叶围微生物宏基因组文库的构建和分析

广西农业科学２００８年第３９卷第３期　・２６５・　叶围微生物宏基因组文库的构建和分析　周亚奎　，　陈旭玉　，　郑服丛　，２　（１．海南大学环境与植物保护学院，　海南儋州　５７１７３７；　２．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，　海南儋州５７１７３７）　

摘要：宏基因组文库技术是开发利用未培养微生物基因资源的有效途径。采用ＣＴＡＢ－ＳＤＳ法直接从植物叶面　沉积样品中提取基因组ＤＮＡ，构建了以ｐｕｃｌ９为载体的基因组文库，共获得８１２６个阳性克隆，文库ＤＮＡ总容量约　３０．１ＭＢ，平均插入片段长度为３．８ｋｂ。叶围微生物基因组文库的成功构建，对于以后研究植物和叶围微生物的关系　有重要意义。　关键词：叶围微生物；宏基因组文库；构建　中图分类号：Ｑ９３９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—８１６１（２００８｝０３—０２６５—０４　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｎ　ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ＺＨＯＵ　Ｙａ－ｋｕｉ　，ＣＨＥＮ　Ｘｕ—ｙｕ　，ＺＨＥＮＧ　Ｆｕ．ｅｏｎｇ　・　（１。Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ　５７３７１７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ　５７３７１７，Ｃｌａｉｍ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｉｅｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｇｅｎｅ　ｒｅｓｏＵｌＣ￣ｓ．Ｂｙ　ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＣＴＡＢ－ＳＤＳｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆｍｉｘｅｄｗｅｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｅｘｔｒａｃｔ—　ｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｅｄｉｍｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｌｅａｆ　ｓＨｌ￣ａｃｅ，Ｔｈｅ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｕｃｌ９　ａｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　８１２６　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　３０．１ＭＢ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｉｎｓｅｒｔ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　３．８ｋｂ．Ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ｗｏｕｌｄ　ｈａｖｅ　ｇｒｅａｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｎ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ｉｎ　ｆｕｔｕｒｅ，　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｅ；ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ　

植物叶围微生物的数量非常丰富，有益微生物　和有害微生物种群同时存在于植物体内外的微生物　群落中…１，它们与植物长期共同生存，组成了独特的　微生物群落，形成植物微生物生态体系。许多研究　证实，植物体内外的大量微生物与植物生长发育、植　物抗性密切相关【２Ｉ。　传统的研究微生物的方法是将微生物从环境中　分离，实验室培养和鉴定　．４Ｊ，但发现自然界中仅有　０．０１％～１０％的微生物可以培养【５Ｉ，这样造成了微　生物多样性的丢失。目前，通过宏基因组技术开发　环境中未培养微生物资源已有一定的研究　Ｊ，但　运用此技术研究叶围微生物的报道则较少。　本研究通过对叶面微生物进行收集，并对微生　物沉淀直接提取ＤＮＡ，部分酶切后和载体连接，成　功构建了叶围微生物基因组文库，并对文库中的部　分克隆子进行分析，为探索植物叶围微生物的研究　和利用奠定了基础。　

１材料和方法　１．１试验材料　１．１．１样品采集采集香蕉、龙眼、荔枝、芒果等果　树的叶片，用灭菌蒸馏水洗刷其表面附着的微生物，　

收稿日期：２００８　０３—１９　基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目（２００７ｈｚｓｊＯ１１）　作者简介：周亚奎（１９８１一），男，河南人，硕士研究生，主要从事分子植物病理学研究。＊为通迅作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｆｕｃｏｎｇ＠　１２６．ｃｏｍ。　

