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HLA分型B位点常见的模棱两可样本的分析及解决策略

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７４　现代检验医学杂志第ｚｚ卷第６期２００７年ｌ１月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．２２，Ｎｏ．６，Ｎｏｖ．２００７　ＨＬＡ分型Ｂ位点常见的模棱两可样本的分析及解决策略　刘孟黎，刘　晟，张艳，沈春梅（陕西省血液中心，西安７１００６１）　中图分类号：Ｑ７８１文献标志码：Ａ文章编号：１６７１—７４１４（２００７）０６—０７４—０２　异基因造血干细胞要求供者和受者ＨＬＡ抗　只有２４５个，占２９．５　９／６；ＨＩ　Ａ—ＤＲＢ１的４６３个等位　原最大程度的匹配，由于ＨＩ　Ａ的高度复杂性、多　表１　６６８例模棱两可样本的分析确认　态性和多样性等遗传特点［１］，尽管方法和试剂不断　改进，在进行常规的ＨＬＡ分型中除了会得到中分　辨甚至高分辨的结果，还常常会得到很多种组合结　果。这样以来虽然可能的结果都会被报告，但模棱　两可的样本大大增加了，造成一些样本无法确认结　果。最常见的情况是两组以上的基因型组合得到的　基因型和血清学特异性结果不一致，尤其是Ｂ位　点。ＨＬＡ—Ｂ是最具有多态性的位点，也是出现模棱　两可或难以判定的结果最多的位点，下面是笔者在　中华骨髓库陕西分库捐献者样本的日常分型中对　６６８例ＨＬＡ—Ｂ位点的模棱两可样本的分析和处理　对策。　１材料和方法　１．１　样本来源　６６８例样本来自陕西分库的志愿　捐献者，在常规的ＰＣＲ—ＳＳＯ低分辨中Ｂ位点出现　模棱两可结果。　１．２试剂　基因组ＤＮＡ抽提试剂盒（天根生化，　国产），ＰＣＲ—ＳＳＯ试剂盒（Ｏｎｅ　Ｌａｍｂｄａ　Ｉｎｃ，　ＵＳＡ），ＰＣＲ—ＳＳＰ低分辨和高分辨试剂盒（Ｐｅｌ—　Ｆｒｅｅｚ，ＵＳＡ；Ｇ＆Ｔ，ＵＳＡ；Ｐｒｏｔｒａｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ等公　司）。　１．３　仪器Ｌｕｍｉｎｅｘ　１００ＩＳ　流式仪，美国产；　ＰＣＲ仪（ＰＥ９７００，ＭＪ—ＰＴＣ２２５），美国产；凝胶成像　系统，上海产。　２结果与讨论６６８例３０种模棱两可的情况（见　表１），分别采用根据频率、用另一种试剂、增补板　和高分辨等方法确认这些模棱两可样本的低分辨　结果。需要说明的是，表中所列情况＜５例的我们　无论是采用哪种方法确认，实验全部做；＞５例的　随机做５～１０例确认实验，其它样本参照确认实验　样本报告结果。　２．１　根据频率分析确认　至２００７年４月ｗＨＯ　认可的ＨＬＡ等位基因（ＨＬＡ—Ｉ和ＨＬＡ一Ⅱ）共有　２　７１４　个，在这些等位基因中仅有３０％为常见和　确认的ＨＬＡ等位基因（ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｄ　ｗｅｌｌ－ｄｏｃｕ—　ｍｅｎｔｅｄ　ａｌｌｅｌｅ，简称ＣＷＤ）。有研究报道ＨＬＡ－Ａ的　４８９个等位基因中，ＣＷＤ基因只有１３０个，占　２６．５　ｏ，４；ＨＬＡ—Ｂ的８３０个等位基因中，ＣＷＤ基因　

注：括号里的４位数为造成模棱两可的等位基因型。　基因中，ＣＷＤ基因只有１４３个，占３０．５　Ｌ３］。随着　

Ｌｕｍｉｎｅｘ微磁珠ＰＣＲ～ＳＳＯ技术的广泛使用，以及　试剂的不断完善，漏检的可能逐渐减少。但随之而　来的是会得到很多种组合的结果，模棱两可的几率　增大，尤其是当血清学特异性不一致或空白的时　候。我们发现造成模棱两可状况的总有一些是人群　中非常罕见的等位基因，罕见等位基因在人群中的　分布频率很低，有的甚至只报道过一例，依据ＨＬＡ　字典和ＣＷＤ等位基因表ｌ＿３刈，我们可以排除罕见　基因得出的结果。比如下列两种情况：①Ｂ＊　０７０２０１／０４＆４８０１／ｏ９／１１；Ｂ＊４８０８＆８１０１／ｏ２。根据　ＨＬＡ字典和ＣＷＤ等位基因表Ｂ＊４８０８非常罕见　

