发酵菜粕各种物质的测定方法

1.硫甙含量的测定 1. 原理 硫甙与钯可形成深棕色复合物，此复合物为胶状沉淀物，加入分散剂羧甲基纤维素钠溶液，使复合物变成溶胶清液，进行分光光度测定，可计算硫甙含量。 2. 试剂和溶液 （1）氯化钯（PdCl2）显色液：称取177 mg氯化钯于200 mL烧杯中，加入2 mol/L HCl 2 mL和蒸馏水20 mL加热溶解后以蒸馏水稀释至250 mL。（4mmol/L PdCl2

）

（2）0.1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液：称取1 g羧甲基纤维素钠放入少量水中，搅拌成浆状，加热至完全溶解后，加水同时搅拌至1000 mL，必要时加热溶解，放置过夜，倾出上层清夜备用。 3. 测定方法 称取100 mg装入10 mL试管中，在沸水浴中干热10 min，加入约90℃热蒸馏水8 mL -10 mL，再置沸水浴中20 min以上，冷却后，蒸馏水稀释，混匀，放置20 min，用滤纸过滤或者4000 r/min，5 min。移取2 mL滤液于10 mL刻度试管中，加4 mL羧甲基纤维素钠，再移入2 mL PbCl2，放置1 h，摇匀。在540 nm下，以PbCl2加入蒸馏水做参比测定吸光度E1。 再分别取滤液2 mL于另一带塞的10 mL试管中，加入羧甲基纤维素钠4 mL，0.03 mol/L HCl 2 mL，在室温下放置2 h，以蒸馏水加羧甲基纤维素钠做空白，测定吸光值E2。计算公式为E=E1-E2。最终的计算公式为： 硫甙含量（μmol/g）=0.2+185.2E，

%100%处理前菜粕硫甙含量处理后菜粕硫甙含量处理前菜粕硫甙含量）硫甙降解率（

2. 粗蛋白含量的测定 采用凯氏定氮法，具体方法参见GB 6432-94。

3． 硫甙分解产物ITC和OZT的测定 1. 原理 菜粕中的硫甙在pH=7的条件下，可被芥子酶水解生成异硫氰酸酯（ITC），带有羟基的ITC在极性溶剂中可自动环化成恶唑烷硫酮（OZT），ITC与氨作用生成的硫脲和OZT在紫外区245 nm处有最大吸收量。 2. 试剂和溶液 （1）芥子酶：取外购袋装白芥子碾碎后装入滤纸包中，置索氏抽提器中，加无水乙醚浸过滤包，浸泡12 h，在50℃-60℃水浴锅中回流抽提6 h -8 h提取脂肪。每小时要回流10次左右。取出滤包风干，等乙醚挥发后，在40℃恒温箱中干燥2 h，碾成粉并过60目筛，装入带塞三角瓶中，贮存于干燥器中备用。10 g经过索氏提取仪脱脂后的芥菜籽粉末，加入30 mL预冷的蒸馏水，于4℃下提取1 h，每隔15 min搅拌一次。而后在4000 r/min下离心10 min，取上清夜加入等体积预冷乙醇，放入冰箱中1 h，离心收集沉淀，用70%冰乙醇洗涤沉淀2次，离心得到粗酶。等乙醇挥发后，加入pH=7的缓冲液30 mL，重新溶解为粗酶液，放冰箱保存。 （2）pH=7磷酸-柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L柠檬酸溶液分别为16.5 mL和3.5 mL混合） （3）二氯甲烷、95%乙醇、20%氨性乙醇（1 体积氨水加4 体积无水乙醇） 3. 产物的测定：取烘干样200 mg，放于10 mL离心管中，每管加入2 mL粗酶液，轻摇匀于40℃保温2 h；加入5 mL二氯甲烷，充分提取毒素1 h，4000 r/min下离心20 min。用100 μL 微量注射器抽取最下层含有酶解产物异硫氰酸酯的二氯甲烷吸收液两份：一份加入事先装有6.0 mL 95%乙醇溶液的10 mL 磨口试管中，一份加入装有20%氨水的乙醇溶液试管中，将两试管加塞密闭并置于50℃恒温水浴锅中反应2 h，反应结束后冷却，然后分别以100 μL二氯甲烷加6.0 mL 20%氨水乙醇溶液和100 μL二氯甲烷加6.0 mL 95%乙醇溶液作空白，用紫外分光光度计分别测定ITC和OZT在235 nm、245 nm、255 nm波长处的光密度（OD）。再按下列公式计算出硫甙的含量： 硫甙= OZT + ITC（mg/g） OZT = OD245校×22. 1（mg/g） ITC = OD245校×28. 55（mg/g） 其中OD245校= OD245-（OD235 + OD255）/ 2 注意点：（1）菜粕要过80目筛（2）pH=7.0的缓冲液配制要准确（3）加热时要把样品先放到温度不高的水浴中缓慢加热（4）维持反应体系密闭稳定

