 s。
5．在PCR 仪上按下列条件进行反转录反应cDNA 合成42℃ 30-60 min
6.终止反应95℃ 5 min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20℃保存。
* M-MuLV RT酶最后加。
四、结果
五、讨论
实验三鸡溶菌酶基因的PCR扩增
一、原理：利用耐热Taq酶（一种DNA聚合酶），以四种dNTP为底物，
在引物的诱导下，经过变性、退火、延伸三步反应，体外合成DNA双
链分子。
二、试剂与设备：2X PCR Plus MasterMix，ddH2O，模板，上、下游引物，
掌上离心机，PCR仪。
三、步骤：
1、反应体系如下：
模板DNA （第一链cDNA）X ul（＜1ug）
引物1（10 uM） 1 ul
引物2（10 uM） 1 ul
2X PCR Plus MasterMix 12.5ul
ddH2O 10.5-X ul
Total 25 ul
如果体系变化，可按此比例添减。
2、PCR反应条件：
95℃ 5 Min
95℃ 30Sec
56错误！未找到引用源。30Sec 30 Cycles
72错误！未找到引用源。30Sec
72错误！未找到引用源。10Min
3、结果检验取3-8ul，PCR产物，1%Agarose 电泳。（切下目的条带-20错
误！未找到引用源。保存）
四、结果
五、讨论
实验四PCR产物的回收纯化
一、原理：PCR产物经过琼脂糖电泳分离，切取含目的产物的胶条，用胶回
收试剂盒回收。
二、试剂与设备：DNA胶回收试剂盒，TBE电泳Buffer，琼脂糖，Goldview
染料，2000 DNA Ladder，无水乙醇，TE或ddH2O，恒温水浴锅，水平电泳仪，高速冷冻离心机等。
三、步骤：
1、通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术
刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 ml离心管中，称重。
2、根据胶块的重量和浓度，按每100 mg琼脂糖（如胶块不足100 mg则用水补充
至100 mg）加300- 600 μl的比例加入Binding Buffer II。
3、将离心管置于55℃水浴5-10 min，间或混匀，直至胶块完全溶化。
4、当目的片段< 500 bp时，加入所使用的Binding Buffer II 1/3体积的异丙醇，混
匀。当目的片段≥ 500 bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤5。
5、将溶化好的溶液全部移入吸附柱，室温放置2 min，8,000 rpm 离心1 min。倒
掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
6、向吸附柱中加入500 μl Wash Solution，10,000 rpm 离心1 min。倒掉收集管中
的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
7、重复步骤6一次。
8、将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000 rpm 离心2 min
9、将吸附柱放入干净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入30-50 μl Elution
Buffer，室温静置1-2 min，12,000 rpm 离心1 min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
四、结果
五、讨论
实验五PCR产物-T载体连接与扩增
一、原理：T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体，该载
体的3’端具有突出的“T”末端；DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的A，T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到T 载体中，形成含有目的片断的重组载体，该载体即可导入宿主菌扩增。
二、试剂与设备：T-载体，目的DNA片段，掌上离心机，冰瓶(低温恒温仪)等。
三、步骤：
1、反应体系在0.2 ml PCR管中配制下列连接体系：
反应组分10 μl 反应体系
插入的目的片段X μl（0.2 pmol）
pUCm-T Vector 1 μl（50 ng）
10×Ligation Buffer 1 μl
50% PEG 4000 1 μl
T4 DNA Ligase 1 μl
Sterilized ddH2O 补足至10 μl
（一般最后加入T4 DNA Ligase。）
2、16℃连接1-12 h（建议连接过夜）。
3、连接产物转化进感受态细胞，涂板培养，挑选/鉴定阳性克隆；或将连接产物-20℃保存。
四、结果
五、讨论
实验六感受态细胞的制备与转化
一、原理：受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞；细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
二、试剂与设备：LB培养基，0.1M CaCl，冰水，平皿，试管，恒温水浴锅，低温冷冻离心机，无菌工作台等。
三、步骤：
（一）感受态细胞的制备:
1．前一晚接种受体菌（DH5α或其他），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）。
2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB（1：100）培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm），直至OD600为0.4-0.6。
3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作。4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟。
5．4℃下3000g冷冻离心5分钟。
6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟。
7．4℃下3000g冷冻离心5分钟。
8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。
9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
（二）细胞转化：
1、将100 μl感受态细胞置于冰上解冻后，加入实验五的连接液10 μl，轻轻混匀，冰上放置30 min。
2、42°C水浴热激90 sec，再冰上放置5 min。
3、加入800 μl LB液体培养基，37°C振荡培养1 h。
4、4000 rpm离心3 min，用枪头吸掉750 μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
5、将细菌悬液均匀涂布在含100ug/ml 氨苄青霉素抗性的LB平板上（也可再加含20 μl 100 mM IPTG 和100 μl 20 mg/ml X-gal）。
6、将平板于37°C培养1 h，然后倒置培养过夜。
8、用接菌环或牙签或小枪头挑取白色菌落，用基因特异性引物进行PCR扩增，
确认载体中插入片段的长度大小。或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37°C培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。
四、结果
五、讨论
试验七质粒的小量提取（碱裂解法）
一、原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱使细胞破裂，质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而蛋白质和染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
二、试剂与设备：溶液I：50 mM葡萄糖+ 25 mM Tris-Cl + 10 mM EDTA，pH 8.0，灭菌，RT保存；溶液II（用10M NaOH 临用是配），0.2 N NaOH + 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾+ 2 M 醋酸，灭菌后RT保存；STE，10mmol/LTris －HCl，1mmol/L EDTA，0.1M NaCl，pH8.0，灭菌后RT保存；TE，100mmol/LTris －HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0，灭菌后RT保存（最好含RNA酶20μg/ml）；75%乙醇；HCl；碎冰块；低温冷冻高速离心机，恒温空气摇床，水循环真空泵。
五、步骤：
1、无菌操作台上，取37℃过夜培养菌体OD600=1.0，1.5ml于离心管（Eppendorf 管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以4000rpm离心5－10min，弃上清液，加400ul，STE洗涤2次，弃上清，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。
