红景天苷对全脑缺血再灌注大鼠皮层nNOS及核酸的影响

第１６卷第６期　Ｖｏ１．１６　Ｎｏ．６　２００７年１１月　ＮＯＶ．２ｏｏ７　武警医学院学报　Ａｃｔａ　Ａｃａｄｅｍｉａｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｅ　ＣＰＡＰＦ　・６０７・　

篝　誊　

红景天苷对全脑缺血再灌注大鼠皮层ｎＮＯＳ及核酸的影响　

宋月英，韩慧文，何瑞波，何文彤，齐　刚　

（武警医学院中心实验室，天津３００１６２）　

摘要：　【目的】探讨红景天苷（ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ）对全脑缺血再灌注（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ＣＩＲ）大鼠大脑皮层　

一氧化氮合酶（ｎｉｔｒｉｃ　ＯＸｉｄｅ　ｓｖｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）及核酸表达的影响。【方法】用改良的Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ　４－血管阻断（４．ＶＯ）法，　复制大鼠急性全脑缺血（３０　ｍｉｎ）再灌注（６０　ｍｉｎ）损伤模型。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶（ＮＡＤＰＨｄ）组化　染色法检测神经元型一氧化氮合酶（ｎＮＯＳ），吖啶橙（ＡＯ）染色观察ＤＮＡ、ＲＮＡ的变化。【结果】ＣＩＲ模型组大鼠　脑内ｎＮＯＳ表达增加，ＤＮＡ和ＲＮＡ荧光强度（反映ＤＮＡ和ＲＮＡ含量）明显减弱。灌胃给予红景天苷后可抑制　ＣＩＲ大鼠大脑皮层ｎＮＯＳ的表达，ＤＮＡ和ＲＮＡ荧光强度增强。【结论】红景天苷可抑制ＣＩＲ导致的大鼠大脑皮　

层ｎＮＯＳ的表达，对ＤＮＡ和ＲＮＡ有保护作用。　关键词：红景天苷；脑缺血再灌注；一氧化氮合酶；核酸；皮层　【文章编号】　１００８．５０４１（２００７）０６．０６０７．０３　【中图分类号】　Ｒ９３１．７　【文献标识码】　Ａ　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　

ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　

ＳＯＮＧ　Ｙｕｅ－ｙｉｎｇ，ＨＡＮ　Ｈｕｉ－ｗｅｎ，ＨＥ　Ｒｕｉ－ｂｏ，ＨＥ　Ｗｅｎ－ｔｏｎｇ，ＱＩ　Ｇａｎｇ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　－　ｎｅｓｅ　Ｐｅｏｐｌｅ　Ｓ　Ａｒｍｅｄ　Ｐｏｌｉｃｅ　Ｆｏｒｃｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１６２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏ卜　ｔｅｘ　ｏｆａｃｕｔｅ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（ＣＩＲ）ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ　ｓ　４－ｖｅｓｓｅｌ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　（４－ＶＯ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｅｔ　ｕｐ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－（３０　ｍｉｎ）ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（６０　ｍｉｎ）．ｎＮＯＳ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＮＡＤＰＨｄ　ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ａｃｒｉｄｉｎｅ　ｏｒａｎｇｅ（ＡＯ）ｍｅｔｈ—　ｏｄ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ．　【Ｒｅｓｕｌｔｓ】　ｎＮＯＳ　ｅｘｉｔｌｒｅｓｓｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　

ｔｈｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　ｏｆ　ＣＩＲ　ｒａｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ａｆｔｅｒ　３０　ｍｉｎ　ｏｆ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ａｎｄ　６０　ｍｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｕｆｕｓｉｏｎ．Ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｎＮＯＳ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｒｅｆｌｅｘ—　ｉｎｇ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ）Ｗａｓ　ｕｎｃｌｅａｒ　ａｎｄ　ｗｅａｋｅｒ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　ｏｆ　ＣＩＲ　ｒａｔｓ，ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ　ａｄｍｉｎｉｓ—　ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｓｔｒａｉｎ　ｔｈｅ　ｃｕｔ—ｏｆｆ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｃｈａｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｗａｓ　ｃｌｅａｒ　Ｗａｓ　ｅｎ—　ｈａｎｃｅｄ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】Ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｉｎ　ＣＩＲ　ｉｎｊｕｒｅｄ　ｒａｔｓ．ａｎｄ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏ—　ｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｒｅｌｉｅｖｅｓ　ｔｈｅ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ；Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ；Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；Ｃｅｒｅｂｒａ　ｃｏｒｔｅｘ　

一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）作为一种重要的神　

经递质，参与了缺血性神经元损害。ＮＯ含量的增　高与其唯一限速酶ＮＯＳ的活性增高有　，因此　

脑缺血后脑组织内ＮＯＳ活性增高是ＮＯ水平增高　

【收稿日期】２００６—１１—０３；【修回日期】２００７一叭一ｏ４　【作者简介】宋月英（１９６０一），女，籍贯北京市，高级实验师，从　事中药抗脑缺血的研究。　的决定因素。另有试验研究证明，脑缺血后不仅发　

生神经细胞的坏死，在缺血区周围，由于受损较轻　

及侧支循环的建立，可产生ＤＮＡ损伤及诱导凋　

亡。本实验在大鼠大脑４一血管阻断所致的ＣＩＲ模　

型中，观察红景天苷对ＣＩＲ损伤大鼠皮层ＮＯＳ、　

ＤＮＡ和ＲＮＡ的保护作用，旨在探讨红景天苷对　

ＣＩ

Ｒ导致大鼠脑神经细胞损伤的保护作用，为临床　维普资讯 http://www.cqvip.com 武警医学院学报　Ａｃｔａ　Ａｃａｄｅｍｉａｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｅ　ＣＰＡＰＦ　第１６卷第６期２００７年１１月　Ｖ　０１．１６　Ｎｏ．６　ＮＯＶ．２ｏ０７　

