我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断
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第３２卷第１期 ２０ｌ０年１月 中国预防兽医学报
Ｃｈｉｌ１ｅｓｅ ＪＯｕｍａｌ ｏｆ ＰｒｅｖｅｎｔｉＶｅ Ｖｅｔｅ ａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏ１．３２．Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２０１０
我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断 冉智光 ，谢建华 ，骆璐 ，杨泽林 ，凌洪权 ，苏承忠－，熊仲良 ，范伟兴 ，米自由 （１．重庆市动物疫病预防控制中心，重庆渝北４０ｌ１２０；２．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛２６６Ｏ３２）
摘要：重庆等４省市从外省引进的肉牛群发生以严重肺炎和关节炎为主要表现的疾病。该病的病变主要集 中于肺脏，其组织学变化主要是间质增生，纤维素渗出，干酪样坏死，淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞浸 润。ＰｃＲ检测病牛肺脏显示牛支原体阳性，而丝状支原体丝状亚种、牛分支杆茵和多杀性巴氏杆菌为阴性。从肺 等组织中分离到牛支原体以及大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌和烟曲霉，没有分离到巴氏杆菌。结果显 示本病是以牛支原体感染为主引起的牛支原体肺炎和关节炎，长途运输等应激因素是该病突发的重要诱因，其他 细菌和／或真菌继发感染加重了病情。 关键词：牛支原体；肺炎；关节炎；ＰｃＲ；细菌分离 中图分类号：Ｓ８５２．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０５８９（２０１０）０１．００４０．０４
ＥｔｉＯＩＯｇｉｃａＩ ｄｉａｇｎＯｓｉｓ Ｏｆ Ｍ ，ａｓｍａ ６０ ｐｎｅｕｍＯｎｉａ ａｎｄ ａｒ－ｔｈ ｒｉｔｉＳ ｉｎ ＳＯｍｅ ｐｒＯＶｉｎＣｅＳ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
ＲＡＮ Ｚｈｉ－ｇｕａｎｇ ，Ｘ正Ｊｉａｎ＿ｈｕａ ，ＬＵＯ Ｌｕ ，ＹＡＮＧ ｚｅ—ｌ ＬＩＮＧ Ｈｏｎｇ－ｑｕａｎ ， ｓｕ ｃｈｅｎｇ—Ｚ１１０ｎｇ ，ⅪＯＮＧ ｚｈｏｎｇ—ｌｉａｎｇ ，ＦＡＮ ｗｅｉ＿ｘｉｎ ，ＭＩ ｚｉ—ｙｏｕ。‘ （１．Ｃｈ０ｎ鹊ｉｎｇ Ｃｃｎｔｅｒ ｆ０ｒ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎ仃Ｄｌ ａｎｄ ＰｒｅＶｅｎｔｉ０ｎ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４Ｏ１ １２Ｏ，Ｃｈｉｎａ； ２．ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａ１ Ｈｅａｌｔｈ ａＩｌｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｑｉｎｇｄａ０ ２６６０３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｓｅｖｅｒｅ ｐｎｅ啪ｏｎｉａ ａｎｄ ａｒｔ ｔｉｓ ｅｍｅｒｇｅｄ ｉｎ ｃａｌｖｅ ｈｅｒｄｓ ｉｎ仃０ｄｕｃｅｄ怕ｍ ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ ｔｏ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ａｎｄ ｏｍｅｒ ｍｒｅｅ ｐｍＶｉｎｃｅｓ．Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｌｅｓｉｏｎｓ ｐｒｉｍａｒｉ１ｙ ｉｎ ｔｌｌｅ １ｕｎｇｓ，ｗｉｔｈ ｈｊｓｔｏｐａｍｏ１ｏ ｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｍａｎｉｆｅｓｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ， 五ｂｒｉｎ ｅｘｕｄａｔｉｏｎ，ｃａｓｅｏｕｓ ｎｅｃｍｓｉｓ，ａｎｄ １ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｕ仃１）ｐｈｉｌｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｆｉｌ仃ａｔｉｏｎ．ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｌ１ａｔ ｔｈｅ ａｆｆ ｃｔｅｄ ｌｕｎｇｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉ廿Ｖｅ ｆｏｒ ＭｙｃｏｐＪａ姗ａ ｂ０ ｓ ｂｕｔ ｎｅｇａｔｉＶｅ ｆ０ｒ Ｍｙｃｏｐ王ａ湖ａ埘ｙｃ０ ｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｌｙｃ０ ｓ，＾ ＿ｙｃ０ｂａｃ把ｄ啪ｂ０ ａｌ１ｄ Ｐａｓ ｕｒｅＪＪａ埘ｕＪ幻ｃ ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｍｌｙｃ０ｐＪａ跚ａ ｂ０ ，Ｅ．ｃ０Ⅱ，ｓａＪ埘ｏｎｅＪＪａ，Ｓ唧 ｃ０ｃｃｕｓ，Ｓ妞ｐ＾ｙＪ０ｃ０ｃｃｕｓ ａｎｄ Ａ ｅ哂Ｊｊｕｓ ｊｇａ加ｓ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆＩｌｌｌｙ ｉｓＯｌａｔｅｄ ＤｍⅡｌｅ ｌｕｎｇｓ ａｎｄ Ｏｔｌｌｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｈＯｗｅＶｅｒ，ｎＯ Ｐａｓ ＬⅡ Ｊ丑ｗａｓ ｉｓＯｌａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕ１ｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｍａｔ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｐｒｉｍａｒｉ１ｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ＾ｄｒｙｃ叩ｈｓｍａ ｂ０体，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｌｏｎｇ—ｄｉｓｔａｎｃｅ ｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｏｍｅｒ ｓ仃＿ｅｓｓ ｆａｃｔｏｒｓ；ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ／ｏｒ如ｎｇｕｓ ｄｅｔｅｒｉＯｍｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＭｙｃＤｐＪａｓ加ａ ｂ０ｖ西ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；ａｎ ｔｉｓ；ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
２００９年４月以来，重庆等省市从省外引进的肉 用牛群发生以呼吸道症状为主的传染病，主要表现 为体温升高（３９℃～４０．５℃），咳嗽，气喘，鼻流粘 液性或粘液脓性分泌物，关节肿大，跛行或不能站 立。气管、支气管内有干酪样分泌物或乳白色泡 幸ＣＯｒｒｅｓｐＯｎｄｉｎｇ ａｕｔｈＯｒ 沫，胸腔、心包积液，纤维蛋白性渗出，胸肺、膈 肺粘连，肺脏质地变硬，表面有大小不等灰白（黄） 色干酪样或化脓性坏死灶，切面呈干酪状，偶见白 色脓肿。发病率２０％～８０％以上，死亡率５％～ ２３．５％；在不治疗的情况下，死亡率可达５０％以
收稿日期：２００９—１０．０１ 基金项目：重庆市科技攻关项目（２ｏ０９Ａｃｌ１ ｌ１）
作者简介：冉智光（１９７１一），男，重庆酉阳人，博士，高级兽医师，主要从事动物传染病诊断及病原生物学研究 通信作者：Ｅ＿ｍａｉＩ：ｍｉｚｉｙ０ｕｌ１１＠ｌ６３．ｃｏｍ； ｓｊｌ＠１２６．ｃｏｍ 第1期冉智光，等．我国部分地区牛肺炎和关节炎的病原学诊断4l