2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，剧烈振荡，充分混合。冰浴5min。
3、加入200μl溶液II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。
4、加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴3-5 min 。
5、4℃，12000rpm 离心10min，上层水相于另一新Eppendorf管中。
6、加入等体积酚/氯仿（1：1）或酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）振荡混匀，以4℃，12000rpm，离心10min。
7、吸上层水相至一新的离心管，加等体积的氯仿，振荡混匀，离心同上。
8、小心移出上清于一新Eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，温和混匀，RT 10-30 Min，4℃离心12000rpm，10-15min，收集沉淀。
9、70-75%乙醇洗涤沉淀1-2 次, 每次1.0ml，如上离心2Min，离心管开盖倒扣在吸水纸上，室温下晾干（5-10Min），最好用真空泵抽掉残留酒精。
10、加入50μl TE缓冲液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。
五、结果
六、讨论
实验八质粒DNA酶切鉴定与回收
一、原理：本实验采用ECoRⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒PMD18-CHL YZ或
其它重组的克隆质粒，酶切后产生大小不同的2个片段，大片段来自质
粒载体，小片段为目的基因。
二、试剂与设备：ECoRⅠ，BamHⅠ，10×K Buffer，TBE或TAE 电泳Buffer，
琼脂糖，恒温水浴锅，水平电泳仪等。
三、步骤：
1、酶切体系20ul
ECoRⅠ0.2ul
BamHⅠ0.2ul
重组质粒10ul
10×K Buffer 2ul
ddH2O 7.6ul
Total 20 ul
加样毕，混匀，低速离心30 Sec，37℃-，2-6hr。
2、检测
1% 琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，称重，放Eppendorf，-20℃保存。
四、结果
五、讨论
实验九原核表达载体的构建
一、原理：同时用酶ECoRⅠ和BamHⅠ，分别消化处理目的Chly-T载体和pET32
质粒载体，回收Chly基因和pET32a大片段，产生的粘性末端，可以在T4 DNA Ligase 作用下，再次连接成完整的质粒，该质粒可以转化导入细胞（宿主体内），随宿主体在内扩增和表达。
二、试剂与设备：pET32质粒，chlyz基因，T4 DNA Ligase，10× T4 DNA Ligase
Buffer，16℃恒温水浴锅或冰瓶或PCR仪。
三、步骤：
1、质粒和基因的酶切消化：操作参考实验八，质粒和基因分开酶切。
2、质粒和基因的回收：参考实验四，质粒和基因分开回收。
3、基因与载体的连接：酶切回收相关基因，用T4 Ligase 16度连接过夜，次日转化，37℃培养，挑阳性克隆，鉴定。
Bam HⅠ/EcoR 双酶切Bam HⅠ/EcoRⅠ双酶切
4、鉴定方法：可提质粒酶切或PCR鉴定。保存阳性克隆，以备后续表达实验。
四、结果
五、讨论
实验十鸡溶菌酶的原核表达
概述
随着功能基因组研究的不断深入，需要将大量已克隆的基因在模式细胞中获
得高效表达进而研究这些基因产物的结构与功能。众所周知，大肠杆菌是现代分子生物学研究中最常用的材料之一，不但已经掌握了它的分子生物学和分子遗传学方面的大量资料，而且在基因表达方面也有深入的了解，因此很自然大肠杆菌便被选作表达外源基因的常用寄主细胞。早期的研究工作己表明，要使己克隆的外源基因能在细菌细胞中成功表达，就必须使基因置于寄主细胞的转录和转译机制的控制之下。在大肠杆菌细胞中参与特定新陈代谢的基因，往往成簇集结成一个转录单位即操纵子，其中主要的控制片段是位于其起始部位的操纵序列和启动子。在基因表达过程中，操纵子先转录成多顺反子mRNA，然后转译出多肽分子。已克隆基因在大肠杆菌细胞中的表达，如同正常的基因表达程序一样，也包括DNA分子的有效转录和mRNA分子的有效转译这两个主要步骤，在某些情况下还涉及到表达产物蛋白质分子的转译后修饰问题。
1974年，Chang和Cohen证实金黄色葡萄球菌的A mpr基因能够在没有亲缘关系的大肠杆菌中实现功能表达，因而人们期望从基因到表型的生化途径也与遗传密码一样是通用性的，并据此设想任何细菌的基因也都能够在别种细菌中表达。随后St ruhl 等人和Vapnek 等人(1977)又相继发现，两种比较低等的真核生物酿酒酵母和粗糙链抱菌的基因，也能够在大肠杆菌中表达。这样便进一步证实了人们的上述想法。基于这样的原因，研究工作者们纷纷推测，更高等的基因也应该能够在细菌中实现表达。但后来有越来越多的研究报告指出，不少己克隆基因事实上并不能够在新的遗传背景中实现表达。对此的一种解释认为，是由于从基因到表型的过程中有若千步骤发生障碍的缘故。一种功能蛋白的合成，不但取决于适当的基因转录及随后的mRNA有效转译，而且在许多情况下，还同转译后的加工和新生多肤的装配有关。在这过程中只要有一个步骤未能正确地进行，有关基因也就不能实现其功能表达。克隆序列的转录必须有一个能被寄主RNA聚合酶识别的启动子，而mRNA的有效转译则必须有核糖体的结合位点。蛋白质转译后修饰的一个共同特点是信号序列引导蛋白质分子穿过细胞膜。另一可能与蛋白质成功表达有关的现象是蛋白质的降解作用。已经知道在大肠杆菌中，凡是发生了无义突变的基因，它们所编码的短肤链在合成后不久，就会被降解掉，与此相反野生型的蛋白质则十分稳定。可以设想如果外源蛋白质的分子构型或其氨基酸序列，不能保护它们自己免受胞内蛋白酶的作用，则新生蛋白很快就会被迅速地降解掉。
研究克隆基因表达的成果，对于某些研究领域有着重要的用途。首先有可能为揭示蛋白质结构与功能之间的关系提供新的研究手段。例如运用DNA技术，能够获得可在大肠杆菌细胞中进行有效表达的杂种干扰素。这样便可以将这种蛋白质分子纯化出来，在体外进行生物学方面的研究。运用DNA技术还可以用来
检测体外突变所产生的变异氨基酸在蛋白质多肤链中的位置，并测定出因这种改变对于酶催化功能的效应。在实际应用方面，基因克隆和表达技术也有着不可忽视的重要性。应用重组DNA技术产生的蛋白质，在医药卫生、食品工业等方面的实用价值及其前景也是十分诱人的。在今天几乎所有生物科学领域都受到此项技术的影响。
体外表达目基因，纯化出重组蛋白是研究蛋白质结构与功能、蛋白—蛋白、蛋白—核酸间的相互作用，制备抗体及突变研究等的基本技术，也是基因克隆的目的所在。目前蛋白质表达的方法大多是将编码所需产物的基因插入表达型质粒或其他载体，然后将该载体导入细胞。典型的表达载体除具有一般克隆载体的特征外还包含指导相应mRNA大量合成的启动子、允许其在宿主体内自主复制的序列和能增强mRNA翻译效率的序列。
一、目的：1.学习原核细胞中目的基因表达所需的条件
2.认识常用的表达载体。
二、原理
提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z, Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、乳糖通透酶和乙酞基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因Ⅰ。Ⅰ基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成Lac的操纵子的调节去。三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。该操纵子有正负两种调节机制，LacⅠ编码的阻遏蛋白的负调节，和cAMP-CAP的正调节。CAP 必须和cAMP形成复合物才能结合于DNA。在环境中有葡萄糖的情况下，细菌不会利用象乳糖这样的碳源，细胞的cAMP水平下降，不利于形成cAMP-CAP。阻遏蛋白有2个结合位点，一是操纵基因结合位点，二是诱导物结合位点。如果没有诱导物，阻遏蛋白就以活性状态结合于操纵基因，抑制结构基因转录。其诱导物就是β-半乳糖苷，结合于阻遏蛋白后，使其失活，从操纵基因脱落，导致结构基因得以正常表达。如果环境中仅有β-半乳糖苷该种碳源，LacZYA就被激活。在没有乳糖存在时，Lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，Lac操纵子（元）即可被诱导，这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
IPTG是乳糖的结构类似物，可以与乳糖操纵子的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，保证基因转录的进行。与乳糖不同的是IPTG不会被半乳糖苷酶水解，不受到负反馈调节的抑制，使转录持续进行下去。
三、实验设备：1．恒温摇床；2.高速冷冻离心机；3．恒温水浴锅；4.牛皮纸
和棉纸；5.接种环和涂菌棒。
四、实验试剂：
1，含重组表达质粒的大肠杆菌（pET系列，购自Invitrogen）；2，LB培养基；