维普资讯 http://www.cqvip.com 广西农业科学２００８年第３９卷第３期　１６０００ｒ／ｍｉｎ离心收集沉淀。　１．１．２菌株和载体Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ和ｐｕｃｌ９均为本　实验室保存。　１．１．３主要试剂Ｐｓｔ　Ｉ等限制性内切酶和ＣＩＡＰ　（小牛碱性磷酸酶）购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔ４　ＤＮＡ连　接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。　１．２叶面微生物总ＤＮＡ的提取　①称取５ｇ沉淀于５０ｍＬ离心管，加入１８．５ｍＬ　ＳＩ）Ｓ裂解液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，０．１ｍｏｌ／Ｌ　Ｅ叽　，　４％ＳＤＳ）和１．５ｍＬ　５ｍｏｌ／Ｌ异硫氢酸肌，涡旋　１．５ｍｉｎ。　②６８℃温育１ｈ，每１０ｍｉｎ轻轻摇动１次，　１２０００ｒｐｍ离心１５ｒａｉｎ，将上清液移人５０ｍＬ干净的　离心管。　③加０．１２５倍体积的５　ｍｏｌ／Ｌ醋酸钾和０．４２　倍４０％ＰＥＧ８０００，低温（４＂Ｃ左右）下沉淀１ｈ，　１２０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ。　④加１８ｍＬ　２×　ｎ　（２％　ｎ姬，１．４　ｍｏｌ／Ｌ　Ｎａａ，０．１　ｍｏｌ／Ｌ　Ｅ叽　）中溶解沉淀，６８℃温育　２０ｍｉｎ（直到沉淀溶解），加等体积的氯仿／异戊醇　（２４：１），轻轻混匀，１２０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ。　⑤在ＤＮＡ上清液中加０．６～１．０倍体积的异丙　醇，一２０℃下放置２ｈ，１２０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ。　⑥７０％乙醇洗涤两次，晾干沉淀。　⑦加入５００／￣１　ＴＥＲ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－Ｃ／，ｌｍｍｏｌ／　ＬＥＤＴＡ，ＲＮａｓｅ　２０￣ｇ／ｒｎＬ）溶解ＤＮＡ，并用核酸蛋　白测定仪测其浓度，一２０＊（２保存备用　９。　１．３叶面微生物总ＤＮＡ的酶切　经过预实验确定最佳酶切体系和酶切时间。叶　面微生物总ＤＮＡ　ｌｔｚｇ，酶缓冲液２／Ａ，Ｐｓｔ　Ｉ酶２／Ａ，补　蒸馏水到总体积２０／Ａ；３７℃水浴５０ｍｉｎ（本研究所使　用时间）。　１．４载体的制备　构建Ｐｓｔ　Ｉ酶单酶切的ｐｕｃｌ９质粒，ＣＩＡＰ酶去　磷酸化后测其浓度，保存于一２０℃。　１．５叶面微生物基因组文库的构建和保存　首先用Ｐｓｔ　Ｉ对叶面微生物ＤＮＡ进行不完全酶　切，琼脂糖电泳分离酶切产物，　用ＯｉａｇｅｎＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ凝胶回收２～ｌＯｋｂ　ＤＮＡ片段，然后与　经ＣＩＡＰ去磷酸化酶处理过的ｐｕｃｌ９质粒ＤＮＡ以　合适的比例连接，连接产物用热击转化导人Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ，涂布在含有Ｘ－Ｇａｌ／＇ＩＰＴＧ／Ａｍｐ的ＬＢ平板　上。３７℃倒置培养１２～１６ｈ，置于４℃冰箱３ｈ，待菌　落充分显色。挑取白色菌落至含有ＬＢ培养基（Ａｍｐ　１００ｔ￣ｇ／ｍＬ）的９６孔培养板中，３７℃恒温培养２４ｈ　左右，加入等体积４０％甘油，编号并保存于　８０℃。　１．６文库的质量检测　从ＬＢ平板上随机挑取１００个白色菌落液体培　养，用碱裂解法提取质粒，酶切、电泳鉴定插入片段　的大小。随机抽出１５个阳言克隆进行测序，将序列　递交到ＧｅｎＢａｎｋ，通过Ｂｌａｓｔｘ进行同源性分析。　

２结果和分析　２．１　叶面微生物ＤＮＡ的提取和纯化　利用本方法提取的叶面微生物ＤＮＡ的完整性　较好，长度较长，每克样品可获得１－－５ｔｚｇ　ＤＮＡ。电　泳结果显示（图１），提取ＤＮＡ片段大于２３ｋｂ，满足　建库要求。　

（Ｍ：Ｍａｋｅｒ，Ｘ－Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　ｄｉｇｅｓｔ；１－５：叶围微生物ＤＮＡ）　图１叶围微生物总ＤＮＡ的提取　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｐｈｙＨｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｅ　

２．２文库的检测　评价一个环境微生物基因组文库质量的好坏主　要从以下３个方面考虑：文库的库容量、插入片段的　大小、文库中基因的多样性。　本试验样品采白海南农场，提取ＤＮＡ酶切　后用ｐｕｃｌ９载体构建基因组文库，一次转化共得　到８１２６个阳性克隆子，随机挑取１Ｏ０个白色克　隆子，提取质粒酶切电泳检测，８５个有插入片　段，重组率为８５％，大部分插入片段在２ｋｂ以上　

