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应用创造酶切位点法检测单碱基突变

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遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２５（３）：３２７￣３２９，２００３　技术与方法　

应用创造酶切位点法检测单碱基突变　

赵春江，李　宁，邓学梅　

（中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京１０００９４）　

摘要：应用引物错配技术结合单碱基突变位点而配合成一个酶切位点，使之成为可用ＰＣＲ－－ＲＦＬＰ方法分析的　

突变位点，是对单碱基突变位点进行基因型鉴定的有效而简捷的手段。本文以鸡胞外脂肪酸结合蛋白（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ—　

ａｒ　ｆａｔｔｖ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅｘ—ＦＡＢＰ）基因单碱基突变的基因型检测为例，探讨了应用创造酶切位点ＰＣＲ（Ｃｒｅ—　

ａｔｅｄ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｓｉｔｅ　ＰＣＲ，ＣＲＳ－－ＰＣＲ）检测单碱基突变基因型的思路、方法和策略。　

关键词：ＣＲＳ—ＰＣＲ；ＥＸ—ＦＡＢＰ基因；ＳＮＰ检测　中图分类号：Ｑ９５３　文献标识码：Ａ　文章编号：０２５３—９７７２（２００３）０２—０３２７—０３　

Ｔｈｅ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　

ＳＮＰ　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｂｙ　ＣＲＳ－－ＰＣＲ　

ＺＨＡＯ　Ｃｈｕｎ—Ｊｉａｎｇ，ＬＩ　Ｎｉｎｇ，ＤＥＮＧ　Ｘｕｅ—Ｍｅｉ　

（ＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＡｇｒｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｒｅａｔｅｄ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｓｉｔｅ　ＰＣＲ（ＣＲＳ—ＰＣＲ）ｉｓ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔＯ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ＳＮＰ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　ｂａｓｅｓ　ａｒｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｐｒｉｍｅｒ　ｔＯ　ｃｒｅａｔｅ　ａ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　ＳＮＰ　ｓｉｔｅ　ａｆｔｅｒ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ＣＲＳ　

ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｗａｙ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ＰＣＲ—ＲＦＬＰ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　

ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＸ—ＦＡＢＰ）ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｅｘａｍｐｌｅ　ｆｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＳ—ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｏｆ　ＣＲＳ—　

ＰＣＲ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＣＲＳ—ＰＣＲ；ＥＸ—ＦＡＢＰ　ｇｅｎｅ；ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ＳＮＰ　

单碱基突点是ＤＮＡ序列突变中常见的一种。人类基　

因组计划重要成果之一就是发现在人类基因序列中存在着　大量单碱基多态性（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，　

ＳＮＰ）［１　］。在家禽、家畜基因组内不少ＳＮＰ位点和动物的　

生产性状密切相关，通过对这些位点的检测可对动物的选种　育种提供大量的辅助信息。而对单碱基多态性位点的检测　

有赖于操作简便、结果明了的检测方法。较常见的单碱基多　

态性位点的检测方法包括测序、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ等方法。这些　

方法虽各有优点，但也各有其不足之处。测序可以直接测出　ＤＮＡ序列中的所有突变位点的碱基替代情况，但该方法需　

要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高；ＳＳＣＰ方法较为成　熟Ｌ３］，但操作繁琐，耗时长，结果易造成误判；ＰＣＲ—ＲＦＬＰ　

方法要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。创造酶切　

位点法（Ｃｒｅａｔｅｄ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｓｉｔｅ　ＰＣＲ，ＣＲＳ－－ＰＣＲ）是根据引　物碱基错配技术设计的检测单碱基突变的简单易行的方法。　

其原理是：根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计ＰＣＲ　

引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入　

错配碱基，使得引物３　端和单碱基突变的一种突变型在　

ＰＣＲ扩增后形成一个酶切位点，其ＰＣＲ产物可用类似ＰＣＲ　

ＲＦＬＰ（ＰＣＲ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）　

方法进行分析。由于这种方法应用了引物３　端错配技术，　

ＰＣＲ产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因　

此在实际运用中具有很大的灵活性，且检测方法简单易行，　

是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的较好方法。本文　

以与鸡腹脂积累密切相关的鸡胞外脂肪结合蛋白（Ｅｘｔｒａｃｅｌ—　

ｌｕａｒ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅｘ—ＦＡＢＰ）基因的单碱基突　变基因型［４　的检测为例，对ＣＲＳ—ＰＣＲ技术的方法和策略　

进行了探讨。　

收稿日期：２００２－－０６—１３：修回日期：２００２一Ｏ９一Ｏ５　作者简介：ｉｔ￣－￣Ｅ（１９７０一），男（汉族），中国农业大学生物学院博士后，研究方向：生物技术。Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｕｎｊｉａｎｇｚｈａｏ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ　通讯作者：李