3，10mmol/L IPTG；4. 1×样品缓冲液；5．100 mmol/L DTT；6．2%SDS；7. 0.1%溴酚兰；8. 10%甘油；9.限制性内切EcoRI 和BamHI；10.目的基因
Lysozyme ChLyz
11. 10mg/ml 氨苄青霉素和卡那霉素。
五、操作
1.用限制性内切酶EcoR I 和BamH I 分别对载体pET28a和目的基因ChLyz（鸡溶菌酶）分别进行双酶切，胶回收试剂盒回收纯化载体大片段和目的基因；后连接入表达载体pET28a并转化到相应宿主菌中，筛选出含有重组子的转化菌株，提取质粒DNA进行酶切分析或DNA序列测定，以确定是否为重组子。
2.真核基因的诱导表达和检测
（1）挑取含重组子的阳性单菌落，接种于3ml LB培养基中，37℃摇培过夜。（2) 取5ul 培养物于2m1含适当氨苄青霉素或卡那霉素（根据载体选择合适抗生素）的LB液体培养基，37℃培养2hr，至菌液A600=0.6-0.8。
（3) 加IPTG至终浓度为0.5-lmmol/L，继续培养3-5 hr。
（4) 取上述培养液1.5m1，12000rpm离心l min。
(5) 沉淀加入100 ul 1×样品缓冲液振荡悬浮。
（6）100℃加热5min, 12000 rpm，40℃离心l 0min。
（7）取上清进行SDS-PAGE。鉴定目的基因是否表达。
六、注惫事项
1，本实验可能涉及两种与目的DNA连接的载体，弄清它们在性质和功能上的区别。
2，双酶切过程与前面的步骤相同，进行实验时还须借鉴之前的经验。
七、思考题
1．真核基因在原核细胞中表达需要哪些条件？
2．如何防止外源表达蛋白不被宿主细胞降解？
实验十一表达产物鉴定—SDS-PAG（凝胶电泳法鉴定目的蛋白质）
一、目的、
1.掌握SDS-PAGE电泳分离鉴定蛋白质的原理。
2.学会SDS-PAGE电泳分离鉴定蛋白质技术。
二、原理
SDS-PAGE为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。是以聚丙烯酰胺为支持介质，对蛋白质进行分离与鉴定。电泳是指带电的胶体颗粒在电场中移动。胶体分子具有一定大小的分子半径，不同的胶体可以吸附大量的电荷，从而带上正电或负电，在电场力的作用下向与其电性相反的方向移动。蛋白质常以颗粒状态分散在溶液中。在电场中，根据它们所带净电荷向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电荷的极性。
蛋白质一般是由不同数量和比例的20余种氨基酸组成的两性电解质分子。所
带电荷的性质和多少随所处环境pH的变化而变化。从电泳的观点来看，蛋白质分子最主要的特征就是它的带电行为。每一种蛋白质分子都处于一定的pH环境中，它的氨基酸侧链基团或解离质子，从而带正电或带负电。在某一特定pH环境中，不同蛋白质分子的带电情况不同，所受电场力有差别，因而在电泳行为上也就会出现差异。再加上各种蛋白质在分子量、三维结构上的不同，3个因素共同影响了蛋白质电泳的涌动速率。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酞胺（Acr）和交联剂N, N一甲叉双丙烯酰胺（Bis）在引发剂过硫酸铵（AP）和加速剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联成三维网状结构的。凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎。反之凝胶稀软，不易操作。交联度过高，凝胶不透明缺乏弹性，反之凝胶成糊状。凝胶浓度的正确选择尤为重要，如果凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶；如果凝胶浓度太低，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着缓冲液迁移而不能分开，因此不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
SDS-PAGE采用由浓缩胶与分离胶组成的不连续的凝胶系统。浓缩胶的胶浓度低，孔径大，而分离胶浓度则较高，孔径小。首先，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中涌动时受到的阻力小，移动速度快。当进入小孔胶时，蛋白质颗粒受到的阻力大，移动速度减慢，因而在两层凝胶的交界处，就会由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移突然受阻而被压缩成很窄的区带。即在蛋白样品进入分离胶后，以各自迁移速率的不同而彼此分离。
如果样品和聚丙烯酞胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS )和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于蛋白亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂如β-疏基乙醇和二硫苏糖醇（DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在蛋白质样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子解聚成亚基，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合，形成带负电的蛋白质亚基-SDS复合物。SDS蛋白质复合物所带的负电荷大大超过了大蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同种类蛋白亚基间原有的电荷差异，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，电泳迁移率仅仅取决于蛋白质分子质量。
SDS-PAGE凝胶电泳所需仪器设备较简单，操作方便，重复性好，且不需非常纯的样品，因而被广泛用于蛋白质相对分子质量测定及蛋白质纯度鉴定。
三、实验器材
1.微型凝胶电泳装置
2.三恒稳压稳流电泳仪
3. pH计
4.高速冷冻离心机
5．水平摇床
6．微量取液器（吸头）
7.微量注射器
8.10ml注射器
9.1.5m1离心管
10.50m1离心管
四、实验试剂
1.含重组子的大肠杆菌
2.蛋白提取液：25mmol/L Tris-HC1 (pH7.5 )、10mmol/L KCI, 20 mmo1/L MgCl2, L mmol/L DTT, 1 mmol/L PMSF（现用现加）
3.蛋白溶解液：0.0625mmol/L Tris-HCl (pH7.5 )、2%SDS, 10%甘油、5% β-疏基乙醇、0.001% 溴酚兰。
4.电泳储存液
5．2mo1/I Tris-HCl（pH8.8），100m1
6．lmol/1 Tris-HCl（pH6.8），100m1
7. 10%SDS，100m1
8.50%甘油：量取50m1 100%的甘油，加入50ml ddH20。高压灭菌，备用。
9. 1％溴酚兰：称取100mg溴酚兰，加ddH20至loml，搅拌直到完全溶解，过
滤去除聚合的染料。
10.考马斯亮蓝染液：称取考马斯亮蓝G250 1g，加450ml 乙醇，100ml 冰乙酸、450ml ddH20。
11.脱色液：乙醇250ml , dd H20 675 ml，冰乙酸75ml。
五、操作
1.去1.5ml 表达菌液，10000rpm 4℃离心10Min，加1×上样Buffer重悬，100℃煮沸10Min，10000rpm 4℃离心10Min，取上清电泳。
如果是提取的纯化蛋白则按下述制样（提取的蛋白质样品最终溶解在1样品缓冲液中，故应事先计算好缓冲液的用量及稀释倍数。关于蛋白质样品的终浓度，由于电泳仪器与凝胶厚度对样品承载量有不同的限定范围。一般而言，可以将蛋白质烘干，称量出100-1000mg，溶解于50-100 u1的l×样品缓冲液中）。
2.电泳操作
①灌制分离胶：装配好灌胶用的模具。将分离胶装配在一个小烧杯中，操作时必须戴手套。加入AP和TEMED后，轻轻混匀不要产生气泡，否则会干扰聚合。小心将凝胶缓慢加入模具中，注意在凝胶中不能产生气泡。凝胶液加至距前玻璃版（较短的玻璃板）顶端约1.5cm处，轻轻在胶面上铺盖一层5mm的水。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面，将水层吸净。
②灌制浓缩胶：将凝缩胶配制在小烧杯中，用移液枪将浓缩胶加至分离胶的上面，直至前玻璃板的顶端，并插入梳子，确保梳子齿的末端没有气泡。凝胶聚合后，将凝胶板装入电泳槽内。加入电泳缓冲液，拔去梳子。
③蛋白样品的处理：
A．蛋白样品的变性：100℃ 5min o
B．10000 rpm 4℃离心5min。
C．用微量注射器将样品加入样品孔中。
④电泳：电泳仪与电源相接，电流应流向阳极。可采取稳压或稳流。当溴酚兰的前沿迁移至凝胶的底部时，关闭电源。然后将胶剥离在培养皿中（预先加上固定液），测量溴酚兰的迁移距离。
3.染色：立即将电泳后的凝胶放入考马斯亮蓝溶液中染色20-30 min。然后换用脱色液脱去底色，直到蛋白质清晰为止。
六、注意事项
1．固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
2．凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。3．凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