作者简介：刘孟黎（１９５７一），女，副主任技师，主要从事输血免疫研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ａｎｎｍｅｎｇｌｉ＠ｙａｈｏｏ．２ｏｍ．ｃｎ。　

维普资讯 http://www.cqvip.com 现代检验医学杂志第２２卷第６期２００７年ｌ１月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．２２，Ｎｏ．６，Ｎｏｖ．２００７　７５　且未被证实，据此排除第二组结果，低分辨结果报　ＨＬＡ—Ｂ＊０７ＸＸ，４８ＸＸ。②Ｂ＊３５０８￣４４０２０１／０２０３／　１９／２７／４３；Ｂ＊４４０９８　３１１。根据ＨＩ　Ａ字典ＣＷＤ　等位基因表５３１１罕见，据此排除第二组结果。　２．２　用不同厂家的试剂分析确认　根据他们的探　针设计和反映格局，利用不同方法、不同品牌试剂　之间互补的优势，解决部分模棱两可的问题。当用　ＰＣＲ—ＳＳＯ方法出现模棱两可情况时，可以查询　ＰＣＲ—ＳＳＰ的单孔引物看是否可以排除。比如下列　两种情况：①ＰＣＲ—ＳＳＯ实验结果为Ｂ＊１５０１ＯｌＯｌ／　０１０１０２Ｎ／Ｏｌｏ３／ｏｌ０４／３３／３４／６０＆４００１０１／０１０２／０１０　３；Ｂ＊１５４６￣４０２１。如果按照第一组结果血清学特　异性应当报ＨＬＡ—Ｂ６２＆４０，而按照第二组则应当　报Ｂ７２＆４Ｏ／一。我们采用ＰＣＲ—ＳＳＰ分型试剂排除　了Ｂ＊１５４６￣４０２１，结果报ＨＬＡ—Ｂ＊１５＆４Ｏ，血清　学特异性Ｂ６２＆６０。②ＰＣＲ—ＳＳＯ实验结果为Ｂ＊　１５０２￣４００１０１／ＯｌＯ２／Ｏｌ０３／２２Ｎ／４９；Ｂ＊１５２５￣．４０２　５。如果按照第一组结果，血清学特异性应当报　Ｂ７５＆６０，而按照第二组则血清学特异性应当报　Ｂ６２＆４Ｏ／一。我们采用ＰＣＲ—ＳＳＰ分型试剂排除了　Ｂ＊１５２５，血清学特异性结果报ＨＬＡ一７５＆６Ｏ。　２．３增补板试剂分析确认Ｏｎｅ—Ｌａｍｂｄａ针对自　身Ｌｕｍｉｎｅｘ　１００ＩＳＴＭＰＣＲ—ＳＳＯ试剂一些常见的分　不开的或者模棱两可的可以提供ＰＣＲ—ＳＳＰ方法增　补板加以排除和确认，解决部分问题。如下列两种　情况：①Ｂ＊３８０２０１／０２０２＆４００１０２／０１０３／２２Ｎ／４９；　Ｂ＊３９０５￣４０４７，如果按照第一组结果低分辨应当　报Ｂ＊３８＆４Ｏ，而按照第二组则应当报Ｂ＊３９＆４Ｏ。　我们采用增补板证实３８０２０１／０２０２存在，排除了第　２组结果。②Ｂ＊１５２５￣５５０２／１２／１６；Ｂ＊１５４２＆５６ｏ　１，如果按照第一组结果低分辨应当报Ｂ＊１５＆５５，　而按照第二组则应当报Ｂ＊１５＆５６。我们采用增补　板试剂排除了５６０１，按第一组结果报告。　２．４　高分辨方法确认　由于高分辨的试剂成本问　题，只有当上述３种方法都无法解决的模棱两可发　生时，我们采用ＰＣＲ—ＳＳＰ高分辨的方法解决。比如　下列两种情况：①低分辨的结果为Ｂ＊４４０２０１０１／　ＯＬＯ２Ｓ／４４１９Ｎ／４４２Ｏ／４４３３／４４３４＆５００２；Ｂ＊４４０２０１　０１／Ｏｌｏ２Ｓ／４４１９Ｎ／４４２Ｏ／４４３３／４４３４＆５００１。虽然等　位基因低分辨只需要报告星号后两位都是Ｂ＊５Ｏ，　但它们的血清学特异性不一致。如果按照第一组结　果低分辨应当报Ｂ４４８　５，而按照第二组则应当报　Ｂ４４＆５０。我们采用高分辨试剂证实５００１存在，排　除了第一组结果。②低分辨的结果为Ｂ＊５５０２／１２／　１６ｇ￣５８０１；Ｂ＊５６０１ｇ￣５８０５。如果按照第一组结果低　分辨应当报Ｂ＊５５ｇ￣５８，而按照第二组则应当报Ｂ　＊５６＆５８。我们采用高分辨排除了５６０１，选择了第　组结果。　中华骨髓库要求供者ＨＬＡ—Ａ／Ｂ／ＤＲ分型，结　果报告到ＷＨＯ命名星号后两位，同时报告血清学　特异性。这样一来，会有很多模棱两可的情况发生。　章旭［５　等报道在ＰＣＲ—ＳＳＰ方法进行ＨＬＡ低分辨　时，有６３．５　模棱两可的结果可以通过分布频率、　两步扩增和特殊引物等分析结果。我们通过根据频　率、用其它试剂、增补板和高分辨等４种方法有效　地解决了绝大部分ＨＬＡ—Ｂ位点模棱两可的问题，　笔者实验室已对约３万多份造血干细胞捐献者样　本进行ＨＬＡ分型，通过以上方法，Ｂ位点仅有约　０．４　需要通过ＤＮＡ测序或设计特殊引物鉴定。　参考文献：　ｒ１］　Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ　Ｐ．ＨＬＡ　ｍａｔｃｈｉｎｇ　ｆｏｒ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｔｒａｎｓ一　