宁（１９６２一），男，江西人，教授，博士生导师，专业：生物技术。Ｔｅ１：Ｏ１Ｏ一６２８９３３２３　维普资讯 http://www.cqvip.com ３２８　遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ　Ｂｅｉｊｉｎｇ）２ａ０３　２５卷　

过删序己知基因型的ＤＮＡ样品作为建立ＣＲＳ－－ＰＣＲ方法　１材料和方法　的标准参照　

１．１材　料　Ｉ．２方　法　

从肉鸡和乌骨鸡原代和Ｆ　代中提取血液ＤＮＡ，并用经　已知突变点邻近序列如下所示：　

Ｌ１Ｉ１ｌ　１　ｃ）ｕ０　Ａ基因　５’ＴＧＡＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧ．ＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣ　３　

Ｂ基因　５　ＴＧＡｃＡｃＡＧＧＧＴＴＧ　；ｌｒｔ　丁ｔ：ｃ　＾ＧｃＡｃｌｒｒＧＧｃＴｃＡＧＴＧＣＣＣＧＣ　３　其中．　＊”为单碱基囊变位点．融基替代情况为Ｔ／Ｃ｝“”为碱基缺戋处，Ｂ基因对Ａ基因有一ｃ的插人　

根据已知序列和上述序列的反向序列设计如下ＣＲＳ引物序列：　

ＣＲＳｔ　５　ＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ　３’　（一Ｉ１２０一一１ｔＯ０）　

ＣＲ　５　ＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＡＣＧＣ　３　（一１０１０一一９８９）　

其中．引物ＣＲＳ　３　端第二个碱基人为地由“Ａ　变为　

“Ｇ　．在ＰＣＲ扩增后．使之与多态性位点形成如下序列　

“ＧＣＧ（Ｃ／Ａ）”．其中“ＧＣＧＣ”为Ｈｈａｌ的酶切识别位点　这　

样．当甩ＣＲＳ－－ＰＣＲ引物扩增等位基因Ｂ时．在ＰＣＲ产物　

中就形成了可南Ｈｈａ］识别的酶切位点　ＰＣＲ产物用ＨｈａＩ　进行酶　后．Ｂ等位基因片段比Ａ等位基因片段小大约一个　

ＣＲＳ：引物的长度　酶切结果电泳后即可得到ＥＸ—　上ｌ尸　

的基因型鉴定结果　由于在ＰＣＲ所扩增的Ｅ　—ＦＡＢ尸基　

序列范围内另有一个Ｈｈａ１酶切识别位点．ＰＣＲ产物酶切　

后的情况如阿１所示：　

Ａ　目Ｉ一２３一　

《目Ｉ—　——　

图１　Ｅ　—ＦＡＢＰ　ｃＲｓ—ＰＣＲ产物Ｈｈａ　Ｉ酶切图　

苴巾．　▲”袁示所扩增序列内的酶圳位点　“●”表示多卷眭位点｝　

表　引物ｔ；ＲＳＩ；　一”表示引物ＣＲＳ２，　Ｆｉｇ．Ｉ　Ｔｈｅ　Ｈｈａ　Ｊ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｎｒ　Ｅ　—ｎ占Ｐ　ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＲＳ－－ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　

由圈ｌ可知．当基因型为＾‘４型时，酶田后可得到　

１０８ｂｐ、２３ｂｐ两条带型｛ＢＢ型有ｓ７ｂｐ、２３ｂｐ、２］ｂｐ　３荣带型；　

ＡＢ刚有１０８ｂｐ，８７ｂｐ、２３ｂｐ、２１ｈｐ　４条带型。　

ＰＣＲ条件为．９５℃５ｍｉｎ，３０循环×（９５℃３Ｉ）ｓ．６８℃３Ｏｓ．　

７２℃Ｉｒａｉｎ）．７２℃１Ｏｍｉｎ。ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ中Ｍｇ　的浓度为　

ｌ＿５ｍｍｏｌ／ｌ　＝取ＬＯｕＩ　ＰｃＲ产物．加入４Ｕ　ＨＪｌｎＩ酶四４ｈ　用４　

琼脂糖凝胶进行电泳．演化乙锭染色．在紫外灯下观察结果　

２结　粜　

图２为用Ｈｈａｌ酶切ＥＸ—Ｆ　ＢＰ基　ｃＲｓ　ＰＣＲ产物　

的电泳图。第一罚＝道为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ（质粒ＰＢＲ３２２用　

ＨａｅｌＩＩ酶切所制），第二泳道为ＢＢ基因型．在紫外ｌ光下清晰　

可见的为８７ｂｐ的带型；第ｉ泳道为ＡＢ基因型．清晰可见的　

为ｌＯ８ｂｐ、８７ｈｐ两十带型：第四泳道为ＡＡ基因型．清晰可见　

的为］０８ｈｐ的带型｛第五泳道为术经酶田的ＰＣＲ产物。因　

此．根据１０８ｂｐ和８７ｈｐ两条带型即可分辩出ＥＸ　ＦＡＢＰ基　

因在谈位点单碱基突变的３种基固型　料　

围２用Ｈｉｃａｌ酶切Ｆ　—ＦＡＢＰ基因　

ｃＲｓ—ＰＣＲ产物的电泳圈　

Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ＣＲＳ－－ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｂａａｄｓ　ｏｆ￡　—ＦＡＢＰ　

ｇｅｎｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｈａｌ

　维普资讯 http://www.cqvip.com ３期　赵春江等：应用创造酶切位点法检测单碱基突变　３２９　

用上述设计的ＣＲＳ—ＰＣＲ体系对２３只肉鸡和乌骨鸡杂　

交后代的ＤＮＡ样品进行鉴定，其结果如表１所示。　

表１　ＥＸ—ＦＡＢＰ基因频率和基因型频率　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＥＸ—ＦＡＢＰ　

３讨　论　

ＣＲＳ—ＰＣＲ是一种应用引物碱基错配技术结合单碱基　

多态性位点及其近旁序列而设计的一种检测单碱基突变型　

的简捷有效的手段。通过错配碱基的方法使引物３　端邻近　

的序列在ＰＣＲ扩增后与单碱基突变位点的一种基因型配合　

成一个酶切位点，从而使ＰＣＲ产物可用类似于ＰＣＲ—ＲＦＬＰ　

的方法进行基因型的鉴定。建立这一基因型检测方法的关　

键在于ＣＲＳ引物的设计。引物设计时应考虑到多态性位点　

邻近序列的情况、错配碱基的选择和扩增片段大小等几方面　

的因素。ＣＲＳ引物的选择余地较小，只能利用多态性位点的　

近旁序列。当邻近多态性位点的正向序列不适于作为引物　

序列时，可选择其反向序列作为引物，反之亦然。选择错配　

碱基时应注意碱基错配的类型和数量。有研究报道，当引物　

３，端序列与模板出现Ｇ—Ａ、Ｇ—Ｇ或Ｃ—Ｃ的碱基错配时对　

ＰＣＲ的扩增效率有显著的影响，在较严谨的ＰＣＲ条件下会　

致使引物无法延伸。而其它错配情况对ＰＣＲ扩增效率则无　显著影响『５］。此外，当３　端的错配碱基过多（超过３个时），　将严重影响ＰＣＲ的扩增效率　在设计ＣＲＳ引物的错配碱基　

时，还应考虑到所配合的酶切位点对应的限制性内切酶是否　

易购得、价格是否昂贵。应用ＣＲＳ—ＰＣＲ时所扩增的序列长　

度宜短。ＣＲＳ—ＰＣＲ产物酶切后，不同等位基因间片段的长　

段差异只有大约一个引物的长度（一般为２Ｏｂｐ～２５ｂｐ），如　

果扩增的长度较大，这样小的片段长度的差异在电泳时不易　

显示出来，将给基因型的判断带来很大不便。因此应用ＣＲＳ　

ＰＣＲ时，扩增的长度应在１００ｂｐ以内为好。　

参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：　

［１］Ｎｇ　Ｐ　Ｃ，Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　Ｓ．Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｐｒｅ—　ｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ａｆｆｅｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎＥＪ］．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，２００２，１２（３）：　

４３６～４４６．　Ｅ２］吴涛，曹佳，钱频，杨明杰．ＥＮＵ诱导带ＬａｃＺ靶基因的　ｋｇｔｌｌ　ＤＮＡ突变分子机理的初步研究ＥＪ］．遗传，１９９９，２１（１）：１９　

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引物设计原则及酶切位点选择和设计

引物设计原则及酶切位点选择和设计

引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的， 找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。只能切一个，酶都切不好。因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。我看 AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。

两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 的酶。最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1 以省钱。 的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。而不互补的区域对DNA这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。不少战友设计的引物都Tm非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。所以，设计引里了，最后的结果是导致了PCR基和酶切位点都计算到Tm以度以上（我喜欢控制在58Tm控制在55物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的，再加上酶切位点和保Tm）的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高上，具体根据PCR温度高的引物就Tm护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。的公式。2+43'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用比较容易克服3‘发卡、二聚体及，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点90 若你计算的Tm值达到了快个碱基，去3329、的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为多度，实际用的只7021个碱基。引物公司给的单子是掉酶切位点和保护碱基，分别为17、 55度扩的结果也差不多。有50度，用其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火 结果也还是令人满意。,温度．

takara快切酶酶切位点

takara快切酶酶切位点

takara快切酶酶切位点

Takara快切酶是一种用于分子生物学实验的酶，它能够识别特定的DNA序列并在该序列上进行切割。酶切位点是指酶在DNA分子上识别并切割的特定序列。Takara快切酶的切位点取决于具体使用的酶种类，不同的酶有不同的识别序列和切割方式。