维普资讯 http://www.cqvip.com 周亚奎等：叶围微生物宏基因组文库的构建和分析　・２６７・　（图２），最大插入片段达到９ｋｂ，最小插入片段　约０．６ｋｂ，平均插入片段３．８ｋｂ。若每克样品所　提取的ＤＮＡ全部转化，可得到约１５００００个阳　性克隆，按此比例文库容量可达到０　５７ＧＢ。因　

为这些材料取材于果树、橡胶等作物的健康叶　片，很有可能从中筛选出针对这些作物病害的抗　性基因。　

Ｍ　置　２　３　４　５　ｌ６　７　８　９　ｌ　ｏ　ｉｌ　ｌ２　ｌ３　ｌ４　ｌ５　重６　Ｏ　Ｍ　

（Ｍ：Ｍａｋｅｒ右，　一Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　ｄｉｇｅｓｔ；Ｍａｋｅｒ左，２００ｂｐ　ＤＮＡＬａｄｄｅｒ　Ｍａｋｅｒ；０：ｐｕｃｌ９；１￣１６：克隆子检测）　图２宏基因组文库的检测　Ｆｉｇ．２　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　

２．３文库部分克隆的测序分析　随机从文库中挑出ｌ５个克隆进行测序，通过　Ｂｌａｓｔｘ分析发现片段中有未报道的序列。其中６号　混合样品与Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｌｕｓｔｒｉｓ有６７％的　同源性，而Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｌｕｓｔｒｉｓ是具有生物　修复功能的光合细菌。近年来，水产养殖病害频繁　发生，水体富营养化，水产品失去固有的鲜味而带有　土腥味，海洋赤潮多发，给水产养殖业造成严重损　失。因此，水产养殖环境的净化已成为水产养殖业　生产持续发展的关键技术，具有生物修复功能的光　合细菌等菌种已成为研究的热点ｌ１０　３。另外和　ＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄＯ？ＴＺＯｎａＳ　ｐａｌｕｓｔｒｉｓ有同源性的还有１号和　５号混合样品。１号混合样品的部分序列和　Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ　ｔｅｐｉｄｕｍ有７ｌ％的同源性，Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ　ｔｅｐｉｄｕｍ是一种光合细菌，依靠硫化物将大气中的二　氧化碳转化为产生能量的分子，且能不通过光合作　用产生氧气，这种不同寻常的光合作用机制已引起　能源学家的重视【¨』。２号混合样品的部分序列和　Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ有７４％的同源性，现在已知伯克霍尔　德菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）ＣＦ一６６株能够抑制若干植物病　原霉菌和病原酵母菌，并且显示了广谱抗菌活　性ｌ１２Ｊ。３号混合样品和Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ的８７５　个序列中的６４１个序列相同，同源性达到了７３％。４　号混合样品和Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ的部分序　列有８４％的同源性。５号混合样品和Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ的部分序列有７０％的同源性，７号混　合样品与Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ有７７％的同源性，８号混合样　品和Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ有７２％的同源性。　３讨论　在自然界中，绝大多数微生物在现有的技术条　件下是不可培养的，传统的研究方法不可避免的造　成了微生物多样性的丢失，而利用宏基因组技术可　以尽可能的反映环境微生物的完整性。目前，利用　宏基因组技术已成功获得了许多新的基因［１３￣１７］。　但是宏基因组文库的建立有一定难度，一个好的基　因组文库要求文库的容量大、插入片段大、文库中基　因的多样性要好。首先要得到较高质量的环境微生　物总ＤＮＡ，而叶围微生物较其它环境微生物的种类　和数量要少得多，对提取高质量的ＤＮＡ有一定的难　度。　本研究采用改进的ＣＴＡＢ—ＳＤＳ、高盐法，直接　从植物叶面沉积样品中提取和分离混合基因组　ＤＮＡ。从电泳图片中可以看出，分离的ＤＮＡ条带大　于２３ｋｂ，接近４０ｋｂ，尽可能地保证了基因的完整性，　最大程度的反映植物叶围微生物的真实性，为建立　一个高质量的文库确立了基础。　从测序结果来看，发现很多未报道的序列，这体　现了宏基因组技术的优势，后期的工作就是要通过　合适的筛选方法来找到我们需要的基因序列。值得