4．样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。
5. 要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。
6. 注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。7．为避免边缘效应，最好选用中部的孔加样。
8．剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
9．水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。
七、思考题
1．请思考PAGE凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度关系？
2．依据SDS的作用原理，请思考计算所分离出的蛋白代的分子量是天然蛋白质的分子量吗？
3．在SDS-PAGE测定蛋白质分子量时，必须加入过量的SDS和疏基试剂，为什么？
实验十二重组蛋白的分离纯化
近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白己经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达，这样纯化相对容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈。重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为：（1)细胞外的分泌表达；(2)细胞内可溶性表达；(3) 细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式存在。因此，对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。例如，当重组蛋白以包涵体形式存在时，就需要对包涵体进行变-复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白，其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。当前蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序，以获得较高纯度的制品。
今后重组蛋白的分离纯化的技术发展，将朝着快速，高分辨率，高上样量，易于操作，低成本和自动化等技术方向发展。
一、目的
1．掌握色谱纯化-复性蛋白质的原理。
2．熟悉蛋白质色谱纯化-复性的操作过程。
二、原理
将目的基因连接在表达载体后，通过IPTG诱导目的基因表达。表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个His编码序列，便于蛋白的亲和层析纯化。亲和层析以蛋白质或生物大分子和结合在介质上的配基间的特异亲和力为基础。
本实验采用结合了Ni2+的介质在变性条件下对融合蛋白进行分离纯化，只需
通过“结合-清洗-洗脱”三个简单的操作步骤就可完成。
也可以采用凝胶层析法(gel filtration)就是利用层析凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法或排阻层析法（层析原理见生物化学有关内容)。
三、溶液配制：
GuNTA-0 Buffer: 20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5 M NaCl, 10％Glycerol，6M Guanidium HCl。
GuNTA-20 Buffer：20 mM Tris-HCl PH 7.9, 0.5 M NaCl, 10％Glycerol，6M Guanidium HCl ，20 mM Imidazole。
GuNTA-40 Buffer: 20 mM Tris-HCl PH 7.9, 0.5 M NaCl, 10％Glycerol，6M Guanidium HCl ，40 mM Imidazole。
GuNTA-60futer: 20 mM Tris-HCl PH 7.9, 0.5 M NaCl, 10％Glycerol，6M Guanidium HCl ，60 mM Imidazole。
GuNTA-100Buffer: 20 mM Tris-HCl PH 7.9, 0.5 M NaCl, 10％Glycerol，6M Guanidium HCl ，100 mM Imidazole。
GuNTA-500 Buffer: 20 mM Tris-HCl PH 7.9, 0.5 M NaCl, 10％Glycerol，6M Guanidium HCl ，500 mM Imidazole。
5m1注射器若干；层析管；高速离心机；层析架、收集器；Sephadex G-75葡聚糖凝胶；二硫苏糖醇（DTT），磷酸Na；透析袋。
四、操作步骤
1.重组蛋白表达，见实验10。
2.收集细菌（每组50-100m1,分两次收集），5000 rpm 4℃离心3min。0.01M pH 7.2 PBS缓冲液清洗2，同样条件离心后再次收集菌体。
3．破细胞每10 ml 菌液的菌体加入1-2 ml 结合液悬浮。加入溶菌酶4 u1 (100mg/L），使得终浓度为1mg/ml，放置冰浴中30-60min充分酶解，超声破碎。5000 rpm 4℃离心5min，收集上清液4℃贮存，接下一步层析纯化。
4. 如果是包涵体表达，则步骤3 离心后，去上清，留沉淀，洗涤（洗涤液1：60 mM EDTA，4% Triton X-100，1.5 M NaCl，PH7.0；洗涤液2：0.1 M Tris-Cl，20 mM EDTA, 2M Urea, PH7.0 各洗2次），最后用包涵体溶解液溶解（0.1 M Tris-Cl, 8 M Urea，5 mM DTT, PH 8.0），RT 4-5h，或冰箱中过夜。
（一）、Ni 柱法
5.将4 的液体12000 rpm 4℃离心20 min。弃细胞碎片与沉淀，取上清用于过柱。
6.过Ni 柱
1）将NTA 树脂装入合适的层析柱，层析柱用10倍NTA 体积的GuNTA-0 Buffer 洗。
2) 将样品（见步骤2 或5）加到NTA 层析柱中，流速控制在15 ml/小时左右，收集流出液，用于SDS-PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/小时左右。
4）用5倍NTA体积GuNTA-500 洗脱，流速控制在15 ml/小时，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5) 纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段透析复性（尿素浓度渐减）或稀释复性。最后离心，收集上清。
（二）、排阻层析（凝胶层析操作，见生物化学实验）
1)凝胶准备
2）装柱
3）平衡
4)上样
5）洗脱，收集
7．样品检测SDS-PAGE估计分子量和纯度，活性检测。
五、结果
收集蛋白质的检验和判断，通过SDS-PAGE电泳鉴定，或根据其生物学特性分析。
六、讨论
实验室十三重组鸡Lysozyme蛋白活性鉴定
抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选有效的杀菌防霉剂，也用于耐药菌和敏感菌的筛选与鉴定。
一、目的掌握常用抑菌物质的筛选和鉴定的原理和方法。
二、原理抑菌圈法即水平扩散法。是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。
三、实验设备和试剂
超净工作台，恒温摇床，培养皿，无菌吸管（或针筒），圆片滤纸（φ1cm），无菌水，φ0.45um微孔滤膜，镊子，接种针（环），熔化状态的琼脂培养基（最好保温于45℃左右水浴中），75%酒精棉球，尺子；
一定浓度的纯化Lysozyme溶液，LB液体培养基，供试验用的菌种G+和G-菌各1-2株：大肠杆菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌等。
四、实验步骤
1.菌体培养：用接种环挑取保存的菌种，转接于2ml LB培养基，37℃培养过夜，
次日按1：50转接于5ml新鲜LB培养基1-2次，培养至对数期。
2.用麦氏比浊管，调整菌体浓度至1.0×106细菌数/ml备用。
3.向各培养皿内注入15-20 ml的熔化状琼脂培养基（约45℃），将菌液与培养
基混合均匀，待其冷却。
4.用镊子将圆片滤纸在不同浓度的Lysozyme中浸渍片刻，取出置于带菌培养
基平板的中央，盖上盖子.
（或直接在凝固的琼脂平板上打孔，φ 0.8 cm）
5.37℃倒置培养18-24 hr，观察滤纸片圆片或孔径周围抑菌圈的有无及大小。
五、结果
结果评判：由于滤纸圆片所吸附的药液慢慢向四周扩散，因此在滤纸片的周围就出现清晰的抑菌圈（加入抑菌剂对供试菌有抑制效果）。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。此法同样适合于测定单个菌的抗菌效果。
六、讨论：
七、注意事项
1.所有的操作用具和材料都要事先做灭菌处理，操作必须在无菌室（或无菌箱）
内于火焰旁进行。
2.霉菌、细菌、酵母菌等各种微生物都必须分别配置混合菌液，即这里指的混
合菌液是霉菌或酵母菌等诸种菌的分别混合液，并非霉菌、细菌和酵母菌的混合液。
3.混合菌液的浓度一般为106-108cfu/mL.