从分子生物学角度来看，Takara快切酶的切位点是DNA双链上的特定序列，这些序列通常是4至8个碱基对长，具有特定的碱基配对规律。酶切位点的选择对于DNA分子的切割和连接至关重要，因为它直接影响着DNA重组、连接和修复的效率和准确性。

在实验操作中，研究人员需要根据所使用的Takara快切酶的特性来选择合适的切位点，以确保实验能够顺利进行。通常情况下，研究人员会根据酶的说明书或相关文献来确定切位点，然后设计合适的引物或寡核苷酸序列进行实验操作。

除此之外，Takara快切酶的切位点也与基因工程、基因编辑等领域密切相关。在基因编辑技术中，研究人员经常利用CRISPR/Cas9等系统来指导Takara快切酶在特定的DNA序列上进行切割，从而实现对基因组的精准编辑。

总的来说，Takara快切酶的切位点是分子生物学领域中非常重要的概念，它涉及到DNA序列的识别和切割，对于基因工程、基因编辑和分子生物学研究具有重要意义。在实验操作中，科研人员需要根据具体的实验目的和所用酶的特性来选择合适的切位点，并进行相关的实验设计和操作。

酶切位点的原理

酶切位点的原理

酶切位点的原理

酶切位点是指酶在DNA或RNA分子上识别和切割的特定位置。酶切位点的原理涉及到两个主要方面：酶的识别和酶的催化。

首先，酶能够识别和结合到特定的酶切位点是因为酶和DNA（或RNA）之间存在着特定的相互作用。这些相互作用可以是静电相互作用、氢键相互作用、范德华力等。这种相互作用使得酶能够识别出DNA或RNA分子上的特定序列，从而精确地识别并定位到酶切位点。

其次，酶的催化作用使得酶能够切割DNA或RNA分子。酶通常通过两种主要的方式参与催化反应：核酸酶活性和脱氧核酸酶活性。核酸酶活性指的是酶能够剪断两个核苷酸之间的磷酸二酯键。脱氧核酸酶活性指的则是酶能够剪断具有特定结构的DNA分子，如血清蛋白A测序等。

酶切位点的识别和切割原理可以通过以限制性内切酶为例进行解释。限制性内切酶是一种具有识别和切割特定DNA序列的酶。它可以在DNA分子中识别一段具有特定序列的碱基对，并在这个特定的序列上切割DNA链。

限制性内切酶的识别过程是通过酶与DNA序列之间的亲和力进行的。限制性内切酶通常识别的是具有对称性的DNA序列，即两个互补的DNA链具有相同的序列。例如，EcoRI酶可以识别序列为GAATTC的DNA，在这个序列处切割DNA链。

限制性内切酶的切割过程则是通过酶的催化活性来实现的。在切割过程中，限制性内切酶会将靠近酶切位点上的磷酸二酯键断裂，产生两个具有黏性末端的DNA片段。这些黏性末端具有一段未配对的碱基，能够与其他黏性末端互相结合，形成酶切位点原来的DNA分子。

限制性内切酶可根据切割产生的片段末端形式被分类为粘性末端酶和平滑末端酶。粘性末端酶产生的片段末端具有突出的单链末端，其中一条链长一截，而平滑末端酶产生的片段末端则是完整的双链末端。

酶切位点的原理在实验室中被广泛应用于许多分子生物学技术中，如PCR、DNA测序、基因克隆等。通过熟练地选择和使用限制性内切酶，可以精确地切割和定位DNA分子，从而开展基因组研究以及进行DNA分析。

医学分子生物学

医学分子生物学

重叠延伸PCR。(OE-PCR)这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除。其基本原理如图1所示。

首先设计两PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR

产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率。OE-PCR不足之处在于：一个突变需要两对引物，3次PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；由于DNA二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合，导致目的产物得率很低；当利用Taq聚合酶进行PCR反应时，经常在PCR产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生

非预期的移码突变。针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR进行了改进。1997年，URBAN等提出一步重叠延伸PCR法，使得三个PCR反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的DNA以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次PCR反应即可得到含突变的目的基因。1997年，WARRENS等J利用不对称PCR 反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。1990年，HORTON等用T4DNA聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。利用该方法实现定点突变的实例很多.MUKHOPADHYAY用该方法将’BAMH1限制性内切酶基因的第54位半胱氨酸用丙氨酸取代后提高了该酶的活性。