上。我们进行了一系列实验室检测，诊断
该病是以
牛支原体(Mycoplasmabovis)感染为主引起的疾病
。
现将结果报告如下
。
1材料和方法
1．1样品采集自4个省市5个肉牛场
表现较重
呼吸道和关节炎症状病牛的肺、肝、脾、肾、淋
巴
结及渗出液等。
1．2
培养基PPLO、血清肉汤、血清大豆
胰酶肉
汤、马丁肉汤、营养平板、血清平板、血清TSB、
鲜血平板
、麦康凯、EMB、HE、DHL
、SS、TSI
等
培养基分别购自BD公司和杭州天和公司的冻干
粉
，
按说明书或常规方法配制而成
。
1．3病理组织学检查以多聚甲醛固定肺组织24h
～48
h
，石蜡切片，H．E．染色，显微镜检
。
1．4病料直接PCR检测将肺脏常规处理后，提
取DNA，分别以丝状支原体丝状亚种…、牛支原
体[
21
、
多杀性巴氏杆菌『3]、牛结核分枝杆菌[。
l特
异性
引物进
行PCR扩增
。
1．5
细菌分离鉴定取肺、肝、脾、肾、淋巴结及
渗出液常规方法无菌接种各种增菌培养基
、分离培
养基和鉴别培养基于37℃自然空气或5％CO
：培养，挑纯培养单菌落进行革兰氏染色、镜检。1．6真菌分离培养取病料无菌接种沙堡琼脂平板37℃培养1d～5d，蘸取少量菌落与生理盐水制成涂片，显微镜检。1-7支原体分离鉴定取肺等组织无菌接种以PP—LO为基础的支原体液体筛选培养基和固体培养基，37℃5％CO：培养3d～5d，每天观察液体培养基的颜色变化，放大镜或显微镜下观察固体培养基上的菌落生长情况。对培养物以牛支原体特异性引物[2】和16SrRNA基因引物㈣进行PCR扩增，并进行序列测定和分析。2结果2．1病理组织学检查结果肺脏的组织学变化主要表现为间质增生，肺泡间隔增宽和结构破坏，细支气管内炎性渗出；干酪样坏死灶内含大量嗜酸性细胞碎屑，周围淋巴细胞以及少量嗜中性粒细胞和单核细胞浸润，结缔组织增生形成纤维化(图1)，呈卡他性支气管炎、坏死性化脓性支气管肺炎和纤维素性坏死性肺炎的特征。图1肺脏病理组织学变化(H．E．染色，100x)Fig．1Histopathologicaleha~sinlungtissuesofafectedcattles(H，E100×)2．2PCR检测结果5个牛场的肺组织，仅有牛支原体特异性引物扩增出预期大小(1912bp)的片段(图2)；丝状支原体丝状亚种、多杀性巴氏杆菌和牛分枝杆菌特异性引物的扩增结果均为阴性。1234567000bp500bp1：Negativecontrol；26：Samplesfrom5caalefarms；7：DNAMarker图2肺组织牛支原体特异性引物PCR结果Fig．2ThePCRassayfromlungtissueswiththeprimersspecificforMycoplasmab0Vfs2．3细菌分离结果从肺脏等组织中分离到大肠杆菌(E．coli)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Strep—tOCOCCUS)、
链球菌(Staphylococcus)(表1)
，
所有病料
中均未分离到巴氏杆菌。表1细菌分离结果
Table1Theb
acteriaisolationfromafecte
d
cattles
1#E．coli，Staphylococcuslung
，
liverkidney
2#E．coli，Streptococcuslung，liverkidney，lymp
honod
e
3#Streptococcuslung
4#S
almonellalung
5#E．coli．Salmonella．Staphylococcuslunglymph
onode
2．4真菌分离结果
从
1例肺脏分离到真菌，其菌
落生长迅速，呈绒状或絮状，培养时间
长后，中间
呈暗烟绿色。挑培养物少许与生理盐水制成涂片、
镜检，可见大量球形孢子，分生孢子
头呈短柱状
。
经菌落特征和显微形态比对判断为烟曲霉。
2．5
支原体分离结果肺组织无菌接种后96h左
右，液体培养基
变黄
，轻微浑浊；固体培
养基
长出
细小菌落，显微
镜下呈“煎蛋样
”
(图3)
。3
个分离
株(Y1、T1、T3)16SrRNA全基因序列BLAST
结果
显示与
GenB
ank
中登录的牛支原体的同源性为99％
～100％
，
与无乳支原体的同源性为98％～99％
，
与丝状支原体的同源
性只有81％左右
，而
3
个分离