4. 单宁的测定 1. 原理 采用经典的Folin-Denis法，原理为单宁类物质在碱性条件下能与Folin-Denis试剂发生反应而生成蓝色的复合物。根据显色的强弱，确定单宁的含量。 2. 试剂和溶液 （1）焦没食子酸、甲醇 （2）Folin-Dennis试剂：钨酸钠100 g、磷钼酸20 g溶于200 mL水中，加入磷酸50 mL，加热回流2 h，冷却后，稀释至1 L。 （3）饱和碳酸钠 3. 测定方法 （1）标准溶液的配制：称0.025 g焦没食子酸标准品于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。此标准浓度为1.0 mg/mL。分别吸取标准液0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL配制成浓度为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL和0.10 mg/mL的备用液。 绘制标准曲线：吸取各浓度的标准液0.5 mL，于10 mL比色管中，加入0.5 mL Folin-Denis显色剂，摇动1 min，加入饱和Na2CO3 1 mL，用水定容到10 mL刻度，室温放置1 h，于760 nm处测定比色值，并绘制标准曲线。 （2）样品中单宁的提取：1 g菜粕加入20 mL 70%乙醇（pH=2，用HCl调），在40℃浸提40 min，而后3000 r/min 离心10 min，取1 mL稀释到25 mL，取0.5 mL待测。 （3）样品中单宁的测定：取提取液0.5 mL，加入10 mL比色管中，加入7 mL H2O，0.5 mL Folin显色剂，剧烈振荡3 min后，1 mL饱和Na2CO3，充分混和，用水定容至10 mL刻度，放置1 h。在760 nm处测定比色值，再参照标准曲线，得到准确的含量。

5. 小肽含量的测定 1. 原理 三氯乙酸（TCA）可以去除酸不溶性的蛋白和长链肽沉淀。余下的蛋白为低分子量的小肽类物质和氨基酸。 2. 测定方法：将待测样品过80目筛，等体积加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min下30 min，而后4000 r/min离心15 min，取上清液做适当稀释后用Folin-酚法测定蛋白质总量。

%100%处理前的小肽含量处理前的小肽含量处理后的小肽含量）小肽含量提高率（

6． Folin-酚法（lorry法）测定蛋白质总量 1. 原理 蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色。在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比。 2. 试剂 （1）甲液：A、B液的混合物，A液50份，B液1份。A液为10g Ma2CO3，2g NaOH和0.25 g酒石酸钾钠，定容到500 mL；B液为0.5 g CuSO4定容到100 mL。 （2）Folin-酚试剂 3. 测定方法 （1）标准曲线的制作：在分析天平上精确称取0.0250 g结晶牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后转入100 mL容量瓶中，配成250 μg/mL的牛血清白蛋白溶液。按一定的比例配成蛋白质含量为0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL，总体积为1 mL的溶液。各加入5 mL甲试剂，混合后室温下放置10 min，再各加入0.5 mL乙溶液，立即混匀。30 min后，以不含蛋白质的溶液做对照，在650 nm处测定各溶液的吸光度，做出标准曲线。 （2）样品的测定：同标准曲线。

7. 纤维素酶活的测定方法

7.1 CMC-Na酶活的测定 1. 菌种活化： 平板筛选得到菌种在各自合适斜面上30℃培养24 h 2. 粗酶的制备： 活化的菌种接1环到酶活测定培养基，30℃、160 r/min培养3 d测定。取10 mL培养液在4000 r/min离心15 min得粗酶液。 3. 酶活测定： （1）标准曲线的制作：取7支10 mL比色管编号，按表2.2分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至10 mL，加塞后颠倒摇匀，在分光光度计上比色。以0为零点，以光密度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，画出标准曲线。 （2）CMC-Na酶活测定：取粗酶液0.25 mL于3支试管中，放入40℃预热5 min， 同时将底物预热5 min，分别向两支样品管中加入0.75 mL底物，向空白中加入0.75 mL DNS试剂，准确计时反应10 min取出。向两支试管中加入0.75 mL DNS，于空白中加入0.75 mL底物，摇匀后同时放入沸水浴中，反应5 min，迅速冷却后，加至10 mL，加塞混匀。以空白为参比，在分光540 nm处比色（底物为1%CMC-Na溶液）。酶活的定义为：每分钟催化水解底物产生1 μmol葡萄糖的酶量为1个酶活单位。