4.倒入培养皿的琼脂培养基温度不能太高（一般为45℃左右），否则会引起微
生物死亡。也不能太低，因为琼脂会很快凝结，以致搅拌不均匀，影响试验结果。
5.各种微生物的最适生长温度不同（例如霉菌一般为25-30℃，细菌一般为
32-37℃等），恒温培养时宜分开放置。
高中生物实验设计的一般程序 高中生物实验设计1.1明确实验目的;1.2分析实验原理;1.3选择材料用具;1.4设计实验步骤;1.5预测实验结果; 6观察收集数据;1.7分析推理得出结论。 很多同学疑惑，生物大题都是从哪里冒出来的？每次做题感觉似曾相识，但是填空却一个也答不上来，其实这些生物大题的出题根源都是生物教材上的实验改编而成的！大家只要记住教材上上的实验细节，还愁答不上题吗？(马上点标题下蓝字"高中生物"关注可获取更多学习方法、干货) 观察类实验 在此类实验中常综合运用显微观察技术、染色技术、玻片标本制作技术等。归类如下： 实验名称观察方式观察对象显微镜玻片标本染色剂生物材料观察叶绿体原色观察叶绿体高倍临时装片无菠菜叶观察细胞 质流动细胞质(以叶绿体作参照)高倍临时装片无黑藻 嫩叶 观察质壁分离与复原紫色大液泡高倍临时装片无洋葱 表皮 观察有 丝分裂染色观察染色体高倍临时装片龙胆紫 (醋酸洋红)洋葱根尖脂肪的鉴定脂肪高倍切片→临时装片苏丹Ⅲ或
苏丹Ⅳ染液花生种子 鉴别类实验 在此类实验中，常利用某种试剂对生物体或细胞中成分进行鉴别.针对不同的鉴别对象，采用不同的试剂。归类如下： 实验名称鉴定对象试剂颜色水浴加热生物材料生物组织中糖类的鉴定淀粉碘液蓝色无脱色的叶片还原糖斐林试剂 (班氏试剂)砖红色需要(加热煮沸)含糖量高的白色或近白色的植物组织、尿液、血浆 蛋白质 的鉴定蛋白质双缩脲试剂紫色无豆浆、牛奶、鸡蛋清、蛋白质类酶DNA粗提 取与鉴定DNA二苯胺试剂蓝色需要(加热煮沸)鸡血细胞实习和研究性课题 此类实验常通过调查法，调查法中常使用统计技术和测量技术。实习、研究性课题调查对象统计方法计算公式种群密度的 取样调查动物标志重捕法 植物样方法 调查人群 中遗传病人类某种遗传病汇总法 调查环境污染 对生物的影响环境污染程度汇总法
《生物技术大实验》课程教学大纲 课程编号：0803013 课程总学时/学分：54/3（其中理论0学时，实验54学时） 课程类别：专业限选课 一、本课程的目的、任务 生物技术大实验是一门综合实验课程，包括了细胞工程、基因工程、微生物发酵工程和酶工程技术等，覆盖生物技术大部分研究领域，使学生得到生物技术实验操作的全过程、全方位训练，以提高学生的学习兴趣、动手能力和工作的责任心。实验内容同时将过去简单的验证性实验转变为综合性、设计性实验，旨在实验中提高学生实验设计能力、分析问题、解决问题的能力以及实验数据的处理能力，从而培养和提高学生的实践能力和创新能力。为以后进一步从事与生物技术相关的工作或继续深造打下扎实的基础。 二、教学基本要求 本课程为一系统性、综合性实验，实验主要从组织到细胞，再到DNA分子进行较为系统的分析研究。通过本实验的训练，要求学生熟练掌握细胞培养技术，基因工程菌的培养及质粒的提取鉴定方法；初步掌握基因组DNA的提取、DNA 体外扩增技术；工程菌的发酵调控及啤酒的酿造技术，本实验要求在教师的指导下，充分发挥学生的主动性和创造性，锻炼学生的实践动手能力和创新精神。三、教学内容及学时分配 [实验一] 植物基因的克隆 [实验要求] 基因工程技术已成为生物学领域许多实验室的常用技术，它的先进性和普及性使人们感到有必要在大学的教学课程中得到反映。基因工程的实际技术和实验系统正在不断的创新，新方法、新技术不断推出，而在有限的学时内，所能触及的技术只是基因工程中极少的一部分，不可能面面俱到。本实验主要学习理解提取基因组DNA的原理，掌握植物基因组DNA的提取及检测方法；掌握基
实验一糖的呈色反应和定性鉴定 目的要求 (1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。 (2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。 Ⅰ. Molish反应——α-萘酚反应 实验原理 糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 试剂 Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。 操作方法 取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。 Ⅱ. 蒽酮反应 实验原理 糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。 试剂 蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。 待测糖溶液，同Molish试验。 操作方法 取试管，编号，均加入1mL蒽酮溶液，再向各管滴加2 ~ 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。 Ⅲ. 酮糖的Seliwanoff反应 实验原理 该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。 试剂 Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。 操作方法 取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。 Ⅳ. Fehling试验
一、生物安全实验室操作规程 实验室生物安全管理程序 1.目的，有效地针对科室进行全面的生物安全管理，确保工作人员的安全。 2. 适用范围：适用于科室各专业实验室。 3、职责 、科主任负责任命生物安全小组，指导，规范其工作。 、生物安全小组组长负责安全小组日常工作的安排。 、生物安全小组负责科室安全的具体工作。 4、工作程序 、生物安全小组组成 、科主任指定安全小组组长 、经年度考核，从科室成员中选拨具有高度责任心和实验室知识的技术骨干，由科主任命为生物安全小组安全成员。由3人组成。安全小组成员任期一年，任期中出现特殊情况科主任可对之罢免。 、实验室生物安全的维护和检查 、生物安全小组指定针对安全操作和安全装备的检查方案，至少每年检查一次。 、生物安全小组建立安全清单，为回顾性检查提供资料并进行记录，形成《安全记录》。 、对危险品、危险区进行鉴定并加以标志。 、实验室应按规定及时报告所有的事件和潜在的危险因素。 、安全小组应定期对工作人员进行安全培训教育，并对各种紧急情况下应急措施进行培训。
、若发生职业暴露应及时报告科主任和生物安全小组人员。 、警告标记和标签的建立。 、对不因危险程度的实验工作区进行标志。 、对高度危险性区域要张贴危险公告。 、装存危险物质的容器必须贴上标签，其内容应详细。 5、安全操作规程 、临检、生化、免疫、血库等实验室生物安全防护 、在实验室工作区禁止吸烟 、禁止在实验室放置食物、饮料及类似的存在有潜在的从手 到口的接触途径的其他物质。禁止用实验室的冰箱（柜）储存食物。 、处理腐蚀性或毒性物质时必须做好防护工作。应使用安全镜、面罩或其他的眼睛和面部防护用品。 、在实验室工作区，病区应穿白大衣或隔离衣，服装应符合实验室设备的要求。 、应穿着舒适，防滑并能保护整个脚面的鞋子。 、在实验工作区头发不可下垂，避免与污染物质接触或影响实验操作，有此类危险的饰物应避免带入工作区。不可留长胡须。 、由实验工作区进入非污染区要洗手，接触污染物后要立即洗手。 、实验室禁止堆积过多的垃圾，至少应每日清理一次。 、禁止在实验工作区存放个人物品。 、在实验室指定清洁区和非清洁区，非本室工作人员禁止进入工作区。 、从移液器吸取液体、禁止口吸。
基因工程基本操作程序 引言：基因工程是一门利用生物技术手段对生物体的基因进行修改和调控的学科。它在农业、医学和工业等领域具有广泛的应用前景。而在进行基因工程实验时，我们需要掌握一些基本的操作程序。本文将介绍基因工程实验的基本操作程序，包括基因克隆、DNA提取、PCR扩增、基因测序等。 一、基因克隆 基因克隆是基因工程中最常用的操作之一，它通过将感兴趣的基因片段插入到载体DNA中，构建重组融合的DNA分子。基因克隆的基本步骤如下： 1. DNA片段的选择：根据实验需要选择感兴趣的DNA片段，可以通过限制性内切酶切割目标DNA，得到所需的片段。 2. 载体DNA的选择：选择合适的载体DNA，常用的载体有质粒和噬菌体等，根据实验需要选择适当的载体。 3. 酶切：将目标DNA片段和载体DNA经过限制性内切酶酶切，产生互补的黏性末端。 4. 连接：将目标DNA片段与载体DNA连接，形成重组融合的DNA分子。
5. 转化：将重组融合的DNA分子转化到宿主细胞中，如大肠杆菌。利用热激转化或电转化等方法，将DNA导入到细胞内。 6. 筛选：通过培养含有选择性培养基的细菌平板，筛选出含有重组融合的DNA分子的细菌克隆。 二、DNA提取 DNA提取是基因工程实验中的常见操作，它用于从生物样本中提取纯净的DNA。DNA提取的基本步骤如下： 1. 样本处理：将生物样本进行预处理，如细胞破碎、组织切片等，以释放DNA。 2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液破坏细胞膜和核膜，释放DNA。 3. 蛋白质去除：通过加入蛋白酶等酶类，去除DNA提取溶液中的蛋白质。 4. DNA沉淀：通过加入盐溶液，使DNA沉淀出来。 5. DNA纯化：将DNA沉淀物进行洗涤和纯化，去除杂质。 6. DNA溶解：最后将纯净的DNA溶解在适当的缓冲液中，以便后续实验使用。 三、PCR扩增
生物技术实验的操作步骤与结果解读 生物技术是一门将生物学与工程学结合的学科，广泛运用于生 物医学、农业、食品科学等领域。而对于生物技术实验来说，合 理的操作步骤以及准确的结果解读是保证实验结果准确性和可靠 性的关键。 一、操作步骤 1. 实验前准备：包括实验所需仪器设备的检查与校准，实验用 试剂和培养基的准备，以及实验环境的消毒和无菌操作等。 2. 样品处理：根据实验的具体目的，合理选择样品并进行处理。例如，如果实验需要分析某种蛋白质的表达水平，可以选择组织 样品并对其进行细胞破碎和蛋白质提取等步骤。 3. 实验操作：根据实验的要求进行实验操作。例如，如果实验 需要进行PCR扩增，操作步骤可能包括DNA提取、引物设计、 反应体系的配置、PCR反应条件的设置等。 4. 仪器操作：根据实验所需使用的仪器设备进行相关操作。例如，如果实验需要使用电泳仪进行DNA分离，操作步骤可能包括：配置电泳缓冲液、装填样品、设置电泳条件等。