脑缺血防治以及红景天的开发利用提供理论依据。　

１材料与方法　

１．１材料　

１．１．１实验动物与分组：选用健康成年Ｗｉｓｔａｒ雄　

性大鼠３６只，动物等级二级，体质量２５０　２８０　ｇ，　

由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：　

ＳＣＸＫ－（军）第２００２．００１号，在恒温条件下进行饲　

养，自由饮水和进食。将动物随机分为３组，每组　

１２只。模型组：按给药组相同体积每日蒸馏水灌　

胃。对照组：按给药组相同体积每日蒸馏水灌胃。　

红景天苷组：红景天苷４０　Ｉｌｌｇ・（ｋｇ・ｄ）　灌胃。　

１．１．２试剂与仪器：红景天苷由华东理工大学生　

物反应器工程国家重点实验室生物分离研究室提　

供；　还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（１３．还　

原型辅酶Ⅱ，Ｊ３．ｒｅｄｕｃｅｄ　ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅ．　

ｏｔｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｌ３．ＮＡＤＰＨ）由ｓｉｇｍａ公司提供；硝　

基四氮唑蓝（ＮＢＴ）由上海前进化学试剂厂出品；　

吖啶橙荧光染色试剂盒由天津医科大学组胚教研室　

许屏教授提供；其它试剂均为市售分析纯。德国莱　

卡公司１８５０型恒冷箱冰冻切片机；日本Ｎｉｋｏｎ　Ｕ　

Ⅲ荧光显微镜等。　

１．１．３模型制备：大鼠ＣＩＲ损伤模型（４．ＶＯ）的制　备＿２］：上述分组动物分别按剂量连续给药７　ｄ后制　

备动物模型。取大鼠ｉｐ戊巴比妥钠４０　ｍｇ／ｋｇ麻醉固　

定后，切开颈部皮肤，分离椎旁肌，暴露第一颈椎　

翼状孔，电灼烧凝固双侧椎动脉。切开腹侧颈中皮　

肤，分离双侧颈总动脉，用动脉夹夹闭３０　ｍｉｎ，取　

下动脉夹，再灌注６０　ｍｉｎ后行灌注固定并取材切　

片。其中对照组同法手术，但不灼烧椎动脉，不夹　

闭颈总动脉。　

１．２检测方法　

１．２．１　ＮＡＤＰＨ．ｄ组化染色：４．ＶＯ模型大鼠以戊　

巴比妥钠（４０　ｍｇ／ｋｇ　ｉｐ）经腹腔麻醉后，开胸经左心　

室插管至升主动脉，快速依次灌注３７℃生理盐水　

１００—１５０　ｍｌ，４％多聚甲醛５００　ｍｌ（４　ｏＣ），迅速取　

脑，置４℃４％多聚甲醛固定液中固定６　ｈ后，依　

次以１５％蔗糖浸泡４　ｈ；３０％蔗糖过夜将其予以脱　

水，以恒冷箱冰冻切片机切片（片厚５０　ｍ），　

ＤＨ７．４的０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ接片、漂洗１０　ｍｉｎ，２　次，加入含０．５　ｍｇ／ｍｌ　ＮＢＴ和１．０　ｍｇ／ｍｌ　ｌ３－ＮＡＤ－　

ＰＨ的反应液中，３７℃孵育６０　ｍｉｎ，终止染色，蒸　馏水充分漂洗后裱片、自然风干，常规透明、封　

片，镜检。　

１．２．２吖啶橙染色：取材、切片同上。将冰冻切　

片直接帖裱于载玻片上，蒸馏水洗数秒，按试剂盒　

说明予以染色。在荧光显微镜下观察、拍照。　

１．２．３　ｎＮＯＳ阳性神经元计数：半定量观察：每　组选取对应断面的脑片３０张，计数皮层ｎＮＯＳ阳　

性神经元。ＮＯＳ阳性神经元数目可半定量反映神　

经元内ＮＯＳ活性。　

１．３统计学处理　

应用ＳＰＳＳ１１．０统计软件进行ＬＳＤ方差分析，　数据以均数４－标准差（　４－Ｓ）表示。Ｐ＜０．０５为差　

异有显著性意义。　

２结果　

２．１对照组大鼠皮层ｎＮＯＳ的表达及ＤＮＡ和　

ＲＮＡ染色结果　

对照组大鼠皮层内ｎＮＯＳ阳性神经元染色较　深，神经纤维较长（图１Ａ，见封二）。荧光显微镜　

下，对照组鼠脑皮层ＤＮＡ和ＲＮＡ呈橙黄色，均　

匀分布于大脑皮层的细胞层，荧光反射边界清晰，　

反应强度较强（图２Ａ，见封二）。　

２．２模型组大鼠皮层ｎＮＯＳ的表达及ＤＮＡ和　

ＲＮＡ染色结果　模型组神经纤维变短，染色无明显改变（图　

１Ｂ，见封二），ｎＮＯＳ阳性神经元数目增加（Ｐ＜　

０．０１），见表１。荧光显微镜下，模型组鼠脑皮层　

ＤＮＡ和ＲＮＡ荧光反射边界不清，与正常对照组比　

较反应强度明显减弱（图２Ｂ，见封二）。　

２．３红景天苷组大鼠皮层ｎＮＯＳ的表达及ＤＮＡ　

和ＲＮＡ染色结果　

红景天苷组大鼠皮层ｎＮＯＳ阳性神经元的形　

态、分布，神经纤维长度与对照组基本相同（图　

１Ｃ，见封二），而神经元数目较模型组明显增多（Ｐ　

＜０．００１），见表１。荧光显微镜下，红景天苷鼠脑　

皮层ＤＮＡ和ＲＮＡ分布均匀，荧光反射边界清晰，　

反应强度较模型组明显增强（图２ｃ，见封二），与　

对照组表达分布基本相同。

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