苏云金杆菌δ―内毒素基因在大肠杆菌中的克隆及表达

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达蔡亚君;袁志明;胡晓敏;蔡全信【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2011(50)3【摘要】Chitinase gene chiAC (GenBank Accession Number:EF427670) was cloned by PCR from Bacillus thuringiensis T04A001 genomicDNA.Expression of chiAC under T7 promoter in Escherichia coli could induced by IPTG; and it produced a protein whose molecular weight was about 70 kDa.%从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670).置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物.【总页数】4页(P599-602)【作者】蔡亚君;袁志明;胡晓敏;蔡全信【作者单位】武汉纺织大学环境科学研究所,武汉,430073;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 [J], 宋光明;沈微;孙金凤;饶志明;方慧英;诸葛健;诸葛斌2.家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达 [J], 国果;吴建伟;吴沁怡;付萍;张勇3.苏云金芽孢杆菌分子伴侣基因p19的克隆和含有该基因的Bacillus thuringiensis表达载体的构建 [J], 曾少灵;余健秀;谢瑞瑜;蒙国基;谭乐;庞义4.菜豆几丁质酶基因Bchi的克隆及其在转基因烟草中的表达 [J], 王全伟;曲敏;张海玲;徐香玲5.几丁质酶基因和β-1.3-葡聚糖酶基因的克隆及双价基因在枯草芽胞杆菌B-908中的表达 [J], 王益民;唐文华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放
置会导致菌种衰退；
2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；
3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能
正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-­‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -­‐20℃保存（复溶液于 2-­‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-­‐10 年，应根据菌种状况及时转接
苏云金芽孢杆菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00380
苏云金芽孢杆菌
基 本 信 息 ： பைடு நூலகம்
名称：苏云金芽孢杆菌
规格：300ul 甘油菌
储存温度：-­‐80℃
基 因 组 ：
苏云金芽孢杆菌
简 介 ：
苏云金杆菌，简称 Bt,是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌。该菌可
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。

大肠杆菌克隆表达人类基因的注意事项大肠杆菌是常用的真核表达系统之一，具有优点如易于培养、遗传稳定和高表达水平等。

在进行大肠杆菌克隆表达人类基因的过程中，需要注意以下几个方面：1.选择合适的质粒载体：质粒载体是将目标基因插入宿主细胞中的工具。

选择具有致密复制位点和特定启动子的质粒，可以提高基因的稳定性和表达水平。

一般建议选择常用的表达载体，如pET系列、pGEX系列等。

2.制备合适的基因片段：将人类基因转入大肠杆菌前，需要利用PCR或其他方法从人类细胞中扩增得到基因片段。

合理设计引物，包含适当的启动子和终止子序列，避免产生GC丰富的片段，以免影响大肠杆菌的转化和表达效率。

3.优化启动子和终止子：为了提高目标基因的表达水平，可以选择合适的启动子和终止子来调控基因的转录和翻译。

常用的启动子包括T7、lac、trp等，终止子一般选择T7终止子。

4.确定正确的大肠杆菌菌株：大肠杆菌有多个常用的表达菌株，如BL21(DE3)、XL1-Blue、TOP10等。

根据实验要求选择合适的菌株，包括产蛋白质的溶解度、转化和表达效率、内毒素含量等因素。

5.优化诱导条件：为了获得最佳的基因表达效果，需要优化诱导条件。

常用的诱导剂有IPTG、Lactose等。

优化诱导时间、温度和诱导剂浓度等条件，可根据目标蛋白的特性进行调整。

6.加入相关辅助单元：在大肠杆菌中表达人类基因时，可能需要加入辅助单元，如信号肽序列、标签序列、分泌酶等。

信号肽序列可以帮助蛋白质定位和转运，标签序列如His-tag、GST-tag可以辅助蛋白质纯化和检测。

7.注意避免内毒素产生：大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其细胞壁含有内毒素。

内毒素可引起细胞毒性和炎症反应，影响目标蛋白的纯化和性质。

因此，在表达人类基因时，需要注意控制内毒素的产生，如选择低内毒素菌株、减少诱导剂的使用量等。

8.合理的蛋白质纯化策略：在成功表达目标蛋白后，需要进行蛋白质的纯化。

根据蛋白质的性质，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

到２００５年使生物农药使用量占到农药总量的３０％，２０１５年占到５０％。

目前，我国农药耗用量每年达１５０万吨以上，按此比例计算，２００５年需生物农药４５万吨，２０１５年达７５万吨。

而目前我国生物农药仅８０００吨，在农药总量中不到１％。

由此可见，生物农药具有很好的发展前景。

苏云金杆菌作为应用最广泛的生物农药，其发展潜力是可以预测的。

２苏云金杆菌的产生背景及发展１９叭年，德国南部一个叫苏云金的小城镇上，一家面粉加工厂发生了一件怪事，一种叫地中海粉螟的仓库害虫，平时粉蛾飞舞，幼虫在面粉中爬来爬去，这一天，有人发现那些小爬虫突然卷曲死ｌ二。

这件事弓ｆ起了生物学家贝尔内里的注意，经过无数次努力，贝尔内里从虫ｔｒ＿｜中分离出来这利，杆状细菌。

４年以后．克林诺发现．在细菌的芽孢形成不久，还会形成一些正方形或菱形的晶体，可惜这个发现来被重视。

１９５３年，汉纳证明了这种晶体是有赤的噩白晶体，粉螟幼虫自然死【＝＝的原因不吉臼明了。

这种细菌以发现的地方命名，叫嚣云金杆菌。

经过几十年的势力。

科学家们用实验证明苏云金杆菌可以防治鳞翅曰、膜翅日、直翅目、鞘翅目等１３０多种害虫。

３苏云金杆菌的杀虫机理苏云金杆菌杀虫作用的主要成分是孢子形成过程中产生的伴孢晶体（ＩｃＰｓ），它足单基因表达的产物”。

伴孢晶体经敏感昆虫口服后，在中肠碱性环境中，被降梓为活性的多肽片断（ＩｃＰ的毒性片断包含三个不同的结构域。

一般认为结构Ｉ参与孔道的形成．结构域ＩＩ决定毒素与受体的特异性结合。

结构域ＩＩＩ主要调节毒素的活性）”’，再与巾肠受体蛋白（陷锄）结合，形成细胞膜通道，破坏渗透膜，引起细胞溶解，展终导致虫体死亡。

ＩｃＰ的杀虫作用表现出种属专一性，然而，ＩｃＰ对敏感昆虫的特异性和毒力，除决定于菌株本身外，还决定于昆虫肠液对伴孢晶体的溶解和激活方式，幼虫中肠上皮细胞毒蛋白专一性受体的存在以及昆虫对ＢＴ的抗性“３。

目前，全世界拱分离到５００００株苏云金杆菌，分为６２种血清型和矩种。