［２］　［３］　

［４］　［５］　

ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ—ｈｏｗ　ｍｕｃｈ　ｉｓ　ｅｎｏｕｇｈ？［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎ　Ｊ　Ｍｅｄ，　２００１，３４５（２５）：１８４２—１８４４．　ｔ　．ｅｂｉ．ａｃ“　ＩＭＧＴ　Ｄａｔａｂａｓｅ．　Ｐｅｄｒｏ　Ｃａｎｏ，Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｋｌｉｔｚ。Ｓｔｅｖｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｄ　ｗｅｌｌ—ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ　ＨＬＡ　ａｌｌｅｌｅｓ：ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｄ—　Ｈｏｃ　ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｅｒｉｃａｎ　ｓｏｃｉｅｔＹ　ｆｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍ—　ｐａｔｉｂｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　２００７，６８（５）：３９２～４１７．　ＧＭ　Ｔｈ　Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，Ｃ　Ｈ　ｕｒｌｅｙ，Ｓ　Ｇ　Ｅ　Ｍａｒｓｈ，ｅｔ　ａ１．　Ｔｈｅ　ＨＬＡ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　２００４：ａ　ｓｕｍｍａｒｙ　ｏｆ　ＨＬＡ—Ａ，一　Ｂ，一Ｃ，一ＤＲＢ１／３／４／５　ａｎｄ—ＤＱＢ１　ａｌｌｅｌｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｓｓｏ—　ｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ＨＬＡ—Ａ，一Ｂ，一Ｃ，一　ＤＲ　ａｎｄ—ＤＱ　ａｎｔｉｇｅｎｓ．　章旭，李剑平．ＰＣＲ—ＳＳＰ在ＨＬＡ低分辨中判型困　难或无法判型的常见原因及解决对策［Ｊ］．中国输血　杂志，２００６，１８（３）：１９７—１９９．　收稿日期：２００７—０８—０６　

种降低聚丙烯酰胺凝胶考马斯蓝染色背景的方法　杨兰泽，高静（河南科技大学医学院，河南洛阳４７１００３）　中图分类号：Ｑ５ｏ３文献标志码：Ｂ文章编号：１６７１—７４１４（２００７）０６—０７５—０１　在聚丙烯酰胺凝胶染色时，考马斯蓝常常沉淀于凝胶　景。通过对照试验证明此法甚为有效。乙醇、丙酮与甲醇有　表面，从而影响对较弱显色带的检测，而且不美观。在染色　同等之脱色效果，异丙醇稍差。５～２Ｏ　ｇ／ｄｌ的聚丙烯酰胺凝　完成后，将凝胶用１００％（ｖ／ｖ）甲醇溶液处理１　ｍｉｎ，然后放　胶经甲醇处理５　ｍｉｎ不会造成损坏。　入脱色液或蒸馏水中，此间轻轻摇动，可有效地降低染色背　收稿日期：２００７—０７一ｌｌ　