5. 结果分析：根据实验所得到的结果进行分析和解读。例如， 对于PCR扩增结果，可以通过凝胶电泳进行分析，观察扩增产品 的大小和带型等信息。 二、结果解读 1. 数据分析：根据实验所得到的数据进行统计和分析。例如， 对于PCR扩增的结果，在凝胶电泳图上可以观察到不同大小的扩 增产物带，可以通过测量带的距离来估计扩增产物的大小。 2. 数据比较：将实验所得到的数据与对照组进行比较，评估实 验结果的显著性。例如，对于蛋白质表达水平的分析，可以比较 不同组织或不同处理条件下的样品，从而评估差异的显著性。 3. 结果解释：根据实验结果以及先前的研究知识，对实验结果 进行解释和推断。例如，如果实验观察到某种基因的表达水平显 著上调，可以推断这个基因可能在特定生物过程中发挥重要作用。 4. 实验重复和验证：为了验证实验结果的可靠性和重复性，可 以进行实验的重复和验证。通过多次重复实验，可以进一步确定 实验结果的稳定性和统计学显著性。 5. 结果报告：最后，根据实验所得到的结果撰写实验报告。实 验报告应该包括实验的背景、目的、实验设计、材料和方法、结 果和讨论等内容，以便其他人能够理解和重现实验。
生物安全操作规程和技术规范 生物安全操作规程和技术规范是为了保护人类和环境免受生物危害的制定的一 系列准则和标准。它们旨在确保在实验室、工厂或其他生物实验环境中进行的操作和实验能够按照安全和规范的方式进行，以防止生物物质的泄漏、传播或滥用。 一、生物安全操作规程 1. 实验室准备 在进行任何实验之前，实验室必须具备适当的设施和设备，如生物安全柜、洗 手池、紧急淋浴器和安全装置等。实验室应定期进行检查和维护，以确保设施和设备的正常运行。 2. 个人防护措施 实验人员必须穿戴适当的个人防护装备，包括实验室服、手套、护目镜和口罩等。在操作期间，应避免触摸面部、眼睛和嘴巴，以防止生物物质的接触和吸入。 3. 生物物质管理 所有生物物质必须妥善存放和标识，以防止交叉污染和误用。实验室应建立适 当的样品管理系统，包括记录样品的来源、数量、存储条件和使用情况等信息。 4. 废物处理 所有生物废物必须按照规定的程序进行处理和处置。实验室应配备适当的废物 处理设施，如生物安全柜、高温灭菌器和化学处理设备等，以确保废物的安全处置。 5. 紧急情况应对 实验室应制定应急预案，包括火灾、泄漏和事故等情况的处理措施。实验人员 应接受相关的培训，了解如何应对紧急情况，并熟悉紧急设备的使用方法。
二、生物安全技术规范 1. 实验室操作 实验室操作应按照标准化的程序进行，以确保实验的准确性和重复性。实验人员应严格遵守操作流程，避免操作失误和实验结果的偏差。 2. 生物材料处理 在处理生物材料时，应注意保持材料的完整性和稳定性，避免材料的污染和变质。操作人员应了解生物材料的特性和安全操作方法，避免对人体和环境造成潜在的风险。 3. 设备使用 实验室设备的使用应符合相关的规范和标准。设备的选择、安装、操作和维护都应按照要求进行，以确保设备的正常运行和安全使用。 4. 数据管理 实验室应建立完善的数据管理系统，包括数据的记录、存储、备份和保密等措施。实验数据应按照规定的程序进行审核和验证，以确保数据的准确性和可靠性。 5. 质量控制 实验室应建立适当的质量控制体系，包括质量管理计划、质量标准和质量评估等。实验室人员应定期进行质量控制检查和评估，以确保实验结果的准确性和可靠性。 总结： 生物安全操作规程和技术规范是确保生物实验操作安全和规范的重要准则和标准。通过遵守这些规程和规范，可以有效地保护人类和环境免受生物危害的影响。实验室应建立适当的设施和设备，培训实验人员，建立废物处理和紧急情况应对措
【高中生物】高中生物知识点：基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序： 1、目的基因的获取 （1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 （2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）； ③PCR技术扩增目的基因。 2、基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图： ①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 ②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 ③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 （3）基因表达载体的构建过程： 3、将目的基因导入受体细胞 （1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 （2）常用的转化方法： 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法
农杆菌转化法 显微注射技术 Ca 2+ 处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca 2+ 处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 （3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 4、目的基因的检测和表达 （1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA 分子杂交技术。 （2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。 （3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。 （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
生物实验操作手册 第一章实验室安全操作 1. 实验室准备 在进行任何实验之前，必须确保实验室环境安全。检查实验室设备是否正常工作，消防设备是否齐全，并确保实验室通风良好。同时，要熟悉实验室的紧急情况处理程序，以便在发生意外情况时能够及时应对。 2. 个人防护 实验室工作时，必须佩戴适当的个人防护装备，包括实验室外套、手套、护目镜和口罩等。这些装备能够保护实验人员免受有害物质的伤害，并减少实验物质对身体的直接接触。 3. 实验物质处理 在处理实验物质时，必须遵循正确的操作程序。例如，处理有毒物质时，应使用防护手套，并将废弃物物质放入指定的容器中进行处理。此外，实验室中应设置明确的标识，以便正确识别和处理各种实验物质。 第二章基本实验技术 1. 培养基制备 培养基是生物实验中常用的一种基础实验材料。制备培养基时，需要准备适当的原料和试剂，并按照一定的比例混合。在混合过程中，要确保混合均匀，并进行必要的消毒处理。 2. 细胞培养
细胞培养是生物学研究中常用的一种技术手段。在进行细胞培养时，需要准备 培养皿、培养液和细胞悬液等材料。同时，要控制培养条件，包括温度、湿度和二氧化碳浓度等，以保证细胞的正常生长和增殖。 3. PCR技术 PCR技术是生物学研究中常用的一种分子生物学技术。在进行PCR实验时， 需要准备DNA模板、引物和酶等试剂。同时，要控制反应条件，包括温度和时间等，以确保PCR反应的准确性和可靠性。 第三章常见实验操作技巧 1. 微量吸管操作 在进行微量液体的移液操作时，要使用微量吸管。操作时，要注意吸管的位置 和角度，以避免气泡的产生，并确保移液的准确性和稳定性。 2. 凝胶电泳 凝胶电泳是分离和检测DNA、RNA和蛋白质等生物分子的常用技术。在进行 凝胶电泳实验时，要准备好凝胶和电泳缓冲液，并按照一定的程序进行操作。同时，要注意电泳条件的选择，以获得清晰的分离带。 3. 显微镜操作 显微镜是生物学研究中常用的一种工具。在使用显微镜观察样品时，要调整镜 头的焦距和光源的亮度，以获得清晰的图像。同时，要注意样品的处理和固定，以保持样品的完整性和稳定性。 结语 生物实验操作手册是进行生物学研究的重要参考资料。通过合理的实验室安全 操作、掌握基本实验技术和熟练掌握常见实验操作技巧，能够提高实验效率和实验
实验室操作规范 本规程中列出了最基本的实验室操作和程序，他们是微生物学操作技术规范的基础。在规划实验室和国家级实验室项目时，可以根据这些规程来制订实验室安全操作的书面程序。 每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并 规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。下面列出了一些最重要的 概念。 进入规定 1、在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物 危害警告标志（图1）。 2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。 3、实验室的门应保持关闭。 4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。 5、进入动物房应当经过特别批准。 6、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。 人员防护 1、在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。 2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物 的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。 3、在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。 4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、 面罩（面具）或其他防护设备。 5、严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息 室和卫生间）。 6、不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。 7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。 8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。 9、在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。 操作规范 1、严禁用口吸移液管。 2、严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。 3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。 4、应限制使用皮下注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液，皮下注 射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。 5、出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室 应保存这些事件或事故的书面报告。 6、必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。 7、污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据 所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。 8、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。