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1例B3亚型的血清学检测与输血策略

1例B3亚型的血清学检测与输血策略

·82·ABO血型亚型是由ABO基因变异形成，其抗原分子结构与ABO 血型抗原存在一定差异，ABO亚型由于红细胞抗原质与量的改变，在血清学特征上主要表现为红细胞与试剂血清弱凝集或者不凝集[1]，对血型的鉴定造成鉴定困难，本例标本就是在对患者进行血型鉴定中发现，患者ABO血型鉴定正定性为双群，经进一步检测，确定为B3亚型，现报道如下：1资料与方法1.1…标本来源…标本来源为女性，54岁，临床诊断为急性髓系白血病。

1.2…仪器与试剂1.2.1…仪器…血清学专用离心机…、普通离心机…、电热恒温振荡箱…、冰箱…。

1.2.2…试剂…（1）抗‐A…、抗‐B…单克隆试剂血清（上海血液生物医药有限责任公司，批号：20191018）；（2）抗‐H…试剂血清…（上海血液生物医药有限责任公司，批号：20191121）…；（3）人ABO 血型反定型用红细胞…（上海血液生物医药有限责任公司，批号：20205337）。

1.3…方法…操作按参考文献[2]和试剂操作说明书进行操作。

1.3.1　ABO…血型血清学测定…①…正定型：取洁净小试管…2…支，标明抗…A、抗…B,分别加入抗…A、抗…B试剂血清各2滴于标识试管内，再用移液器取50微升患者5%…的红细胞悬液分别加入抗A、抗B试管，…离心后观察结果。

②反定型：取洁净小试管3支，标明…A、B…和…O…型细胞，在三支试管中都加入50微升患者血浆，再用移液器分别加入…A、B…和…O…型…5%…试剂红细胞悬液…50微升混匀，离心后观察结果。

1.3.2…Ｈ抗原测定　取洁净小试管3…支，标明待检、成人B型红细胞和成人O型红细胞，在三支试管中分别加入50微升抗H试剂，再用移液器分别加入…5%…待检红细胞、成人O型红细胞和成人B型红细胞各50微升到对应试管中，混匀，离心后观察结果。

1.3.3…亲和力实验…取3组正常B型红细胞作为对照细胞及患者细胞，配置成40%红细胞悬液备用。

更好地实现HLA分型，原来可以这样做......

更好地实现HLA分型，原来可以这样做......

更好地实现HLA分型，原来可以这样做......01 HLA 简介HLA（人类白细胞抗原，Human Leukocyte Antigen）由 6 号染色体上一类编码MHC（主要组织相容性复合体，Major Histocompatibility Complex）基因生成。

HLA 以高度的多态性成为人类重要的遗传标记，在免疫应答和调控中发挥着重要作用。

HLA 等位基因的分类命名法由WHO HLA系统命名委员会确定，数据库中已正式命名的HLA-I 型（HLA-A、B、C）和HLA-II 型（HLA-DRB、DQB1等）等位基因，已达到 31675个 (IMGT / HLA 数据库 2022.01)。

HLA 与许多自身免疫性和传染性疾病的敏感性和耐药性有关。

近期有研究称 HLA-A*24 型人群的 T 细胞对新冠病毒免疫反应更强[1]。

HLA 配型相合程度，是器官、骨髓和干细胞移植成功与否的关键因素。

此外，肿瘤患者的 HLA 基因型以及肿瘤中的体系突变均有可能影响免疫治疗的疗效。

图 1. HLA等位基因的分类命名法02 HLA 的检测尽管一代测序法是当前HLA 分型的主要方法，已应用于HLA 组织配型实验室和各临床医院，但通量低和耗时长是主要缺点。

其次，一代测序分离杂合标本中的 HLA 等位基因序列也需要更为复杂昂贵的方式才能实现。

二代测序由于通量和速度的极大提升，单次分型即可完成产生全相的高分辨率 HLA 分型，因而迅速得到广泛应用。

基于探针杂交捕获的二代测序，可高通量、低成本的实现高分辨HLA 分型。

相较于基于 PCR 的靶标序列富集方式，杂交捕获对于序列多态性的高容忍度是一个突出的优势。

但是在面对 HLA 这样的超高多态性靶标时，杂交捕获也可能会力有不逮。

纳昂达针对这一挑战专门开发了多态性探针补充方案，以最少的探针数覆盖 HLA 数据库中的数万种 HLA 型别，保证各种型别都有错配数≤7 的探针可结合（图 2A）。

hla高分辨基因分型6位点

hla高分辨基因分型6位点

hla高分辨基因分型6位点摘要：一、引言二、HLA 基因分型的意义三、高分辨基因分型的优势四、6 位点基因分型技术五、应用领域六、我国在该领域的研究进展七、结论正文：一、引言人类白细胞抗原（HLA）基因分型在免疫学、移植医学及疾病研究等领域具有重要价值。