一、玻璃仪器的使用及清洁 （一）玻璃仪器的洗涤及干燥 1、一般仪器：烧杯、试管、离心管等普通玻璃仪器，可直接用毛刷蘸餐洗净刷洗，然后用自来水冲洗，直至容器内不挂水珠即可。最后用少量蒸馏水冲洗内壁2－3次，倒置晾干即可。 2、容量分析仪器：容量瓶、滴定管及吸管等容量仪器，用后用自来水多次冲洗，如能清洁（壁不挂水珠），再用蒸馏水少量冲洗2~3次晾干即可备用。若仍不干净附有油污等，则须于干后放入铬酸洗液内浸泡数小时，然后倒净（或捞出）洗液，用自来水充分冲洗至水不显黄色后再冲几次，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次晾干备用。 在做酶学实验时，对仪器的清洁要求更高，因如有极微量的污物（如重金属离子）即可导致整个实验失败。因此，必要时仪器经上述方法洗涤后，还需用稀盐酸或稀硝酸洗涤，以除去铬及其它金属离子，然后再用自来水、蒸馏水冲洗。生化实验室常用的洗液有以下几种：（1）铬酸洗液：为最常用的洗液，由重铬酸钾、粗硫酸及水配制而成，去污力强，清洗效果好。其配制方法有多种，可根据需要进行选择，常用的配方如下表。 重铬酸钾（ｇ）100 60 100 水（ｍｌ）750 300 200 粗硫酸（ｍｌ）250 460 800 清洁性能较弱较强（常用）最强 配制方法为：先将重铬酸钾溶于水，再慢慢加入浓硫酸。因配制过程产生大量热，容器需放入冷水中，边加硫酸边搅动混合。由于产热量很大，使用玻璃容器有破裂的危险，所以最好用耐高温的陶瓷或耐酸的搪瓷容器。洗液可多次反复使用，如效力变弱，可加入少量重铬酸钾及浓硫酸继续使用，但如果变为绿色，则不宜再用。 （2）10%尿素液：为蛋白质良好溶剂，帮适用于洗涤盛血的容器。 （3）草酸盐液：用于清洗过锰酸钾的痕迹。 （4）硝酸液：用1：1的硝酸水溶液，用于清洗CO2测定器及微量滴定管。 （5）乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Nａ2）液：5~10%的EDTA－Nａ2液可用于洗涤器皿内无机盐类。 玻璃仪器的干燥方法可根据不同仪器的种类而定。一般地说洗净后的玻璃仪器，如不急用应倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中烤干，但容量玻璃仪器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及烧结、结构复杂的玻璃仪器等，严禁烘烤。此类仪器，如急用可采用水泵抽气法干燥。 （二）常用玻璃仪器的使用 1、吸量管：吸量管是用来测量一定容积的液体，并把它从一个器皿转移至另一个器皿中的量器。常用的吸量管有以下几种： （1）刻度吸量管：刻度吸量管是多刻度吸量管，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等规格。吸量管刻度所标的数字有自上而下和自下而上两种，使用之前应仔细分辨。实验室所用之刻度吸管多属于刻度到尖端的吸管，所以要吹出尖端留存的液体。 （2）奥氏吸管：在量取粘度较大的液体如血液、血清等时，应当使用奥氏吸管。这种吸管也是单标的，并且在其下端有一个膨大部分。所以液体与吸管表面接触面积较小，当量取血液时，较他种吸管准确。奥氏吸管的容量包括遗留在尖端的液体，故在缓缓使液体流出后，再停留数秒钟，吹出最后一滴。在学生实验中常用的有1、2、5毫升等规格。
目录 实验一植酸钙镁的制备 (2) 实验二溶菌酶结晶的制备及活力测定 (5) 实验三固定化细胞生产L-天冬氨酸 (8)
实验一植酸钙镁的制备 植酸钙镁又称菲汀， 是种良好的营养药，具有促进新陈代谢、增进食欲和营养、助发育等作用。适用于治疗神经系统各种疾病、血管张力减退、癔病、神经衰弱、佝偻病、贫血和结核病等。 一、化学结构和性质 化学名称为肌醇六磷酸酯钙镁盐，呈白色粉末，无臭，溶于盐酸、硝酸和硫酸，不溶于碱水。植酸钙镁在高等植物中含量很丰富，玉米浸泡的水液可作为提取的原料，是生产玉米淀粉的副产品。米糖和麦麸也可作为原料。 二、提取方法 1、以玉米浸泡液为原料的提取法 （1）技术路线 （2）工艺过程 取净化玉米投入浸泡罐内，用0.3%亚硫酸溶液在52~53℃浸泡70小时,放出浸液，搅拌下加入8Be 的石灰乳，中和至pH5.4~5.8,静置1h,除去上层清液,混浊液压滤, 滤饼在60~80℃烘干。对玉米质量计，总收率0.2~0.3%。 2、以植酸钙为原料的提取法 （1）技术路线 （2）工艺过程 按m （工业植酸钙）：V （浓盐酸）：V （氢氧化钠）：m （活性炭）：V （水）=1:1:0.625:0.04:8的配料比，投料取工业植酸钙溶于等量的浓盐酸中，加热使溶解，加入活性炭，加水稀释，过滤。滤液在搅拌下，加入120g/L(12%氢氧化钠)溶液中和至pH5.1，析出沉淀，静置，检查pH ，过滤，收集滤饼用水洗至氯离子合格为止，甩干，搓成小条状，通风干燥，得植酸钙镁。对植酸钙质量计，总收率50%以上。
3、以麸皮为原料的提取法 （1）技术路线 (2)工艺过程 取麸皮加入4倍量的水和0.02倍量的硝酸(相对密度1.4~1.42),搅拌均匀浸2h, 搅拌，取出植酸水溶液，麸皮再加入3倍量水和0.01倍量的硝酸，浸泡5h，搅拌，放出植酸水溶液，合并，pH 4。加入右灰乳(100g/L)调节pH 5.0~5.5，再用NaOH(10%)调pH7，静止分层，去上层清液过滤，甩干，干燥，得粗品，对麸皮计，总收率3%~3.5%。 三、试剂和器材 1、试剂 硝酸（相对密度1.4~1.42） 米糠或麦麸 NaOH 石灰 pH试纸(1~14) 2、器材 烧杯500ml 2个 玻棒2个 量筒250 ml 2个 玻璃漏斗10 cm 1个 布氏漏斗10 cm 1个 滤纸 真空泵1台 真空干燥箱1台 移液管5 ml 、10 ml 2支 天平 搅拌器1台
总论 目录 第一篇生物化学实验基本操作、基本技术及原理 (6) 第一章生物化学实验基本操作 (6) 第二章实验样品的制备 (13) 第三章分光光度法 (15) 第四章层析法 (19) 第五章电泳法 (29) 第二篇基础生物化学实验 (37) 实验一蛋白质的定量测定——Folin-酚法 (37) 实验二SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (42) 实验三酵母核糖核酸（RNA）的提取 (51) 实验四酵母核糖核酸（RNA）组分的鉴定 (54) 实验五核酸的定量测定——紫外(UV)吸收法 (58) 实验六过氧化氢酶米氏常数（K m）的测定 (60) 实验七维生素C的定量测定（2.6-二氯酚靛酚滴定法） (64) 实验八小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 (71) 实验九血糖的定量测定（GOD-PAP法） 74
21世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科,它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。 本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。 一、实验要求 1．实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。 2．实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现
微生物实验室操作规程【SOP 】•细菌室工作守则（微生物室SOP 之一） •细菌室消毒隔离措施（微生物室SOP 之二） •微生物实验室安全与防护（微生物室SOP 之三） •细菌室内质控制度（微生物室SOP 之四） •细菌室操作技术规范（微生物室SOP 之五） •无菌间规章制度（微生物室SOP 之六） •菌（毒种）管理办法（微生物室SOP 之七） •细菌室仪器维护保养及质控措施（微生物室SOP 之八）•标准菌株保存及使用（微生物室SOP 之九） •细菌室内务管理规定（微生物室SOP 之十） •标本采集及保存要求（微生物室SOP 之十一） •室内质控失控处理程序（微生物室SOP 之十二） •标本拒收标准（微生物室SOP 之十三） •温度失控处理措施（微生物室SOP 之十四） •超净工作台作业指导（微生物室SOP 之十五） •标本的接种和移种法（微生物室SOP 之十六）
细菌室工作守则 （微生物室SOP之一） 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用1:1000 高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。 10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、
微生物实验室标准操作程序质量手册实验操作者:XXXXXXXX 执行日期：X年X月X日 启用日期:XX年X月X日 标准操作程序文件 01 试剂贮存和配制区工作制度 02 标本处理区工作制度 03 细菌自动分析区工作制度 04 试剂贮存和配制区标准操作程序 05 标本处理区标准操作程序 06 细菌自动分析区标准操作程序 07 紫外消毒标准操作程序 08 消毒液配制使用标准操作程序 09 普通冰箱使用标准操作程序 10 超低温冰箱标准操作规程 11 洁净工作台使用操作规程 12 VITEK32型自动分析系统标准操作程序 13 移液器使用标准操作程序 14 高速离心机操作标准操作程序 15 冰箱维护和保养标准操作程序 16 电热恒温水浴箱操作程序 17 洁净工作台维护和保养程序 18 可移动紫外消毒车使用操作程序 19 加样器校准标准操作程序 20 离心机维护保养操作程序 21 温度计校准程序 22 试剂的质检操作程序 23_微生物实验室岗位职责（暂行） 24 临床标本的保存程序 25 临床检验及收费程序 26 微生物检验收收费价格 27 普通培养阴性操作程序 28 真菌培养阴性操作程序 29 苛养菌培养阴性操作程序 30 抗酸杆菌培养阴性操作程序
31 支原体培养检验操作程序 标本处理区工作制度 进入本区需穿工作服、工作鞋。 本区只能进行:临床标本的保存,标本接种、培养、及其菌株检验前处理、菌悬液制备、染色标本检查、非上机鉴定与药敏试验操作等危险操作，其它操作不得在此区进行. 在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套、口罩和帽子，严格按照操作规程进行。工作结束后必须立即对工作区进行清洁或消毒. 非本实验室工作人员未经允许不得进入。 试剂配制和无菌区工作制度 进入该区需穿专用工作服和工作鞋. 本区只能进行贮存试剂的制备、试剂的分装和平板的制备。 在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程进行. 工作结束后必须立即对工作区进行清洁和消毒。 非本实验室工作人员未经允许不得进入。 无菌室公能用于分装培养管或倒制平板培养基操作. 使用前以紫外灯消毒至少30分钟，定期用乳酸熏蒸，彻底消毒. 无菌室仅限操作者进入,操作时严格关门。 室内备有空调设备，以保证不因温度而影响工作. 仪器自动分析区工作制度
生物技术大实验操作指南 注意事项 1、工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。 2、用电、气安全注意事项。 3、节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。 4、实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。 5、实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。 实验一鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取） 一、原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加 一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。 二、试剂与设备：TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit， 氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。 三、步骤： 1、新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆， RT 5-10 Min。 2、加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。 3、4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。 4、加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。 5、加1ml 75%乙醇洗涤沉淀2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干 3-5Min。 6、50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。 7、检测RNA纯度与浓度。 四、结果 五、讨论
实验二溶菌酶基因第一链cDNA合成 一、原理：mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转 录合成cDNA，此cDNA为单链。 二、试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离 心机。 三、步骤： 1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物： 总RNA 或Poly(A)+ RNA或特异性RNA Xμg Oligo dT (0.5μg/μL) (20 pmol) 1μL RNase free ddH2O 定容至12μL 2. 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴30 s，然后 离心3~5 s。 3．将试管冰浴，再加入如下组分： 5×Reaction Buffer 4μL RNase Inhibitor ( 20 U/μL) 1μL dNTP Mix(10 mmol/L) 2μL M-MuLV RT（200 U/μL）1μL 注：若5×Reaction Buffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。 4．轻轻混匀后离心3~5 s。 5．在PCR 仪上按下列条件进行反转录反应cDNA 合成42℃ 30-60 min 6.终止反应95℃ 5 min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20℃保存。 * M-MuLV RT酶最后加。 四、结果 五、讨论
实验室生物安全标准操作规程 ZHCADC-PGC-2015 （第二版） 受控状态：Y □N □ 受控编号：
持有人： 2015年1月11日发布2015年1月20日实施哈尔滨市动物疫病预防控制中心
目录ZHCADC—PGC01— BSL—2实验室个人防护装备的总体要求2010 ZHCADC—PGC02— 实验室人员进出实验室 2010
ZHCADC-PGC03—2010 实验室检测样品采集ZHCADC-PGC04-2010 实验室检测样品包装和运送ZHCADC-PGC05—2010 实验室检测样品接收ZHCADC—PGC06— 样品检测操作规程 2010 ZHCADC—PGC07— 电气设备操作规程 2010 ZHCADC-PGC08-2010 实验室消毒剂配制标准操作规程ZHCADC—PGC09-2010 无菌间使用标准操作规程ZHCADC-PGC10-2010 实验室废弃物处理标准操作规程ZHCADC-PGC11-2010 实验室消毒标准操作程序ZHCADC—PGC12-2010 实验室意外事故处理
1 目的 个人防护装备是减少操作人员暴露于气溶胶、喷溅物以及意外接种等危险的一个屏障.为了实验人员的安全，以保证实验室人员的安全及实验室环境不被污染。 2 适用范围 适用于生物安全实验室选用个人防护装备（防护口罩、防护手套、防护服与防
护鞋）的质量控制. 3 职责 实验室组织有关人员采购符合要求的个人防护装备，并且严格控制其质量。 4 过程要求 实验室所用的个人防护装备应符合国家标准GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》。在生物因子危害评估的基础上，按不同级别的防护要求选择适当的个人防护装备。 4.1防护口罩 根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》、GB19489—2008《实验室生物安全通用要求》、《医用防护口罩技术要求》，生物安全实验室选用P2级的防护口罩，必须满足GB 19083—2003以下条件: (1）长方形口罩展开后中心部分尺寸:长度不小于17cm、宽度不小于17cm; 密合型拱形口罩尺寸：横径不小于14cm，纵径不小于14cm。 （2）口罩表面不得有破洞、污渍；口罩带应调节方便，应有足够强度固定口罩位置.每根口罩带与口罩体连接点的断裂强力应不小于10N. （3）口罩滤料的颗粒过滤效率应不小于95％；经环氧乙烷灭菌的口罩，其环氧乙烷残留量应不超过10μg/g；不能从防护口罩中检出致病菌；口罩对皮肤无刺激。4。2防护手套 实验室防护手套选择用国内生产的一次性乳胶手套和耐酸碱手套。技术要求见国标GB7543-1996
总论 21世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科,它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。 本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。 一、实验要求 1．实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。 2．实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。 3．实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。 二、实验时注意事项 1．进实验室要穿好实验服，以免酸碱腐蚀衣服。 2．进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。 3．要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐,按次序放置。实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。 4．实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹，不得随地吐痰，乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。 5．要爱护仪器、节约药品。第一次实验时要按仪器清单清点仪器，负责保管，用后如数交还,在使用时如有破损，及时报告，经指导教师检查后填写破损单，按学校规定赔偿。 6．贵重仪器，如分光光度计、离心机等，要尽力爱护，使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。 7．要节约水电，一经用完随手关闭水门、电门。 三、值日生任务 1．领发本次所用仪器、物品，清点、交还临时用仪器、物品，若有损坏负责追查赔偿。 2．管理操作公用仪器，打蒸馏水。 3．搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池……全干净。 4．确保安全：管好仪器、门窗、水电。 5．请任课及技术室老师检查工作，认可后方能离开实验室。 四、试剂使用规则 1．使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。 2．取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，放回原处。试剂瓶塞、专用吸量管、滴