近年来，随着基因测序技术的发展，高分辨基因分型技术逐渐成为研究热点。

本文将重点介绍HLA 高分辨基因分型6 位点技术的相关知识。

二、HLA 基因分型的意义HLA 基因分型对于疾病诊断、治疗和预防具有重要意义。

通过基因分型，可以了解个体对某些疾病的易感性，为制定个性化治疗方案提供依据。

此外，在器官移植中，HLA 基因分型有助于筛选合适的供体，降低移植排斥反应的风险。

三、高分辨基因分型的优势相较于传统基因分型技术，高分辨基因分型可以检测更多的等位基因，提高分型准确率。

这有助于研究人员更精确地评估基因与疾病之间的关系，为临床诊断和治疗提供更有力的支持。

四、6 位点基因分型技术6 位点基因分型技术是指对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 和HLA-DPB1 这六个位点的基因进行分型。

这种技术在我国已经得到广泛应用，如在造血干细胞移植、自身免疫性疾病研究等领域取得了显著成果。

五、应用领域除了上述领域外，HLA 高分辨基因分型6 位点技术还在疫苗研究、疾病诊断和法医学等领域发挥着重要作用。

例如，通过分析HLA 基因型，研究人员可以了解某种疫苗在特定人群中的免疫原性，为疫苗研发提供依据。

六、我国在该领域的研究进展我国在高分辨基因分型技术领域取得了一系列重要进展。

不仅建立了完善的HLA 基因分型技术体系，还研发出具有自主知识产权的试剂盒。

此外，我国学者在HLA 与疾病关联研究、基因多态性等方面取得了世界领先的研究成果。

七、结论总之，HLA 高分辨基因分型6 位点技术在医学和科研领域具有重要价值。

standard two-stage microcytotoxicity hla分型 -回复

standard two-stage microcytotoxicity hla分型 -回复

standard two-stage microcytotoxicity hla分型-回复什么是标准双阶段微胞毒性HLA分型?在进行器官或骨髓移植等免疫相关疾病治疗时，HLA（人类白细胞抗原）分型是非常重要的一项检测。

HLA分型可以帮助医生确定最匹配的供体，以减少排斥反应并提高移植成功率。

在实施HLA分型时，标准双阶段微胞毒性测试是其中一种常用的方法。

标准双阶段微胞毒性HLA分型测试是一种基于细胞毒性原理的免疫细胞分型方法。

该方法主要通过两个阶段来进行。

在第一阶段，采集患者和供体的淋巴细胞，然后将其通过特殊处理分成两组，分别是“被试组”和“效应组”。

对于被试组，会将供体淋巴细胞与患者血清进行混合，然后通过离心分离。

如果患者的HLA与供体不匹配，混合后的细胞很可能会发生凝集或破裂。

这表明患者的免疫系统中存在HLA抗体，可能导致排斥反应。

而对于第二组即“效应组”，患者的血清则会与已知的HLA类型的淋巴细胞进行混合，同样经过离心分离。

如果患者的血清中含有特定的HLA抗体，那么混合后的细胞也会产生凝集或破裂。

通过对两组细胞的观察，可以确定患者和供体之间是否存在HLA匹配或不匹配的情况。

这种标准双阶段微胞毒性HLA分型方法具有较高的准确性和可靠性，因为它能够直接检测到患者体内存在的HLA抗体。

通过这一测试，医生可以更加准确地评估患者和供体之间的HLA兼容性，以最大程度地减少排斥反应的发生。

标准双阶段微胞毒性HLA分型的优势不仅在于其准确性，还在于其相对简单的操作和结果解读。

虽然整个过程较为耗时，但是它是一种高效的方法，特别适用于通过细胞毒性方式进行HLA免疫分型的情况。

总结起来，标准双阶段微胞毒性HLA分型测试是一种常用的方法，通过观察供体和患者免疫细胞与特定HLA抗体的交互作用，以评估免疫系统中是否存在对供体HLA的抗体反应。

这种分型方法能够帮助医生确定最佳的供体选择，以最大限度地减少排斥反应的发生，提高移植手术的成功率。